软骨细胞形态、表型与胞间通讯的研究

背景：在体外培养时软骨细胞会像成纤维细胞样成片生长并失去表型，软骨细胞胞间通讯与细胞表型的关系尚无报告。目的：了解体外培养的不同形态的软骨细胞的增殖、基质合成、荧光染料摄入以及缝隙连接的关系。设计：以诊断为依据的实验研究。地点和对象：实验在解放军总医院骨科研究所和基础研究所完成，实验对象为兔关节软骨细胞，人股骨头软骨。干预：体外培养的兔软骨细胞，分别进行苏木精一伊红(HE)、亮绿一藩红花O染色，显微镜下测量细胞大小、激光共聚焦显微镜下测量细胞内的荧光强度。激光淬灭软骨细胞内的荧光染料。主要观察指标：软骨细胞的外观、细胞大小、细胞内的荧光强度。结果：细胞投影面积测量：软骨细胞变大，失去球形外观后增殖加快，平均面积1755．1μm^2，投影面积差别可达50倍。基质合成消失，缝隙连接消失。显微镜下软骨细胞的荧光强度测量：球形软骨细胞CFDA-AM摄人多，(平均2057／30个细胞)，扁平细胞摄入少(平均83／30个细胞)。体外培养的球形兔软骨细胞间，人关节软骨生发层陷窝内的细胞间有胞间通讯。结论：软骨细胞的密度、形态、表型和缝隙连接之间有一定的关系。而细胞外形可能决定细胞的表型。     

异种关节软骨与MSCs体外共同培养的实验研究

目的提供一种新的种子细胞获得方法,解决软骨缺损修复过程中软骨数量不足的困难。方法人骨髓间充质干细胞体外扩增诱导分化后与兔的关节软骨细胞按不同比例共同培养利用real-time PCR技术分析细胞表型的表达情况。结果实验组2种细胞共培养4周后,混合培养显示正反馈调节软骨细胞的增殖,软骨细胞外基质、SOX9、Ⅱ型胶原基因表达增加,软骨细胞生成明显增加。结论间充质干细胞以旁分泌或自分泌的方式调节间充质干细胞向软骨细胞的转化。     

异种关节软骨与MSCs体外共同培养的实验研究

目的提供一种新的种子细胞获得方法,解决软骨缺损修复过程中软骨数量不足的困难。方法人骨髓间充质干细胞体外扩增诱导分化后与兔的关节软骨细胞按不同比例共同培养利用real-time PCR技术分析细胞表型的表达情况。结果实验组2种细胞共培养4周后,混合培养显示正反馈调节软骨细胞的增殖,软骨细胞外基质、SOX9、Ⅱ型胶原基因表达增加,软骨细胞生成明显增加。结论间充质干细胞以旁分泌或自分泌的方式调节间充质干细胞向软骨细胞的转化。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景:骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能.目的:体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件.方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3 代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1 的软骨分化诱导剂,2 周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达.结果与结论:可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖.经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性.10 μg/L 的转化生长因子β1 诱导成软骨分化能力最强.     

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的:探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法:实验于2003-09/12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体,麻醉处死后,切取关节软骨,系列酶消化分离软骨细胞,洗涤,37℃于体积分数为0.05的CO2中培养,传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞,将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维/左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周,再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果:实验共纳入4只日本大耳白兔,作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况:转染后3d,倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞,主要为三角形,少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加,绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主,少数细胞为三角形和椭圆形,体外培养8周,细胞增殖良好,荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87.3%。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果:软骨细胞三维接种支架后,细胞几乎全部种植于支架上,在支架材料内分布均匀,刚接种的细胞呈圆形,发出明亮的绿色荧光;3～4h细胞开始变形,2～3d即己基本完全变形,细胞的形态以长梭形为主,呈网状排列,随着培养时间延长,支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形,移植前(体外培养3周)支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周,细胞密度增加,荧光强度未见减弱,而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况:移植术后4周,大体观察可见移植组织有别于周围软骨,表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周,苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞,排列不规则,表层细胞体积较小,数量较多,深层细胞体积较大,细胞外基质较少,与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少,支架材料大部分降解吸收,修复区与周围组织分界清楚,连接处稍不平整,未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察,修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相,荧光充满整个细胞,荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中,与周围正常关节软骨分界清楚。结论:反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响,可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况,对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。     

