抑制LRP16基因表达增加了肿瘤细胞辐射敏感性

目的:探索抑制LRP16基因表达对肿瘤细胞辐射治疗敏感性的影响。方法:采用逆转录病毒介导的小干扰RNA策略,建立了LRP16基因表达被稳定抑制的MCF7及HeLa细胞系,采用电离辐射及紫外线(UV)分别照射LRP16基因被稳定抑制表达的MCF7和HeLa细胞,于照射后不同的时间点进行Hoechst33342染色以检测细胞凋亡率,并进行DNA片段化分析;胎盘蓝染色检测不同时间点的细胞死亡率。结果:照射后2～10h之间,LRP16基因表达抑制组细胞的凋亡率明显高于对照组(P<0.05);照射后10h胎盘蓝方法计数死活细胞,发现LRP16基因抑制组细胞的死亡率>40%,而对照组的死亡率在15%～20%之间;24h计数细胞死亡率发现LRP16基因抑制组细胞与对照组细胞差别不明显(P>0.05)。结论:抑制LRP16基因在肿瘤细胞中的表达增加了瘤细胞的辐射治疗敏感性,其机制可能是通过抑制LRP16基因表达干预了辐射诱导DNA损伤反应的早期信号途径。     

抑制LRP16增加Hela细胞对足叶乙甙的敏感性

目的 探明LRP16的表达与化疗药物足叶乙甙所诱导的肿瘤细胞凋亡是否产生作用以及可能的分子机制.方法 首先将抑制LRP16表达的小干扰RNA,control,siRNA,siRNA-374(抑制率90％),siRNA-668(抑制率60％),对照分别转染入Hela细胞内,并通过足叶乙甙处理的细胞而导致DNA损伤.之后用CCK-8检测细胞活力;用流式细胞技术测定抑制LRP16的表达对Hela细胞凋亡率的影响;通过RT-PCR检测抑制LRP16表达之后核转录因子-κ B(nuclear factor-κ B,NF-κ B)凋亡相关的下游靶基因的mRNA水平.结果 在足叶乙甙(100μmol)的作用下,抑制LRP16的表达能够明显抑制细胞的增长(P＜0.05),并呈浓度依赖性,同时增加细胞的凋亡率(P＜0.05).RT-PCR结果显示,下调LRP16的表达减弱NF-κB的转录活性,进而对其下游靶基因的水平进行调节.结论 LRP16在足叶乙甙导致的凋亡起重要作用,而且可能是通过下调NF-κ B的活性来发挥化疗药物抵抗效应.我们的实验结果初步证实抑制LRP16增加Hela细胞对足叶乙甙的敏感性.     

LRP11在宫颈癌中表达及其与HPV感染和肿瘤进展的关系

目的研究低密度脂蛋白受体相关蛋白11(LRP11)在宫颈癌中表达及其与人乳头瘤病毒(HPV)感染和肿瘤进展的关系。方法收集123例宫颈癌手术患者的癌组织(HPV阴性25例,HPV阳性98例)及癌旁正常组织,采用免疫组织化学染色法检测癌旁正常组织、HPV阴性宫颈癌组织、HPV阳性宫颈癌组织中LRP11蛋白表达水平。选用HPV阳性人宫颈癌细胞系Hela、HPV阴性人宫颈癌细胞系C33A及人正常宫颈上皮细胞系HUCECs,采用Western blot法检测3种细胞中LRP11蛋白表达量。将Hela细胞分为对照组、空质粒组和LRP11质粒组,对照组不作任何处理,空质粒组转染8 μg pEGFP-N1质粒,LRP11质粒组转染8 μg pEGFP-N1-LRP11质粒,CCK8法检测各组Hela细胞增殖率,Transwell小室侵袭实验检测各组Hela细胞侵袭能力,流式细胞术检测各组Hela细胞凋亡率,Western blot法检测各组Hela细胞中LRP11蛋白表达量。结果HPV阴性宫颈癌组织和HPV阳性宫颈癌组织中LRP11阳性表达率高于癌旁正常组织(P＜0.05),HPV阳性宫颈癌组织LRP11阳性表达率高于HPV阴性宫颈癌组织(P＜0.05)。Hela细胞和C33A细胞LRP11蛋白表达量高于HUCECs细胞(P＜0.05),Hela细胞LRP11蛋白表达量高于C33A细胞(P＜0.05)。LRP11质粒组Hela细胞增殖率、穿过小室膜的Hela细胞数、LRP11蛋白表达量较对照组和空质粒组高(P＜0.05),LRP11质粒组Hela细胞凋亡率较对照组和空质粒组低(P＜0.05),空质粒组Hela细胞增殖率、凋亡率、穿过小室膜的Hela细胞数、LRP11蛋白表达量较对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。结论LRP11在宫颈癌中呈高表达,宫颈癌中LRP11表达与HPV感染有一定相关性;LRP11过表达可促进宫颈癌细胞增殖和侵袭,抑制其凋亡,以加速肿瘤进展。     

