二苯乙烯苷对肾虚大鼠MSCs增殖及旁分泌的影响

目的 观察何首乌主要成分二苯乙烯苷(THSG)对去卵巢肾虚大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖及旁分泌细胞因子mRNA的影响。方法 切除SD雌性大鼠双侧卵巢复制肾虚大鼠模型,密度梯度离心法收集各组大鼠MSCs进行体外培养,观察THSG对大鼠第3代MSCs增殖及旁分泌细胞因子mRNA的影响。结果 模型组大鼠第3代MSCs增殖的OD值明显低于正常组(P ＜ 0.05,P ＜ 0.01),THSG组明显高于模型组(P ＜ 0.05)。模型组MSCs表达粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、骨形成蛋白-2(BMP-2)mRNA明显低于正常组(P ＜ 0.05);THSG组MSCs表达G-CSF mRNA明显高于模型组(P ＜ 0.05)。结论 与正常大鼠比较,去卵巢大鼠MSCs增殖能力减弱,可能与其MSCs旁分泌GM-CSF、LIF、G-CSF、BMP-2 mRNA减少有关。THSG改善去卵巢肾虚大鼠MSCs增殖能力,可能与其促进MSCs表达G-CSF mRNA有关。     

左归丸对SD大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:观察不同浓度左归丸水提液对体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖的影响。方法:应用全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs,并传代扩增,采用倒置显微镜进行细胞形态学观察,免疫组化检测细胞表面抗原鉴定其表面标志。将BMSCs分为对照组及不同浓度左归丸干预组,采用MTT比色法观察不同浓度左归丸水提液干预后BMSCs增殖的情况。结果:采用全骨髓贴壁法获取的BMSCs形态以长梭形为主,呈集落样生长。体外培养的BMSCs免疫组织化学鉴定显示CD44,CD29呈阳性表达,CD34呈阴性表达。MTT检测结果显示,与空白对照组相比,相当于生药质量浓度2.5～4 g·L-1的左归丸水提液干预24 h后,干预组吸光度均明显增高(P<0.01),而与其他浓度相比1 g·L-1时左归丸水提液促进BMSCs增殖的作用最强。结论:所培养的大鼠骨髓基质细胞在细胞表型表达和细胞形态上具备BMSC特征。左归丸水提液在一定浓度范围内可以提高BMSCs的体外增殖能力。     

左归丸对衰老大鼠骨髓MSC形态学影响的研究

目的研究补肾益精代表方左归丸对衰老大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)形态学方面的影响。方法通过腹腔注射D-半乳糖造模,制备衰老大鼠模型,分离培养骨髓MSC。光镜观察各组大鼠MSC一般形态学特征,电镜观察其超微结构特点。结果光镜观察模型组P3代大鼠骨髓MSCs呈现衰老细胞形态学特征,左归丸组大鼠BMSCs的细胞形态与正常组相近。透射电镜观察显示,模型组大鼠P3代骨髓MSCs细胞内结构改变呈现衰老特征,左归丸中剂量组大鼠的骨髓MSCs电镜下的超微结构与正常组最相近。结论衰老大鼠骨髓MSCs的细胞形态各方面表现有明显改变,左归丸水提液在一定浓度范围内能延缓大鼠骨髓MSCs的衰老。     

葛根素对SD大鼠MSCs增殖及骨向分化的影响

目的:观察葛根素(Puerarin,Pue)对骨髓间充质干细胞(Marrow pluripotent stromal stem cells,MSCs)增殖和向成骨细胞(Osteoblasts,OB)分化的影响,从干细胞的角度探讨中药防治骨质疏松的可能机制和影响途径。方法:成功建立MSCs培养体系,取第三代SD大鼠MSCs,随机分为三组:空白组、不同浓度的Pue组、经典诱导组,通过MTT比色法及流式细胞仪技术,ALP染色技术观察Pue对MSCs增殖及向OB分化的影响。结果:通过对生长曲线的绘制,对多向诱导分化能力检测,及对表面抗原中CD29、CD44表达阳性,CD45表达阴性的检测,说明成功建立MSCs体外培养体系。经MTT比色法检测显示,10~(-7)mol/L、10~(-8)mol/L Pue与空白组对比具有促进MSCs增殖的作用,具有统计学意义。ALP染色阳性细胞表达率显示,10~(-6)mol/L Pue与空白组相比具有确定的诱导MSCs向OB分化的作用,说明Pue可以促进MSCs向OB分化。结论:葛根素具有促进体外培养MSCs增殖及向OB分化的能力。     