结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型的影响

背景:在关节软骨损伤修复的过程中,由于目前实验室中常用的细胞因子存在半衰期短、价格昂贵等缺点,不能广泛应用于临床.目的:假设结缔组织生长因子对体外培养的兔关节软骨细胞增殖和表型有一定的影响,为组织学方法修复关节软骨缺损寻找新的细胞因子.设计、时间及地点:随机区组设计对照实验,于2007-08/2008-02在深圳龙岗中心医院完成.材料:健康1月龄新西兰大白兔2只:结缔组织生长因子为Propetech公司产品.方法:获取兔关节软骨组织,将其剪碎,Ⅱ型胶原酶消化法原代分离培养兔关节软骨细胞,待细胞铺满瓶底80%胰酶消化传代,取其第2代,细胞贴壁后随机分组,实验组分别加入30,50,100,150 μ g/L的结缔组织生长因子,对照组仅加入DMEM培养液进行体外培养.主要观察指标:采用倒置相差显微镜下观察细胞形态及数量改变,采用四唑盐(MTT)法检测不同浓度的结缔组织生长因子对软骨细胞增殖的影响,免疫组织化学法(SABC法)检测Ⅱ型胶原的表达情况.结果:①结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞生长迅速,呈典型的软骨细胞形态,部分细胞聚集成团,形成软骨结节.②结缔组织生长因子能显著促进兔关节软骨细胞增殖,与对照组相比差异具有显著性意义(P<0.01).不同质量浓度的结缔组织生长因子均能促软骨细胞增殖,100μg/L为最佳作用质量浓度(P<0.01).③结缔组织生长因子作用下的兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原表达增多,且始终为阳性.结论:结缔组织生长因子可以刺激体外培养的兔关节软骨细胞增殖,促进软骨特异性Ⅱ型胶原表达,维持软骨表型.结缔组织生长因子可能用来作为组织工程学修复软骨缺损,治疗骨关节炎的新的生长因子.     

鹿茸多肽诱导骨髓间充质干细胞体外向软骨表型的分化

背景:实验证实鹿茸多肽可以促进体外培养软骨细胞的增殖和细胞外基质糖胺多糖、Ⅱ型胶原、Aggrecan蛋白的表达.目的:通过对体外培养的兔骨髓间充质干细胞在特定培养液作用下向软骨细胞表型分化的研究,探讨鹿茸多肽对其软骨分化的影响.方法:将第3代兔骨髓间充质干细胞随机分为空白对照组、诱导组、鹿茸多肽组,分别采用普通培养液、诱导培养液、含10 mg/L鹿茸多肽的诱导培养液于离心管内进行培养;并取兔的关节软骨细胞作为关节软骨组.分别于1,2,3周后取材,通过组织学、生物化学和RT-PCR技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态的观察.结果与结论:空白对照组培养2周后,细胞团块逐渐崩解,无法进行苏木精-伊红染色.诱导组、鹿茸多肽组细胞团块除有轻度收缩外,呈白色半透明状;苏木精-伊红染色发现部分细胞为圆形或卵圆形,表层细胞密度大;诱导组、鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达随培养时间延长而增多,各时间点诱导组、鹿茸多肽组含量均高于空白对照组(P < 0.05);各时间点鹿茸多肽组糖胺多糖含量及Ⅱ型胶原mRNA表达均高于诱导组,但低于关节软骨组 (P < 0.05).提示骨髓间充质干细胞在特定培养条件下能向软骨细胞表型分化,且鹿茸多肽对其定向软骨分化有明显促进作用.虽然在体外可以构建出软骨组织,但其与关节软骨质量相比仍有很大差距.     

绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨构建中的示踪作用

目的：探讨绿色荧光蛋白在组织工程关节软骨体外构建和体内移植修复关节软骨缺损中对细胞的示踪作用。方法：实验于2003—09／12在第三军医大学西南医院中心实验室完成。选取清洁级雄性3～4周龄日本大耳白兔2只作为供体，麻醉处死后．切取关节软骨，系列酶消化分离软骨细胞，洗涤，37℃于体积分数为0．05的CO2中培养，传代扩增。再选取清洁级雄性4月龄日本大耳白兔2只作为受体。首先用反转录病毒载体pLEGFPN1感染软骨细胞，将胶原凝胶包埋的绿色荧光蛋白标记软骨细胞接种于聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸三维支架后体外培养3周，再用标记软骨细胞～支架复合物移植修复兔膝关节软骨缺损。倒置荧光显微镜下观察细胞接种支架率和体外培养过程中细胞在支架上生长、增殖、分化、分布及术后4周细胞在缺损区的成活与软骨缺损修复情况。结果：实验共纳入4只日本大耳白兔，作为受体的2只进入结果分析。①绿色荧光蛋白反转录病毒转染第一代关节软骨细胞情况：转染后3d，倒置荧光显微镜下可看到表达绿色荧光蛋白的关节软骨细胞，主要为三角形，少数呈多角形和梭形。随着传代次数的增加，绿色荧光蛋白阳性软骨细胞的形态变为以梭形为主，少数细胞为三角形和椭圆形，体外培养8周，细胞增殖良好，荧光强度无减弱。流式细胞仪检测G418筛选2周后软骨细胞的绿色荧光蛋白表达率为87．3％。②绿色荧光蛋白标记软骨细胞支架复合物倒置荧光显微镜观察结果：软骨细胞三维接种支架后，细胞几乎全部种植于支架上，在支架材料内分布均匀，刚接种的细胞呈圆形，发出明亮的绿色荧光；3-4h细胞开始变形，2～3d即己基本完全变形，细胞的形态以长梭形为主，呈网状排列，随着培养时间延长，支架上的细胞逐渐由梭形变成圆形，移植前（体外培养3周）支架上细胞大多数己呈圆形。体外培养6周，细胞密度增加．荧光强度未见减弱，而不能在荧光显微镜下观察未标记软骨细胞～支架复合物中细胞的形态。③绿色荧光蛋白标记关节软骨细胞在修复区成活及参与软骨缺损修复情况：移植术后4周，大体观察可见移植组织有别于周围软骨，表面尚平整。绿色荧光蛋白标记软骨细胞～支架复合移植修复关节软骨缺损4周，苏木精-伊红染色可见修复区细胞为透明软骨样细胞，排列不规则，表层细胞体积较小，数量较多，深层细胞体积较大，细胞外基质较少，与周围组织分界清楚。甲苯胺蓝染色可见修复区甲苯胺蓝阳性的基质较少，支架材料大部分降解吸收，修复区与周围组织分界清楚，连接处稍不平整，未见淋巴细胞浸润。倒置荧光显微镜进行观察，修复区可见发绿色荧光的圆形细胞及其分裂相，荧光充满整个细胞，荧光细胞未进入周围的软骨及软骨下骨中，与周围正常关节软骨分界清楚。结论：反转录病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染对关节软骨细胞的黏附、伸展、生长和增殖等功能没有明显的影响，可长期稳定的标记关节软骨细胞以及动态观察软骨细胞的生长和增殖等情况，对组织工程软骨体外构建和体内软骨形成有良好的示踪作用。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用

目的:观察腺病毒介导的绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记软骨组织工程种子细胞的可行性,探讨外源性软骨细胞在组织工程化软骨组织形成中的作用。方法:实验于2002-01/08在解放军第一军医大学实验室完成。腺病毒GFP表达载体以巨细胞病毒(CMV)为启动子转染体外培养软骨细胞作为种子细胞与poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)(PHBHH)复合后植入兔体内,术后一定时间取材,确定组织工程化组织的表型,观察GFP的表达。结果:以CMV为启动子的腺病毒GFP载体能有效转染体外培养软骨细胞,转染效率达53.66%。携带GFP的软骨细胞作为软骨组织工程种子细胞,6周和12周形成的组织工程化组织中检测到GFP表达,经苏木精-伊红染色、免疫组织化学检查和特殊染色确定获取的组织为软骨组织,且与未转染软骨细胞形成的组织工程化软骨组织形态学一致。结论:腺病毒介导的GFP能有效转染体外培养软骨细胞,外源性软骨细胞是体内组织工程化软骨组织形成的源细胞。     