下调MCT1表达抑制宫颈癌Hela细胞增殖并促进其凋亡

［摘要］ 目的探讨下调单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1,MCT1)表达对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响及其机制。 方法将体外培养的Hela细胞分为未转染组、阴性对照组和MCT1-siRNA组,Western blot检测Hela细胞中MCT1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,MTT法检测Hela细胞增殖活力,流式细胞仪检测Hela细胞周期分布和凋亡率。 结果与未转染组比较,阴性对照组Hela细胞中MCT1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平和细胞增殖、周期分布以及细胞凋亡率差异均无统计学意义（P＞0.05）,MCT1-siRNA组细胞中MCT1和Bcl-2蛋白表达水平、细胞增殖活力和细胞在S期所占百分比均明显降低,Bax蛋白表达水平、细胞在G0/G1期所占百分比和细胞凋亡率均明显升高（P＜0.05）。 结论下调MCT1表达可通过诱导细胞周期阻滞抑制Hela细胞增殖,并通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达促进Hela细胞凋亡。     

FoxM1对人宫颈癌顺铂耐药株Hela/DDP增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制研究

目的：探讨叉头框转录因子M1(FoxM1)对人宫颈癌顺铂耐药株Hela/DDP增殖、侵袭、凋亡的影响及其机制。方法：将Hela/DDP细胞分为空白组（常规培养，不予任何处理）、正常对照（NC）组（转染空白干扰质粒）、低表达组和过表达组。低表达组转染siRNA-FoxM1下调Hela/DDP细胞中FoxM1表达，过表达组转染pcDNA3.1-FoxM1上调Hela/DDP细胞中FoxM1表达。采用RT-qPCR法检测FoxM1 m RNA表达水平，CCK-8检测细胞活力，流式细胞仪检测细胞凋亡，Transwell小室检测细胞侵袭能力。结果：FoxM1 mRNA在Hela细胞中的表达水平低于Hela/DDP细胞（P<0.05）。空白组与NC组中FoxM1 mRNA、增殖率、凋亡率、侵袭细胞数及HSP70、S100A9蛋白表达水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与空白组比较，低表达组细胞活力和侵袭能力及FoxM1 mRNA、HSP70蛋白表达水平降低，凋亡率和S100A9蛋白表达水平升高（P<0.05），与空白组比较，过表达组细胞活力和侵袭能力及FoxM1 m R...     

