根癌农杆菌对枳壳遗传转化的影响因素

目的：建立一套根癌农杆菌转化枳壳的有效方法,为枳壳新品种选育、引入外源基因奠定基础。方法：以枳壳实生苗的上胚轴为材料,农杆菌菌株为ＥＨＡ１０１,含质粒载体ＰＧＡ４８２ＧＧ,质粒上插入了ＧＵＳ,ＮＰＴⅡ基因。结果：２０ｄ苗龄的外植体转化再生率较高;其感染前先进行２ｄ预培养,对转化有一定促进作用;外植体与农杆菌共培养时间以２～３ｄ为宜;乙酰丁香酮能较大提高转化效率,转化再生频率达２７．５％;外植体与农杆菌共培养后延迟２ｄ选择,抗性芽发生率有所提高。结论：通过探讨根癌农杆菌对枳壳遗传转化的影响因素,获得较高的转化再生频率,建立了有效的转化再生系统。     

根癌农杆菌介导sHSP基因对半夏的遗传转化

目的:建立高效的半夏遗传转化体系.方法:以半夏试管苗的叶柄为外植体,采用根癌农杆菌介导法,探索了酚类物质、农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养时间及共培养时间等对半夏遗传转化效率的影响.结果与结论:不经过预培养阶段,用含AS 40 mg·L-1的根癌农杆菌菌液侵染15 min后共培养3d时可有效提高遗传转化效率.将转化后的叶柄接到含有100 mg·L-1 Kan和350 mg·L-1Carb的分化培养基上进行筛选培养,30 d左右在叶柄的两端分化出抗性的试管小块茎.对抗性转化植株进行Gus染色和PCR检测,结果表明外源基因sHSP已经整合到半夏基因组中.     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ.根癌农杆菌介导的转基因菘蓝

目的：将外源半夏凝集素基因（PTA）转入四倍体菘蓝以获得鳞翅目昆虫抗性。方法：构建了以CaMV 35S为启动子，新霉素磷酸转移酶（Npt-Ⅱ）为选择标记，带有半夏凝集素基因PTA的pCAMB I A2200植物双元表达载体，应用根癌农杆菌EHA 105遗传转化四倍体菘蓝。结果：菘 外植体植株再生率达到95％以上，转化率有10％。结论：建立了以6－BA和NAA为主要激素组合的四倍体菘蓝离体分化再生系统和农杆菌介导的转化系统。     

根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T—DNA对云南红豆杉原生质体的转化，分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料，经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3．0mg／L2，4-D、0．1mg／LKT和0．45mol／L果糖组成的培养基中培养1周后，原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化，但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T—DNA转化，高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成，转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力，但不同转化系中紫杉醇含量变异很大，最高含量为0．076％，是对照愈伤组织的6倍，表明T—DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低，但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求，但研究通过T—DNA对原生质体的转化而实现插入诱变，可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

根癌农杆菌对云南红豆杉原生质体的转化

本文介绍了根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体的转化,分析了转化系的紫杉醇合成能力。实验以生长20 d的云南红豆杉幼茎诱导的淡黄色愈伤组织为材料,经酶解可分离出大量有活力的原生质体。在由B5无机盐、KM有机成分、3.0 mg/L 2,4-D、0.1mg/L KT和0.45 mol/L果糖组成的培养基中培养1周后,原生质体再生细胞持续分裂形成细胞团。根癌农杆菌对原生质体的转化能力与原生质体生长状态及菌株相关。虽然刚分离的或已再生细胞壁的原生质体不能被根癌农杆菌转化,但由10个以上细胞组成的原生质体克隆和根癌农杆菌B6S3菌株共培养后可实现T-DNA转化,高压纸电泳检测转化系具有冠瘿碱的合成,转化率约为5％。HPLC证实转化系具有合成紫杉醇的能力,但不同转化系中紫杉醇含量变异很大,最高含量为0.076％,是对照愈伤组织的6倍,表明T-DNA的插入改变了培养细胞对紫杉醇的合成。获得的高产转化系细胞生长比对照低,但继代培养中其生长和紫杉醇积累基本保持稳定。尽管转化系合成紫杉醇能力远未达到商业化生产的要求,但研究通过T-DNA对原生质体的转化而实现插入诱变,可以为分离高产紫杉醇优良细胞系提供单细胞筛选系统。     