不同浓度二甲基亚砜对兔软骨细胞生长的影响

目的探讨作为一些水相难溶性化合物助溶剂的二甲基亚砜(DMSO)在不同浓度下对体外培养兔软骨细胞的存活率及生长的影响。方法分别以含0.1%、0.5%、1.0%、2.0%(v/v)DMSO的培养基体外培养兔软骨细胞,每天定时取样,用MTT法检测不同浓度DMSO存在下的细胞存活率,并用血球计数板计量细胞数。结果不同浓度DMSO对体外培养的兔软骨细胞生长有一定的影响,使用浓度为2.0%(v/v)时对软骨细胞显现较强的抑制作用,但在0.1%¹.0%浓度范围内影响很小。结论在0.1%1.0%浓度范围内影响很小。结论在0.1%¹.0%低浓度范围内,DMSO促溶剂的使用对培养软骨细胞实验的干扰不大,可以忽略。     

同种异体血清体外培养兔膝关节软骨细胞的增殖

背景:兔关节软骨细胞体外单层培养采用胎牛血清培养基易去分化,有必要寻找合适培养基来提高兔关节软骨细胞培养质量。目的:观察同种异体兔血清对体外培养的兔膝关节软骨细胞增殖能力的影响。方法:以0.4%链霉蛋白酶和0.025%Ⅱ型胶原酶分离成年兔膝关节软骨细胞,将获得的软骨细胞随机分为实验组和对照组。实验组以体积分数10%异体兔血清+DMEM/F12培养;对照组以体积分数10%胎牛血清+DMEM/F12培养,传代培养至4代。结果与结论:实验组前4代软骨细胞增殖较对照组慢,但软骨细胞形态未发生明显改变而对照组软骨细胞出现去分化现象。提示体积分数10%异体兔血清培养利于维持软骨细胞增殖和形态的稳定,是较好的获取大量优良软骨细胞的体外培养方式。     

地塞米松磷酸钠对体外培养关节软骨细胞增殖的影响

背景:研究表明,地塞米松可以使关节软骨表层基质中的Ⅱ型胶原减少,Ⅰ型胶原增多,但糖皮质激素对关节软骨细胞增殖作用的机制尚不十分清楚.目的:验证地塞米松磷酸钠对体外培养兔关节软骨细胞增殖的影响.设计:对比观察.材料: 1月龄新西兰白兔用于软骨细胞的分离与培养.方法:兔关节软骨细胞常规培养后随机分为对照组和实验组,对照组用不含地塞米松磷酸钠的DMEM培养液培养,实验组则分别加入含不同质量浓度地塞米松磷酸钠(0.02,0.1,0.5 g/L)的DMEM培养液.主要观察指标:①原代及传代兔关节软骨细胞的形态学观察.②应用流式细胞术及免疫细胞化学法检测软骨细胞增殖及其合成Ⅱ型胶原能力.③透射电子显微镜观察软骨细胞超微结构的变化.结果:实验组软骨细胞贴壁、增殖较对照组缓慢.各实验组Ⅱ型胶原平均灰度值均显著高于对照组(P<0.05).实验组软骨细胞进入S期、G_2+M期的细胞比率较对照组软骨细胞减少、进入G_0/G_1期的细胞比率增加.电镜下见软骨细胞线粒体、粗面内质网数量减少.结论:地塞米松磷酸钠抑制软骨细胞的增殖,可能与抑制关节软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白的合成能力有关.     

以交联透明质酸钠为支架体外构建组织工程软骨简

背景：采用组织工程技术再生和重建软骨是目前修复软骨组织缺损效果最好、最有应用前景的方法。 目的：以体外培养的软骨细胞和交联透明质酸钠为支架材料,开发一套体外构建组织工程软骨的完整方案。方法：分离新西兰兔膝关节软骨细胞,制成细胞悬液滴加于交联透明质酸钠支架上,体外复合培养21 d,提取RNA进行RT-PCR检测,制备冰冻切片进行显微观察和免疫组织化学观察。 结果与结论：软骨细胞接种于交联透明质酸钠支架材料后,可贴附于支架上生长,并且大量细胞聚集成团,在支架材料的纤维间隙中生长或呈单层细胞附着于支架材料纤维。细胞-支架复合物表达软骨组织特异性蛋白聚糖基因和Ⅱ型胶原α1基因,以及软骨组织特异性蛋白Ⅱ型胶原蛋白,可维持软骨细胞表型。表明培养的细胞-支架复合物在体外培养可形成软骨细胞外基质,有望获得组织工程软骨组织。     