RNA干扰Survivin基因对Hela细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响

目的:研究RNA干涉Survivin基因表达对人宫颈癌Hela细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响.方法:将Sur-vivin SiRNA片段通过脂质体的介导转染宫颈癌Hela细胞系;RT-PCR检测Hela细胞中Survivin mRNA的表达,Western Blot检测Survivin蛋白表达;确定转染成功使干扰组细胞Survivin表达下调后,以流式细胞仪检测细胞凋亡率变化;细胞计数后绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化;MTT法检测细胞对抗肿瘤药物的敏感性变化.结果:与对照组相比,两个Survivin基因干扰组的mRNA和蛋白表达抑制率分别为55%,60%和42%,55%,表达均下降(P<0.05);细胞凋亡率分别为19%和22%,较对照组高(P<0.05);生长曲线显示干扰组的细胞增殖能力下降;同一剂量药物作用下,各组细胞对抗肿瘤药物的敏感性均有提高,其中NVB组和PDD组有统计学意义(P<0.05).结论:Survivin SiRNA片段转染进入Hela细胞后,Survivin mRNA和蛋白表达水平均下降,Hela细胞的凋亡率增加,对抗肿瘤药物的敏感性增加.     

BNIP3表达载体转染对胃癌细胞株SGC-7901生物学行为的影响

目的观察Bc L-2与腺病毒E1B 19KDa相互作用蛋白3(BNIP3)高表达对胃癌细胞SGC-7901的增殖以及对化疗药物敏感性的影响。方法免疫细胞化学法筛选BNIP3表达阴性或表达相对较低的胃癌细胞株;BNIP3真核表达载体pc DNA3.1-BNIP3-FLAG通过脂质体转染胃癌细胞;Western blot进行鉴定;MTT法和克隆形成实验检测转染细胞的增殖情况;MTT法检测转染细胞对常规化疗药5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性。结果 SGC-7901和BGC-823细胞均有BNIP3表达,表达水平SGC-7901低于BGC-823(P<0.05);与未转染组和转染空载体pc DNA3.1组比较,转染pc DNA3.1-BNIP3-FLAG组BNIP3相对表达量显著增高(P<0.05),转染pc DNA3.1-BNIP3-FLAG组5-Fu的IC50值显著降低(P<0.05),细胞克隆形成率显著降低(P<0.05),细胞增殖速度减慢。结论 BNIP3在胃癌细胞中高表达可抑制胃癌细胞SGC-7901增殖,增强细胞对化疗药物5-Fu的敏感性。     

Bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用

目的研究bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用,为基因转染治疗脑血管病寻找实验依据。方法体外培养新生大鼠大脑皮层神经细胞,应用脂质体转染法将bcl-2基因转染入神经细胞,建立氧糖剥夺模型,实验分为正常对照组、氧糖剥夺组和bcl-2转染组(转染bcl-2基因24h后,进行氧糖剥夺),采用Western blot法、MTT法、流式细胞仪分别检测各组细胞的bcl-2蛋白表达、细胞活力及凋亡率。结果 SD大鼠大脑皮层神经细胞可纯化体外培养,纯度达到90%以上。成功建立了大鼠神经细胞体外氧糖剥夺模型,成功进行了质粒pc-DNA3.1-hbcl-2的转化、扩增及基因转染。对照组神经细胞bcl-2少量表达,氧糖剥夺组bcl-2蛋白微弱表达,转染组细胞bcl-2蛋白高表达,各组间差异均有统计学意义(均P<0.01)。MTT法检测结果显示,对照组细胞的吸光度值(A)为(0.851±0.034);氧糖剥夺组的A值为(0.648±0.030),与对照组相比明显降低(P<0.01);转染组的A值为(0.787±0.004),低于对照组(P<0.05),但明显高于氧糖剥夺组(P<0.05)。对照组神经细胞凋亡率为4.6%;氧糖剥夺损伤后细胞凋亡率明显增加,为19.6%;转染组细胞凋亡率与氧糖剥夺组相比有明显下降,为9.6%,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论脂质体介导的bcl-2基因转染对氧糖剥夺损伤的大鼠大脑皮层神经细胞有明显保护作用。     

RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性影响

目的探讨RNA干扰survivin基因表达对肝癌细胞放射敏感性的影响。方法构建针对人肝癌HepG2细胞survivin基因靶序列的shRNA真核表达载体pshRNA-survivin-387。设置空白对照组(不加载体)、阴性对照组(加入pshRNA-survivin-NC)及siRNA转染组(加入pshRNA-survivin-387),用脂质体2000转染HepG2细胞,采用逆转录聚合酶链反应技术检测各组survivin基因mRNA表达水平。分别设置空白对照组、阴性对照组、siRNA转染组、X线照射组、siRNA转染+X线照射组,收集各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡率,MTT法测定细胞存活分数。结果 siRNA转染组survivin基因mRNA表达水平明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有显著性(F=218.93,q=17.73、18.66,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞凋亡率明显高于其他各组,差异有显著性(F=1 421.83,q=13.81～57.48,P<0.05);siRNA转染组及X线照射组与空白组、阴性组比较,细胞凋亡率也明显提高(q=17.55～39.10,P<0.05)。siRNA转染+X线照射组细胞存活分数显著低于其他各组(F=2870.58,q=15.32～72.51,P<0.05);siRNA转染组及单纯X线照射组细胞存活分数与空白对照组、阴性对照组比较也明显降低(q=11.14～73.90,P<0.05)。结论 pshRNA-survivin-387转染能抑制survivin基因表达,诱导肝癌细胞凋亡,增强肝癌细胞的放射敏感性。     

脂质体介导c-myc反义寡核苷酸诱导HeLa细胞凋亡的实验研究

目的体外研究C-MYC反义寡核苷酸(ASODN)对人宫颈癌HELA细胞凋亡的影响,寻求提高肿瘤细胞放射敏感性的方法。方法免疫组化、流式细胞术、半定量RT-PCR法鉴定ASODN的有效性;GIEMSA染色、流式细胞术检测凋亡指数(AI)、DNA LADDER检测细胞凋亡。结果转染后,免疫组化结果显示C-MYC蛋白表达降低;半定量RT-PCR结果显示C-MYC MRNA表达较空白对照组及阴性对照组明显减弱(P<0.05)。GIEMSA染色可见凋亡小体;流式细胞术结果显示转染后凋亡指数为(10.29±0.66)%,转染ASODN(C-MYC)联合放射的凋亡指数为(16.83±0.57)%,均明显高于空白对照组(1.79±0.19)%(P<0.05);DNA LADDER呈现具有凋亡特征的梯带。结论本实验所设计的ASODN能有效地抑制C-MYC基因的表达;转染ASODN(C-MYC)能够显著增加HELA细胞凋亡,从而提高肿瘤细胞的放射敏感性。     

RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase-3酶活性的影响

目的观察RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase－3酶活性的影响。方法针对survivinmRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建shRNA重组质粒,转染Hela细胞,筛选获得转染效率最高的阳性克隆,阴性对照为阳性克隆随机打乱序列。Westernblot方法检测survivin蛋白表达,分光光度法检测caspase－3酶活性。结果干扰48h时,siRNA－168载体干预组干预效果最好,siRNA阳性质粒干扰组（实验组）survivin蛋白表达量为阴性对照组中survivin蛋白表达量的13％,是空白组survivin蛋白表达量的16％。干扰后caspase－3活性表达升高,实验组与阴性对照组、实验组与空白组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论siRNA可有效抑制Hela细胞survivin蛋白表达。升高caspase－3酶活性。     