农杆菌介导枳壳转化系统的建立及PCR鉴定

目的：建立农杆菌介导的枳壳转化体系。方法：以枳壳实生苗上胚轴为转化体外植体，农杆菌Ti质粒上插入了外源目的基因--柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因（CTV-cp），转化植株用GUS（β-葡萄苷酸酶）染色及PCR进行鉴定。结果：枳壳转化试验中，20d苗龄的外植体转化再生率较高；外植体与农杆菌共培养时间以2-3d为宜；乙酰丁香酮能较大提高转化效率，转化再生频率为27.5％。转化获得的抗性植株中，GUS反应呈阳性所占比例为70.0％。PCR分析证实外源目的基因已速合到枳壳转化株的核基因组中。结论：成功地建立了农杆菌介导的枳壳转化系统，为利用基因工程的手段进行枳壳的抗病育种奠定了基础。     

农杆菌介导鱼腥草遗传转化的主要影响因素

目的：研究鱼腥草遗传转化的影响因素,以提高转化效率,获得转基因植株。方法：通过分析GUS报告基因的瞬时表达和外植体愈伤分化情况比较菌株质粒组合、菌液浓度、侵染时间、预培养时间、共培养时间、抗生素种类和浓度等因素对转化的影响,应用PCR和Southern blot技术鉴定转基因植株基因组中的外源基因。结果：菌液浓度A600为0.3、26℃侵染15min条件下侵染,添加乙酰丁香酮有利于转化,适宜的预培养时间和共培养时间与菌株/质粒组合有关,农杆菌LBA4404/pBI121优于EHA105/pCAMBIA1305.2组合。经条件优化,转化外植体的GUS染色阳性率在60%～80%之间,经鉴定外源基因已整合到转基因鱼腥草基因组中。结论：通过影响因素的优化研究,获得了鱼腥草转基因植株,为培育鱼腥草基因工程新品种奠定了基础。     

农杆菌介导的药用植物的转化

目的 :介绍农杆菌转化药用植物的概况。方法 :从外植体选择、转化的证实、转基因组织和器官培养生产次生物质、转基因植物的获得等方面棕述了农杆菌转化药用植物的概况 ,重点论述毛状根和冠瘿组织培养生产次生物质的研究进展。结果 :利用转基因组织和器官培养能生产多种次生物质 ,通过农杆菌介导的转化可获得转基因药用植物。结论 :农杆菌介导的转化在药用植物基因工程方面应用广泛 ,意义重大。     

怀区地黄遗传多样性的ISSR鉴定

目的利用ISSR标记技术对怀区地黄的8个品种和2个茎尖培养脱毒系进行了遗传多样性分析。方法用44条ISSR引物进行初选，然后用其中适合的10个ISSR引物进行ISSR分析。结果10条ISSR引物共扩增出110条带。基于这些条带，用SPSS10.0软件分析，建立了遗传Jaccard相关系数矩阵，构建了分子树状图，将怀区地黄的8个品种和2个组培系分为2类：其中一类群含有6个材料，包括组培85．5、大田85．5、组培9302、大田9302、金状元和金白地黄；另一类群含有4个材料，包括北京1号、大红袍、地黄9104和野生地黄。而且主成分分析结果支持上述的聚类分析结果；用POPGENE32软件分析知，多态性指数为0．3775，有效等位基因数为1．4037，多态性比率为71.82％；用一个ISSR6引物建立了10个供试地黄样品的DNA指纹图谱并且能将其彼此区分出来。结论ISSR标记适合于构建怀区地黄的DNA指纹图谱、品种鉴定和遗传多样性分析。     