左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导的影响

目的:研究左归丸、右归丸及其拆方对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMSCs)成脂诱导的影响,并探讨其相关的作用机制。方法:将90只SD雌性大鼠,随机选取10只作为正常组,其余80只再随机选取10只经双侧腰背部切口切除卵巢周围少量脂肪组织作为假手术组,其余70只以相同切口切除双侧卵巢作为模型组,分别以正常组,假手术组,模型组,左归丸组(18.9 g·kg~(-1)),右归丸组(20.52 g·kg~(-1)),共同药组(15.12 g·kg~(-1)),滋阴药组(12.96 g·kg~(-1)),补阳药组(8.1 g·kg~(-1))和戊酸雌二醇片组(0.36 mg·kg~(-1))共9组,对BMSCs进行干预,流式细胞仪鉴定BMSCs,用油红O检测脂滴的形成;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ),脂蛋白脂肪酶(lipoprotein,LPL),脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)mRNA的表达;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)法检测CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)蛋白的表达。结果:与正常组比较,模型组BMSCs明显向脂肪细胞分化,PPARγ,LPL,FABP4 mRNA表达及C/EBPβ蛋白的表达明显升高(P0.05);与模型组比较,左归丸、右归丸及其拆方均可抑制BMSCs向脂肪细胞分化,其中右归丸组可明显下调PPARγ,LPL,FABP4 mRNA,降低C/EBPβ的蛋白的表达(P0.05)。结论:左归丸、右归丸及其拆方均能抑制BMSCs的成脂分化,且右归丸抑制成脂分化的作用优于左归丸,以及补阳药及二者的共同药组。     

左归丸对间充质干细胞向软骨细胞分化过程中Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响

目的观察左归丸含药血清对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向软骨细胞定向分化过程中MSCs增殖、Ⅱ型胶原及蛋白多糖基因表达的影响。方法分离培养大鼠MSCs,体外诱导其向软骨细胞分化,诱导同时分别以高（57 g/kg）、中（28.5 g/kg）、低（9.5 g/kg）浓度左归丸含药血清及大鼠空白血清刺激细胞。CCK-8法检测各组对MSCs增殖的影响。将第3代MSCs分为空白对照组（加入大鼠空白血清）、诱导对照组（加入诱导液及大鼠空白血清）及左归丸含药血清组（加入诱导液及中浓度左归丸含药血清）,采用RT-PCR、免疫组织化学和Real-time PCR检测诱导分化软骨细胞中Ⅱ型胶原和蛋白多糖的表达。结果与空白对照组比较,不同浓度左归丸含药血清均能促进MSCs增殖（P〈0.05）,其中以中浓度组最为明显（P〈0.05）。诱导第21天RT-PCR和免疫组织化学显示诱导对照组和左归丸含药血清组MSCs中均可见Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达,其中左归丸含药血清组中Ⅱ型胶原mRNA表达明显高于诱导对照组。Real-time PCR结果显示,诱导第21天左归丸含药血清组蛋白多糖mRNA相对表达定量分别约是第7、14天表达量的16倍和3倍（P〈0.05）,并明显高于同期诱导对照组（P〈0.05）。结论左归丸含药血清能促进MSCs增殖、Ⅱ型胶原和蛋白多糖基因表达,可能是其软骨保护作用的分子基础之一。     

左归丸对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞多时相基因共表达网络的调控研究

目的:探索左归丸调控绝经后骨质疏松症的基因共表达靶点。方法:72只雌性大鼠,随机分为假手术组、模型组、雌激素组和左归丸组,每组18只,除假手术组外,其余均摘除双侧卵巢。术后每组又随机分为4、8和12周三个小组,每小组6只大鼠。术后第14天起雌激素组和左归丸组分别以戊酸雌二醇和左归丸灌胃,剂量分别为0.1mg/kg和5g/kg,假手术组和模型组以生理盐水灌胃,连续至手术后第4、8和12周末。第12周末取大鼠第4⁶腰椎及单侧股骨、胫骨行骨密度测定以验证模型成功与否并评价中西药疗效。第4、8和12周末分离股骨和胫骨,全骨髓贴壁法培养并纯化骨髓间充质干细胞。Trizol提取细胞总RNA并制备表达谱芯片。SPSS18.0软件筛选三个时间点模型组-假手术组、雌激素组-模型组和左归丸组-模型组比较之差异基因(阈值:P<0.05,差异倍数>2或<0.5),整合差异基因,通过Pearson相关性检验获得共表达基因(阈值:P≥0.8),运用Cyto Scape软件分析并构建基因共表达网络。结果:在模型组-假手术组、雌激素组-模型组和左归丸组-模型组中,分别有328、79和700对基因共表达,构成网络体系。结论:左归丸-模型组中,4个子网络响应治疗过程,K-core子网络可能是左归丸防治绝经后骨质疏松症的直接靶基因模块。     