应用液态及凝胶态生物载体材料负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨缺损

背景:应用固态载体作为细胞支架,修复关节软骨缺损,已有成功经验。尝试将液态载体或凝胶态载体材料复合细胞后注入动物体内,观察该方法的可行性。目的:探讨液态载体或凝胶态载体材料氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨的可行性。设计:对照实验。单位:威海市立医院骨科,山东省创伤骨科研究所。材料:实验于2001-11/2003-09在山东省创伤骨科研究所实验室进行。健康成年新西兰大白兔36只,体质量2.5～4.5kg,雌雄不限。编号后根据缺损处注入物质的成分随机数字法分成4组,即氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2软骨细胞组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组、空白对照组,每组9只。方法:36只大白兔分组后造关节软骨缺损模型,取同种新西兰大白兔关节软骨细胞,体外培养扩增后与20%氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2混合,移植到缺损处进行修复。各移植组缺损处分别注入氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组。空白对照组:缺损处不做任何处理。移植后4,8,12周对缺损的修复情况进行大体、光镜组织学评估和电镜观察。据Wakitani评分标准,采用盲法对修复质量作出评价。主要观察指标:①软骨缺损修复程度。②软骨细胞的性质形态,基质中胶原性质、数量及排列方式。结果:①移植的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞中的软骨细胞能很好地生长,4周时,缺损区完全填充。8,12周再生组织与周围正常软骨组织外观相似,界限模糊。组织学检查:形成透明软骨,缺损处被修复。②电镜下:8,12周,修复组织中可见多数成熟的透明软骨细胞及其周围排列不规则的、纤细的、均匀的和无周期性的Ⅱ型胶原。空白对照组仅见纤维修复,再生组织缺乏弹性,表面粗糙,不规则。③修复质量评分:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞组和各组相比在各个时期差异均存在显著性,氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组和氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组与对照组相比在各个时期差异均存在显著性[4周:(3.93±1.91),(4.56±1.07),(4.78±1.09),(8.44±1.13)分;8周:(2.80±1.45),(3.24±1.00),(3.33±1.00),(8.44±1.13)分;12周:(2.22±1.10),(3.01±0.69),(3.00±0.71),(9.00±0.87)分,P<0.001],但两组之间在各个时期无显著的差异(P>0.05)。结论:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞移植能以透明软骨的方式成功修复兔膝股骨髁软骨缺损,并优于单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物负载重组人骨形态蛋白2或单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞的移植。     

自体血清与胎牛血清培养兔关节软骨细胞的生物学特性

背景：目前培养软骨细胞多使用胎牛血清。但近年异种血清培养组织向临床应用的安全性受到质疑,因此自体血清培养越来越受到重视。目的：比较体积分数10%兔自体血清与体积分数10%胎牛血清培养兔关节软骨细胞生物学特性的差异。方法：兔自体血清培养液制备后,分离培养兔关节软骨细胞,分别在体积分数10%自体血清和体积分数10%胎牛血清中进行单层传代培养至1,3,5代,采用光镜观察细胞形态变化,绘制生长曲线评估细胞增殖速度,观察甲苯胺蓝染色、Ⅰ,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果,以流式细胞仪分析细胞Ⅰ,Ⅱ型胶原以及CD26,CD44的表达变化。结果与结论：①在细胞形态上自体血清和胎牛血清培养的软骨细胞差异不大。②自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清培养的软骨细胞生长速度更快。③甲苯胺蓝染色结果示,无论是自体血清还是胎牛血清所培养的细胞,染色随代龄的增加逐渐变浅,细胞传至第5代时两组几乎均无异染。对于1代和3代细胞而言,自体血清培养的软骨细胞较胎牛血清所培养的软骨细胞较为深染。④Ⅰ型胶原的表达随代数的增加而增加,而Ⅱ型胶原的表达则随代数的增加而减少。在3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅰ型胶原的表达水平低于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）;在1代和3代时自体血清培养的软骨细胞Ⅱ型胶原的表达水平高于胎牛血清培养的软骨细胞（P〈0.05）。⑤CD26表达呈现先升高后降低的趋势,而CD44的表达不随传代数的增加而改变。提示同异体体积分数10%的胎牛血清相比,体积分数10%的自体血清培养的兔软骨细胞生长速度快,且在大部分指标上可以较好地保持细胞表型。     