Hif-1α RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的：构建hif-1α基因的RNA干扰表达载体pSilencer3.1-hif-1α, 并检测其干扰Hela299细胞hif-1α表达的效率。方法：根据GenBank中hif-1α的mRNA序列, 选择设计3对干扰序列, 构建sihif-1α重组表达载体, 测序正确后经脂质体转染 Hela299 细胞,Trizol试剂盒一步法提取细胞总RNA,应用RT-PCR检测hif-1α的mRNA的表达;单去污剂裂解法提取细胞总蛋白,Western blotting法检测蛋白表达。结果：测序结果显示,测定序列与设计序列完全相同,表明质粒构建正确。转染3个重组pSilencer3.1-sihif-1α表达载体后24 h,Hela299细胞hif-1α 的mRNA水平明显降低,对照组hif-1α /GAPDH 比值为0.55,转染pSilencer-sihif-1α-1组hif-1α /GAPDH 比值为0.13, 两组比值比较差异有显著性(P<0.05),转染pSilencer-sihif-1α-2组hif-1α /GAPDH 比值为0.33,两组比值比较差异有显著性(P<0.05),转染pSilencer-sihif-1α-3组Hif-1α /GAPDH 比值为0.08, 两组比值比较差异有显著性(P<0.01);转染3个重组pSilencer3.1-siHif-1α表达载体后48 h, HIF-1α蛋白的表达水平明显降低。结论：成功构建了Hif-1α基因的siRNA真核表达载体, 该载体可有效抑制Hela299细胞hif-1α的表达。     

LncRNA ABHD11-AS1在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其机制

［摘要］目的： 探讨长链非编码RNA(long non coding RNA,lncRNA)α/β 水解酶结构域蛋白11的反义链1(α/β hydrolase domain containing protein 11 antisense strand 1,ABHD11 AS1)在Erastin诱导的胰腺癌细胞铁死亡中的作用及其潜在机制。方法: 通过GEPIA平台分析ABHD11 AS1在胰腺癌中的表达和患者预后。采用荧光实时定量PCR(qRT PCR)检测人胰腺癌PANC1、MIApaca 2和PaTu8988细胞中ABHD11 AS1表达,CCK8法计算Erastin半数抑制浓度(IC50)。在PANC1细胞中过表达ABHD11 AS1,分别转染pcDNA3.1、pcDNA3.1 ABHD11 AS1质粒;在PaTu8988细胞中干扰ABHD11 AS1表达,分别转染siControl、siRNA1、siRNA2,qRT PCR检测转染效率,分别予以对照(0 μmol/L Erastin)、Erastin(IC50浓度)处理,CCK8法检测细胞活性,ELISA法检测丙二醛和还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;另在pcDNA3-1-ABHD11-AS1和siRNA1组加入Erastin的同时加入铁死亡挽救剂Ferrostatin 1,坏死挽救剂Necrostatin-1或凋亡挽救剂Z-VAD-FMK,CCK8法检测细胞活性;免疫印迹法检测5组胰腺癌细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)以及磷酸化mTOR(p-mTOR)表达水平。结果: 胰腺癌组织中ABHD11-AS1表达水平明显高于癌旁组织,高表达ABHD11-AS1组患者预后较差(P<0.05)。ABHD11-AS1相对表达量由低到高依次是人胰腺癌PANC1、MIApaca 2和PaTu8988细胞,Erasin IC50趋势与ABHD11 AS1表达量相同,依次是2.245、11.760、17.120 μmol/L。与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1 ABHD11 AS1组细胞活性及GSH含量明显增高,而丙二醛含量明显降低(P<0.05);与siControl组相比,siRNA1组和siRNA2组细胞活性及GSH含量明显降低,丙二醛含量明显增高(P均<0.05)。仅Ferrostatin-1可以挽救pcDNA3.1-ABHD11 AS1和siRNA1组细胞活性(P<0.05)。过表达ABHD11 AS1可促进mTOR活化,增强GPX4表达(P<0.05);而干扰ABHD11 AS1则相反。结论: LncRNA ABHD11 AS1可通过活化mTOR促进GPX4表达,从而促进胰腺癌细胞铁死亡抵抗。     