左归丸对衰老大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响

目的研究左归丸对衰老大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨与成脂分化的影响。方法通过腹腔注射D-半乳糖建模,制备衰老大鼠模型,分离培养MSCs,并诱导MSCs成骨和成脂分化。通过碱性磷酸酶(ALP)活性检测、ALP染色观察MSCs成骨分化能力,通过甘油三酯(TG)表达量和油红O染色观察MSCs成脂分化能力。结果模型组MSCs ALP染色阳性率明显低于正常组,左归丸组MSCs染色阳性率明显高于模型组(P0.05)。成骨诱导14 d,模型组MSCs ALP活性值明显低于正常组而左归丸组明显高于模型组(P0.05)。油红O染色,模型组MSCs染色阳性率明显高于正常组,左归丸组MSCs染色阳性率明显低于模型组(P0.05)。成脂诱导7 d,模型组MSCs TG表达量明显高于正常组而左归丸组MSCs TG表达量明显低于模型组(P0.05)。结论左归丸可促进衰老大鼠MSCs向成骨细胞分化,同时可抑制其向脂肪细胞分化。     

左归丸含药血清对大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化中碱性磷酸酶含量的影响

目的:研究左归丸含药血清对间充质干细胞骨向分化过程中碱性磷酸酶含量变化的影响。方法:采用全骨髓贴壁法培养间充质干细胞,连续进行3次差速贴壁法纯化间充质干细胞。常规诱导组以β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C诱导间充质干细胞骨向分化,实验组在常规诱导组基础上加以左归丸含药血清。使用茜素红染色钙结节、碱性磷酸酶染色鉴定诱导成功。分别在0,7,14,21 d用比色法检测细胞中碱性磷酸酶含量。结果:全骨髓贴壁法和差速贴壁法联合使用可得到较为均一间充质干细胞。用比色法测得碱性磷酸酶含量随着诱导时间延长而增加。结论:大鼠间充质干细胞经药物诱导后可以分化为成骨细胞。左归丸含药血清能够促使诱导过程中碱性磷酸酶含量表达增加。     

地龙提取物对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨地龙提取物对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖的影响。方法:全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠BMSCs,用流式细胞术鉴定P3代BMSCs。将地龙配制成终浓度为500、50、5、0.5 mg/m L的提取物溶液作为药物干预组,以0 mg/m L组为空白对照组,CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。通过比较OD值判断地龙提取物对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响,比较增殖率。结果:全骨髓贴壁法培养的P3代BMSCs表现为集落生长,经流式细胞术检测,CD90呈阳性表达,CD45呈阴性表达;CCK-8法检测结果为,剂量为0.5-50 mg/m L的药物干预组OD值较对照组显著升高;地龙浓度为5 mg/m L组OD值出现最大值,继续提高浓度OD值逐渐减小,当提取物浓度达到500 mg/m L时表现为细胞生长受到抑制。结论:培养的骨髓基质细胞在形态和表型上具备BMSCs的特性。地龙提取物在一定浓度范围内能促进BMSCs增殖。浓度为5mg/m L时促进BMSCs增殖作用最为明显,浓度为500 mg/m L时会抑制BMSCs的增殖。     

左归丸对MSG-大鼠胸腺及淋巴细胞增殖反应的影响

新生期大鼠给予左旋谷氨酸单钠（ＭＳＧ）损害下丘脑弓状核（ＡＲＣ），成年后大鼠除表现生长发育迟缓外，还可见到胸腺体积缩小、重量减轻，脾脏Ｔ淋巴细胞对Ｃｏｎ－Ａ诱导的增殖反应减弱。滋补肾阴代表名方左归丸能明显改善ＭＳＧ－大鼠的胸腺与淋巴细胞增殖反应的异常。提示：１．下丘脑弓状核参与细胞免疫功能的调节；２．左归丸能明显改善ＭＳＧ－大鼠的胸腺与淋巴细胞增殖反应的异常     