类胰岛素样生长因子I在人鼻中隔软骨细胞体外培养中的作用

目的:为加速体外培养的人鼻中隔软骨细胞的增殖,观察类胰岛素样生长因子I(IGF-I)对体外培养软骨细胞的影响。方法:体外培养人鼻中隔软骨细胞,MTT法观察IGF-I对软骨细胞增殖的影响;流式细胞仪检测IGF-I对软骨细胞周期的影响;斑点杂交法了解IGF-I对软骨细胞II型胶原mRAN的影响。结果:IGF-I浓度大于5ng/ml即可促进体外培养软骨细胞的增殖,缩短软骨细胞增殖周期,有助于II型胶原mRNA的合成。结论:IGF-I促进人鼻中隔软骨细胞增殖与缩短细胞周期有关,并可能通过促进软骨细胞II型胶原mRNA的合成使软骨细胞保持表型稳定。     

深低温冻存软骨细胞构建组织工程化软骨

目的 :研究深低温冻存的软骨细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨的能力。方法 :取 2周龄新西兰兔关节软骨细胞 ,经深低温冻存、复苏及体外培养 ,取第 3代对数生长期培养细胞 ,制成细胞悬液 ,调整其为 5× 10 7个 / ml左右 ,接种于 PGA三维支架材料上 ,复合物体外培养 1周 ,移植于裸鼠皮下 ,术后 12周取材 ,行大体及组织学观察。结果 :经深低温冻存的软骨细胞与新鲜的软骨细胞一样形成了预定形态的软骨结构 ,组织学观察有软骨生成及基质分泌 ,单纯PGA支架及单纯的细胞悬液无软骨组织生成。结论 :经深低温冻存的软骨细胞保持了分裂增殖及合成基质的能力 ,可用于组织工程构建组织工程化软骨     

自组装短肽水凝胶体外三维培养兔关节软骨细胞

背景:自组装短肽是人工设计合成的一类新型纳米生物材料,与软骨细胞复合培养后如能促进细胞基质的分泌,细胞分裂增殖及细胞表型的维持,将有可能成为一种较理想的细胞支架应用在软骨组织工程中。目的:观察兔关节软骨细胞在纳米自组装短肽KLD-12水凝胶中三维培养的生物学特性。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-04在四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所实验室完成。材料:纳米短肽KLD-12序列为:Ac-KLDLKLDLKLDL-CONH2,由上海波泰生物公司合成。方法:取新西兰兔关节软骨,通过酶消化法获取软骨细胞,体外培养2代后以5×109L-1的密度接种于4g/L的自组装短肽KLD-12溶液中,用磷酸盐缓冲液诱导成胶后进行三维培养。主要观察指标:①通过倒置相差显微镜观察软骨细胞在纳米短肽水凝胶中的形态。②用甲苯胺蓝染色,免疫组化检测细胞外基质分泌情况。③反转录-聚合酶链反应检测软骨细胞黏多糖、前Ⅱ型胶原、前Ⅰ型胶原基因的表达情况。结果:①兔关节软骨消化分离的软骨细胞成活率达95%以上。②软骨细胞在纳米短肽水凝胶中体外培养时,细胞生长旺盛、增殖活跃,细胞为圆形聚集成团状或岛状,细胞团周围有类似的软骨陷窝形成。③甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫组化均呈阳性,细胞基质中黏多糖、Ⅱ型胶原含量随培养时间延长逐渐增加。④反转录-聚合酶链反应结果显示软骨细胞在纳米短肽水凝胶经过3周体外培养一直保持了分泌黏多糖及表达Ⅱ型胶原的能力。结论:自组装短肽KLD-12三维水凝胶能较好维持软骨细胞正常形态、功能和增殖能力。     

以脱细胞牛软骨基质为支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的以脱细胞牛软骨基质（acellular cartilaginous matrix,ACM）作支架体外构建组织工程软骨,了解其作为软骨组织工程支架的可行性。方法 2003年1月-2005年12月联合应用冻干-反复冻融-酶消化法对牛软骨基质行脱细胞处理。将体外培养扩增的2～5代兔软骨细胞接种在材料上,体外培养3周,观察软骨细胞在支架材料上的生长分布情况。结果软骨细胞在制备的ACM上可较好地黏附生长,并且分泌大量Ⅱ型胶原和葡萄糖胺聚糖;但软骨细胞不能长入ACM内部,只能在表层生长,少量软骨细胞分布在ACM孔隙中。结论 ACM支架材料具有良好的细胞相容性和活性,并且能促进软骨细胞增殖和维持软骨细胞表型。