巴戟天离体再生及农杆菌介导的遗传转化

目的 :在巴戟天离体再生的基础上 ,建立一套根癌农杆菌转化的有效方法 ,为巴戟天新品种选育、引入外源目的基因奠定基础。方法 :以巴戟天带节茎为材料 ,农杆菌菌株为EHA101,含有质粒载体pGA482GG ,质粒上插入了GUS、NPTⅡ基因。结果 :MT基本培养基附加BA 1mg·L^-1,外植体出芽率最高 (97.8%) ,BA浓度升高 ,出芽率下降。外植体在培养基上的接种方式 ,以竖放为好 ,出芽所需的时间短且出芽率高。根的诱导 ,以MT附加 0.2～0.5mg·L^-1NAA效果较好 ,生根率可达 80.0%以上。巴戟天带节茎进行遗传转化 ,卡那霉素作为选择试剂 ,浓度为 50mg·L^-1。头孢霉素用作抑菌剂 ,浓度为 300mg·L^-1。经感染的外植体 ,在选择培养基上筛选 1.5个月后 ,抗性芽发生率为 14.8% ,GUS基因表达检测结果 ,抗性植株中 ,GUS反应呈阳性所占比例为 22.2%。结论 :通过探讨巴戟天的离体培养及根癌农杆菌介导的遗传转化 ,获得了较高的离体再生频率 ,建立了有效的遗传转化系统。     

怀地黄药材HPLC指纹图谱研究

目的: 建立怀地黄药材的HPLC指纹图谱,为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法。 方法: 采用HPLC梯度洗脱法,对怀地黄药材进行测定,色谱条件,Dikma DiamonsilC₁₈柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）,乙腈-0.1%磷酸水系统梯度洗脱,流速1.0 mL·min^-1,柱温35℃,检测波长205 nm。 结果: 标定了13个共有峰,建立了HPLC指纹图谱,该图谱的相关系数均在0.99以上。 结论: 该方法精确可靠,重复性好,可为控制怀地黄药材内在质量提供科学依据。     

地黄地上部分中一个新苯甲醛类化合物

运用各种色谱技术对玄参科地黄属植物地黄的地上部分进行分离纯化,从中分离得到7个化合物,根据理化性质和波谱数据分别鉴定为3-hydroxy-4-(4-(2-hydroxyethyl)phenoxy)benzaldehyde(1),异香草酸(isovanillic acid,2),邻苯二酚(pyrocatechol,3),glutinosalactone A(4),金圣草黄素(chrysoeriol,5),芹菜素(apigenin,6),木犀草素(luteolin,7),其中化合物1为新化合物.     

地黄中介体亚基基因RgMed6的分离与表达特性

目的克隆地黄中介体亚基基因Rg Med6,分析其编码的蛋白序列特征和基因表达特性。方法利用地黄转录组数据库进行同源比对,获得拟南芥Med6的同源基因片段,通过序列拼接获得RgM ed6的全长开放阅读框(ORF),在NCBI上进行BLASTp获得RgM ed6的同源蛋白,用MAFFT进行多序列联配,应用MEGA 6.0构建系统进化树,以实时荧光定量PCR技术检测Rg Med6在地黄不同组织以及逆境胁迫下的相对表达量。结果获得1条924 bp的c DNA序列,包含1个771bp的完整ORF,编码256个氨基酸,具有Med6蛋白的典型结构域和1个潜在的核定位信号序列。Rg Med6在检测的5个地黄组织(器官)中均有表达,其中在地黄叶片里表达强度最大,其次为花蕾,在茎中表达量最低。在连作地黄块根中RgM ed6的表达量降低,Na Cl胁迫处理下Rg Med6的表达量升高。结论首次克隆了地黄中介体亚基基因Rg Med6,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础。     

地黄HPLC指纹图谱及梓醇含量测定的研究

目的采用HPLC色谱法建立地黄指纹图谱,优化梓醇含量的测定方法,为地黄药材质量标准的提升提供依据。方法选用Atlantis T3-特色硅胶C18色谱柱,流动相为0.1%磷酸水-乙腈,检测波长为203 nm,体积流量1.0 mL/mL,柱温为35℃,梓醇为对照峰,建立20批地黄指纹图谱。采用指纹图谱相似度评价软件进行数据评价,同法测定20批地黄中梓醇的含量。结果所建立的标准对照指纹图谱,20批地黄的相似度均在0.917以上,20批地黄中梓醇质量分数均在0.2%以上。结论建立的地黄HPLC指纹图谱测定方法,重复性、精密度和稳定性良好,梓醇含量测定符合要求,可有效避免《中国药典》2015年版收载方法检测时糖类物质的干扰,为提升地黄药材质量评价水平提供科学参考。     