HPLC 法测定左归丸中马钱苷的含量

目的建立 HPLC 法测定左归丸中马钱苷含量的方法.方法采用 Eclipse XDB-C18色谱柱,以乙腈-水(15:85)为流动相;流速1.0ml?min-1;检测波长240nm.结果马钱苷在0.3701~1.2336μg 范围内线性关系良好(r=0.9999),平均回收率为99.86%, RSD=1.20%(n=6).结论本方法快速简便,准确可靠,可用于左归丸的质量控制.     

左归丸与六味地黄丸对衰老大鼠抗氧化能力及海马区超微结构影响的比较研究

目的:从实验的角度分析和比较左归丸和六味地黄丸及两方共有"三补"药物组抗衰老作用机制。方法:观察左归丸、六味地黄丸及两方共有"三补"药物组对D-半乳糖(D-gal)致亚急性衰老大鼠抗氧化能力和海马区超微结构的影响。结果:亚急性衰老大鼠超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力降低、丙二醛(MDA)含量升高、海马区脂褐素沉积增加和超微结构出现损伤性改变,左归丸、六味地黄丸及两方共有"三补"药物组干预后,大鼠SOD和GSH-PX活力表现出不同程度的升高,MDA含量降低、海马区脂褐素沉积减少和超微结构出现损伤减轻。结论:左归丸、六味地黄丸及两方共有"三补"药物组的抗衰老作用可能与提高抗氧化能力、减少脂褐素沉积和减轻脑组织损伤有关,其中"三补"的抗衰作用具有不稳定性,间接提示了配伍对于中药复方疗效稳定性的重要作用。     

应用红外热像诊断系统评价左归丸、右归丸及其拆方药物靶向性的研究

目的应用红外热像诊断系统对左归丸、右归丸及其拆方药物的靶向性进行动态评价研究。方法采用自身对照试验,募集5名健康志愿受试者,分别在其服用温水、左归丸、右归丸及其拆方药粉的第30、70、100、130、160 min,采用红外热像诊断系统对每位受试者采集全身10～11幅热像图,完成共计125例次的扫描后,对下腹、子宫、督脉、神阙4个区位的热值进行数据分析。结果（1）服用右归丸及其拆方第30 min时在不引起下腹热值增高的前提下可提高督脉区位和神阙区位热值。（2）服用左归丸及其拆方全程均降低督脉、神阙、下腹、子宫区位热值。结论左归丸、右归丸的药物靶向性集中在督脉和神阙区位,并非直接针对于下腹、子宫区位。     

脑络欣通和左归丸药物血清对体外培养的大鼠神经干细胞增殖分化的作用

目的 探讨脑络欣通药物血清和左归丸药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(neural stem cell, NSC)增殖分化的作用。方法 分别采用含10%脑络欣通药物血清和含10%左归丸药物血清的培养基培养大鼠胚胎NSC,观察其促增殖效应和诱导分化效应,应用相差显微镜和免疫荧光染色对其进行比较观察。结果 脑络欣通药物血清和左归丸药物血清均可诱导绝大多数NSC分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外,两者还能在一定程度上促进培养的NSC生长。前者诱导NSC分化的进程虽比后者要慢,但诱导NSC向神经元方向分化的比率较高,其分化的神经元在细胞形态学上与发育成熟的神经元更为接近;后者促进NSC生长的效应较为显著。结论 脑络欣通和左归丸均能促进体外培养的NSC生长和分化,两者作用有一定差异;益气活血治法和补肾生髓治法对NSC进行诱导分化具有一定的可行性。     

左归丸临床应用及实验研究进展

通过对近5年来有关左归丸的文献检索,对其临床应用及实验研究进行了归纳总结,发现此方在心脑血管疾病、生殖系统疾病、骨科疾病等许多方面都有着广泛的临床应用,其作用机制也已在众多实验研究中得到验证。     