Fas基因转染瘢痕疙瘩成纤维细胞并诱导其凋亡的实验研究

目的探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞抗Fas单克隆抗体(mAb)诱导的凋亡,是否能通过正常Fas基因转染使凋亡率得以提高。方法利用分子克隆技术将人Fas cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入瘢痕疙瘩成纤维细胞,Fas mAb诱导凋亡;通过琼脂糖凝胶电泳、HE染色和流式细胞仪检测瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的情况。结果转基因的瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas mAb作用后,在形态学上出现典型的细胞核固缩、碎裂;琼脂糖凝胶电泳显现特征性的“梯状”带;流式细胞仪检测凋亡率明显增加。对照组未见上述结果。结论瘢痕疙瘩成纤维细胞Fas诱导的凋亡异常,是由于Fas凋亡通道的“上游事件”无功能Fas蛋白造成,与通道下游无关。瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡异常可能是Fas基因突变引起,其与瘢痕疙瘩形成有密切关系。     

Apoptosis of keloid-derived fibroblasts induced by Fas gene transfection]

OBJECTIVE: To observe the effect of Fas gene transfection on the apoptosis of keloid-derived fibroblasts. METHODS: The full-length cDNA of Fas was inserted into the multicloning site of the expression vector pcDNA-3.1 by molecular cloning technique, and the recombinant plasmid was transfected into the keloid-derived fibroblasts via lipofectin. Fas monoclonal antibody (mAb) was used to induce the apoptosis of the cells, which was evaluated with HE staining, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry. RESULTS: The expression plasmid pcDNA-3.1-Fas was constructed successfully. Fas mAb induced apoptosis of these fibroblasts transfected with Fas gene, with the typical features of fibroblast apoptosis observed in the treated cells (e.g. typical apoptotic cell nuclei, DNA ladder and high apoptosis rate as determined by flow cytometer), but not in the control cells. CONCLUSION: Blockage of upstream apoptosis pathway in keloid-derived fibroblasts is due to nonfunction of Fas protein, and mutation of Fas gene may be the pathogenesis of keloids.     

JAB1对缺氧环境肺癌A549细胞化疗敏感性调控的研究

目的观察导入pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒的肺癌A549细胞,在低氧环境下对健择(Gemzar)的化疗敏感性,以期找到一种提高肺癌化疗敏感性的方法。方法首先构建缺氧反应元件启动的pcDNA3.1-HRE-JAB1真核表达质粒,鉴定后将该质粒导入肺癌A549细胞。在低氧环境培养过程中加入化疗药物Gemzar,观察空白组(A549)、空载体组(A549+pcD-NA3.1-HRE)和质粒组(A549+pcDNA3.1-HRE-JAB1)肺癌A549细胞对Gemzar的敏感性。采用Real-time PCR和Westernblot分别检测各组肺癌A549细胞中JAB1的mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术检测各组肺癌A549细胞周期分布和凋亡情况。结果通过双酶切鉴定,确定构建获得了pcDNA3.1-HRE-JAB1质粒。在有化疗药物Gemzar的情况下,质粒组分别与空白组或空载体组比较,质粒组肺癌A549细胞中JAB1mRNA和蛋白表达水平明显增加(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01),而细胞周期被明显阻滞于G1期(P<0.01)。结论 JAB1在低氧环境下高表达提高了药物Gemzar化疗的敏感性,这将可能成为一种理想的提高肺癌或其他实体恶性肿瘤化疗敏感性的手段。     