地黄栽培历史及其品种考证

目的：考证地黄的栽培历史以及品种记载。方法：查阅古今文献。结果：除部分本草书籍对地黄的记载与目前不一致外，多数记载应为玄参科植物地黄。地黄的栽培历史可追溯到1000多年以前，当时就有块根膨大的类型，并开始了人工栽培。由于长期的栽培，选育了许多优良品种，有文献记载的品种多达50余个，但对品种的描述过于简单，严重影响了品种的识别和应用。结论：地黄栽培历史悠久，种质资源丰富，可能是造成有关中药质量不稳定的原因之一。因此急需对其进行系统地收集、整理和保存研究，为成分分析、活性筛选和临床应用奠定基础。同时建议在进行相关研究时，应高度重视取样的一致性；在进行GAP基地建设时，应选择优良品种。     

地黄地上部分化学成分的研究

利用各种色谱技术对地黄地上部分的化学成分进行研究,从地黄地上部分水提取物大孔树脂70%乙醇洗脱物中分离得到6个化合物,分别为(+)-(7S, 8S, 8'S)-9-O-[β-D-glucopyranoyl] asarininone(1),2α,3β,19α,23-tetrahydroxy-olean-12-en-28-oic acid(2),7,3'-二羟基-5'-甲氧基异黄酮(3),野菰酸(4),corchorifattty acid B(5),pinellic acid(6)。其中,化合物 1 为新天然产物,化合物 2,3,5 均为首次从地黄属植物中分离得到。采用MTT法对分离得到的化合物进行体外抗肿瘤实验,结果表明在10 mg·L^-1的质量浓度下,化合物 1~6 对BEL-7402和HCT-8均没有显著的抑制增殖作用。     

地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析

酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶,在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。根据地黄转录组数据,克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列(GenBank登录号KU640395),并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。结果表明,RgTyDC ORF为1 619 bp,编码509个氨基酸,相对分子质量为56.6 kDa,等电点pI 6.25。RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高,均为88%。RgTyDC基因在叶片(尤其是衰老的叶片)中表达量较强,在块根中表达量较低。SA和MeJA处理后显著上调表达。这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。     

鲜地黄的闪式提取工艺优选

目的:优选鲜地黄的闪式提取工艺。方法:以梓醇及干膏得量为评价指标,选取提取时间、提取次数及溶剂用量为考察因素,通过单因素试验及正交试验优选闪式提取工艺。采用RP-HPLC测定指标成分含量。结果:最佳闪式提取工艺为加3倍量95%乙醇提取1次,提取时间3 min。结论:优选的工艺快速、合理。     

不同品种地黄中毛蕊花糖苷的动态积累规律变化

目的:对大田生长期间不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量进行测定,研究道地产区不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷的积累规律。方法:以栽培地黄85-5,北京1号,沁怀,金九和白选为材料,于2015年和2016年在河南温县大田栽培,以HPLC检测不同采收期不同品种地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷的含量。并以85-5为材料,于2014年进行遮阴处理,以HPLC检测遮阴后地黄块根和叶片中的毛蕊花糖苷含量。结果:不同品种地黄块根和叶片中毛蕊花糖苷含量有较大差异,块根中毛蕊花糖苷含量较高的2个品种是白选和沁怀,两年内毛蕊花糖苷含量变化分别为0.023%~0.620%和0.018%~0.796%;叶片中毛蕊花糖苷含量较高的品种为85-5和北京1号,毛蕊花糖苷含量变化分别为1.955%~5.968%和0.681%~5.941%。不同发育阶段的地黄叶片中,展开叶和衰老叶较幼嫩叶含有较高的毛蕊花糖苷。遮阴对地黄块根中毛蕊花糖苷含量有促进作用,对叶片中毛蕊花糖苷含量有抑制效应。结论:该研究为毛蕊花糖苷高含量地黄新品种的选育提供实验材料和依据,同时也为明确地黄毛蕊花糖苷积累变化的分子机制奠定基础。     

地黄化学成分和药理作用的研究进展

地黄Rehmannia glutinosa为我国民间传统植物药,有着久远的历史记载,主产于河南、河北、陕西、山西等地.其化学成分类型主要包括环烯醚萜类、紫罗兰酮类、苯乙醇苷类、三萜类、黄酮类及糖类等,对人体血液系统、心脑血管系统、中枢神经系统和免疫系统有显著作用.随着现代分离分析手段的不断创新,加之现代科学技术与药理学...