左归丸对糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中E_2、PTH含量的影响

目的:探讨左归丸对糖皮质激素性骨质疏松症的治疗作用及机理。方法:将42只雌性Wistar大鼠随机分为3组:空白对照组12只,模型组15只,左归丸组15只。造模给药8周后,采用骨组织形态计量学方法对不脱钙骨切片进行形态计量,并采用ELISA法检测大鼠外周血血清中E2、PTH的含量。结果:与空白对照组相比,模型组大鼠胫骨TBV%及TFS%显著降低,TRS%显著增高;且大鼠血清中PTH含量显著增高,E2含量则显著降低。而左归丸组大鼠TBV%则显著高于模型组,TFS%亦显著增高,TRS%虽无差异,但有明显降低趋势;且血清中PTH含量显著降低,E2含量较之模型组显著增高。结论:左归丸可使糖皮质激素所致骨质疏松大鼠血清中PTH的水平下调,同时上调E2水平,使其紊乱状态基本恢复正常,这可能是其治疗糖皮质激素所致大鼠骨质疏松症的机理之一。     

基于多维宏观量化方法的左归丸及左归饮的组方规律

目的:分析左归丸、左归饮的组方规律并比较二者的差别。方法:选取四气五味及归经指数,对中药剂量进行标准化处理,即计算相对剂量;对相对剂量与四气五味及归经指数进行加权处理,得到四气五味及归经作用度。结果:四气量化:左归丸温性药作用度为210,占22.91%、微温性药作用度为62.4,占77.09%,无偏寒性药;左归饮:均为微温性药,作用度为62.4,占100%。五味量化:左归丸:甘味作用度为444.4,占52.14%、咸味作用度为192,占22.52%、酸味作用度为108,占12.67%;左归饮:甘味作用度为184.9,占62.70%、酸味作用度为60,占20.35%、涩味作用度为48,占16.28%。归经量化:左归丸:肝经作用度为528,占48.52%、肾经作用度为512.4,占47.11%;左归饮:肝经作用度为216,占46.24%、肾经作用度为171.64,占38.03%。结论:左归丸偏为温性,较为平和,五味以甘、咸、酸为主,主入肝、肾经;左归饮同为温性平和之品,五味以甘、酸、涩为主,主入肝、肾经。左归丸比较于左归饮在滋阴之中又加以血肉有情及助阳之品,补力更峻,余无明显差别。     

Akt信号通路在左归丸对体外培养新生大鼠海马神经干细胞凋亡中的作用

目的观察 Akt 信号通路在左旋单钠谷氨酸(MSG)和左归丸(ZGW)对新生大鼠体外培养海马神经干细胞(NSC)和子细胞凋亡中的作用。方法分离、培养新生大鼠海马 NSC,选第二代克隆球做诱导分化实验。每个培养孔(3ml 培养体积)加入终浓度为10μmol//L 的 MSC 或10μmol/L MSG 加左归丸10μg 与NSC 孵育30min,培养7天后收集细胞进行检测。采用流式细胞仪和 Western blot 方法分别检测细胞凋亡率和 Akt 信号通路变化。结果 MSG 可增加细胞凋亡率,抑制总 Akt 表达,显著降低 Akt(Ser473)和 Akt(Thr308)水平;明显增加 FKHR(Ser256)、GSK-3β(Ser9)和 PTEN 表达。ZGW 可抑制 MSG 的部分效应。分别给予 PI3K选择性抑制剂 LY294002和激动剂,可显著反转和增强 ZGW 效应。结论左归丸能抑制 NSC 及其子细胞凋亡,这一作用与 Akt 信号通路有关。     

左归丸对MSG-肝再生-大鼠再生肝组织基因表达谱的影响

目的:研究左归丸对MSG-肝再生-大鼠再生肝组织基因表达谱的影响。方法:复制MSG-肝再生-大鼠模型,治疗组给予左归丸5g/kg灌胃,于术后5天处死动物,取再生肝组织液氮冻存。选用1176条与细胞分化增殖相关的基因表达谱芯片,观察再生肝组织基因表达谱的变化。结果:治疗组相对于模型组的差异表达基因有292条(上调表达20条,下调表达272条)。结论:左归丸对MSG-肝再生-大鼠再生肝组织的基因表达谱有显著影响,以基因表达下调为主,提示左归丸通过调控MSG-肝再生-大鼠基因表达而影响其肝再生,下调MSG-肝再生-大鼠再生肝组织基因表达可能是左归丸滋养肝肾的重要分子机制之一。