RNAi cyclin E对肝癌细胞生长的影响

目的:探讨RNAi cyclin E对肝癌细胞生长的影响。方法:肝癌细胞系HepG2采用体外培养,选取siRNA合成双链发卡样DNA;将其重组入pGFP-V-RS得到重组子pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RSsiCE1122;两重组子分别进行DNA序列测定、同源性比较;将两重组子和pGFP-V-Con分别转入人肝癌HepG2细胞中,同时设空白对照组(不转染任何质粒,仅加转染试剂)。检测4组HepG2细胞cyclin E mRNA表达情况及细胞的增殖情况。结果:经过同源性检索和优选确定cyclin E基因的siRNA载体pGFP-V-RSsiCE951和pGFP-V-RS-siCE1122;干扰1组(转染pGFP-V-RS-siCE951)和干扰2组(转染pGFP-V-RSsiCE1122)细胞cyclin E mRNA的相对表达量显著低于空白对照组和无关siRNA对照组(P<0.05);干扰1组和干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较,在3、4、5 d细胞孔内的吸光度值显著减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:siRNA载体pGFP-V-RS-siCE951和pGFP-V-RS-siCE1122转染人肝癌HepG2细胞能显著降低细胞cyclin E基因的表达,是理想的siRNA靶区段。抑制肝癌HepG2细胞cyclin E基因表达,可以降低肝癌HepG2细胞的生长速度。     

LEF-1截短型基因真核荧光表达载体的构建及其在SW480细胞系中的功能研究

目的 构建LEF-1截短型基因的真核表达荧光质粒,在真核细胞中表达,并检测其对人结肠癌细胞系SW480增殖和凋亡的影响.方法 利用PCR方法从人淋巴结cDNA文库中克隆LEF-1截短型的编码基因,插入到真核表达载体pcDNA3.1中,同时插入红色荧光示踪片段mRFP.用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-LEF-1-mRFP瞬时转染Hela细胞,通过Western blot和流式细胞仪检测LEF-1截短型的表达,同法瞬时转染SW480细胞,观察细胞形态变化,MTT检测对细胞生长的影响,CSFE染色检测细胞的增殖情况,Annexin V方法检测细胞凋亡情况,PI染色检测细胞周期.结果 克隆LEF-1截短型的编码基因,经测序比对证实与GenBank中给出的序列一致,以含有LEF-1截短型的编码基因的真核表达荧光载体瞬时转染Hela细胞.LEF-1截短型基因的表达产物通过Westemblot和流式细胞仪方法得到证实,转染SW480细胞.光镜下观察发现部分细胞中出现颗粒,失去正常形态,细胞数目明显减少;MTT检测显示细胞活性下降,流式检测显示细胞增殖受到抑制,凋亡水平增加,细胞在G_(0/1)期发生阻滞.结论 成功构建LEF-1截短型的编码基因的真核荧光表达载体,证实其在真核细胞HeM中可以表达.同时可以抑制SW480细胞的活性和增殖,促进其凋亡,细胞被阻滞在G_(0/1)期,

Abstract：

Objective To construct a eukaryotic fluorescent expression vector of truncated lymphoid enhancer-binding factor 1 (LEF-1) gene and investigate its effect on the proliferation and apoptosis of human colonic carcinoma cell line SW480. Methods Truncated LEF-1 gene was obtained by PCR and DNA recombination from human lymphoid node cDNA library. The PCR product of LEF-1 gene was inserted into the plasmid pMD-18T and sequenced. The truncated LEF-1 gene was inserted into the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 and fused with mRFP for tracing. Using Lipofectamine~(TM) 2000, the plasmid pcDNA3.1 -LEF-1 -mRFP was transfected into Hela cells and detected by Western blotting and fluorescence activated cell sorting (FACS). The changes in the growth, proliferation and apoptosis of the SW480 cells were observed after transfection with the plasmids. Results The truncated LEF-1 gene was successfully cloned. After transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, the Hela cells expressed the product of LEF-1 as detected by Western blotting and FACS. The growth and proliferation of SW480 cells was inhibited and the cell apoptosis increased after transfection with the plasmid pcDNA3.1-LEF-1-mRFP, which also caused cell cycle arrest in G_(0/1) phase. Conclusion The eukaryotic expression fluorescent vector pcDNA3.1-LEF-1-mRFP has been constructed and expressed in eukaryotic cell line successfully. The truncated LEF-1 protein expressed in the transfected SW480 cells results in inhibition of the cell growth and proliferation with increased cell apoptosis and cell cycle arrest in G_(0/1) phase.