乙型肝炎病毒全基因重组真核表达质粒的构建

目的 构建乙型肝炎病毒（HBV）全基因重组真核表达质粒,旨在转染肝细胞,建立HBV复制状态模型。方法 体外连接HBV（ayw亚型）DNA获得6.4kb的双拷贝DNA片段。然后将其插入pcDNA3载体的EcoRV位点。结果 通过聚合酶链反应（PCR）和酶切筛选和验证获得头尾串联双拷贝HBV全基因重组真核表达质粒。结论 成功构建了HBV全基因重组真核表达质粒。     

IL-2/pUC19重组质粒的构建

目的：构建IL－2／pU19重组质粒。方法：从PHA刺激的Jurkat细胞中提取mRNA，经RT－PCR法获取IL－2基因；将克隆质粒pUC19和IL－2基因行BamHI和EcoRI双酶切、低熔点胶纯化、连接酶切产物、转化DH5a感受态细菌、筛选菌落和测序鉴定。结果：电泳获得预期的IL－2条带，测序证实为正确的IL－2序列。结论：应用克隆质粒pUC19可方便高效地构建IL－2／pUC19重组质粒。     

插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss)基因真核表达载体,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础.方法 根据乙肝病毒核心抗原基因序列,设计合成3对引物,在引物中引入分别针对人、鼠敏感的CpG片段和不合CpG的片段.用PCR方法从慢性乙肝患者血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段,将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)连接,构建重组体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),进行酶切、PCR及测序鉴定.结果 乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp.所构建的pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(1ss)重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符;测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pzeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确.结论 成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(Iss).为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础.     

HFRS疫苗接种血清IL—2和IL—6表达的动态观察

检测疫苗接种后血清ＩＬ－２和ＩＬ－６表达情况。方法ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法。结果初次免疫７ｄ与免疫前机体对ＩＬ－２、ＩＬ－６的表达均无差异;再次与加强免疫后与免疫前对ＩＬ２、ＩＬ－６的表达相比较有显著性差异;５６ｄ后检测其ＩＬ－２、ＩＬ－６表达与正常水平。     

HBV—前C区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染2.2.15细胞转？…

目的：探索最佳ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒电穿孔转染２．２．１５细胞的转化条件。方法：构建含ＨＢＶ－前Ｃ区反义基因真核表达重组质粒后,通过控制质粒ＤＮＡ浓度、电压、电容、时间、温度等实验条件进行电转染观察转染细胞生长情况。结果：在电压２１０Ｖ、电容９７５ｕＦ、温度４℃、ＤＮＡ终浓度在０．１２５μｇ／μｌ至０．７５μｇ／μｌ之间时,细胞转染生长情况最佳。结论：上述优化实验条件,可明显提高Ｈ     

恶性疟原虫红内期p41—3基因真核表达重组质粒的构建及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南（FCC1／HN）株p41-3基因真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,测定p41-3基因序列,并了解FCC1/HN株与其它分离株p41-3序列的差异。方法 根据p41-3基因已知序列设计合成3对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增p41-3基因;将p41-3基因定向克隆入真核表达载体pcDNA3,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞;用酶切,PCR扩增鉴定筛选到的重组质粒阳性克隆。以正确的重组质粒为模板,用双脱氧链末端终止法测定p41-3基因序列,应用软件辅助分析p41-3序列及进行同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCC1/HN株p41-3基因;正确的pcDNA3-p41-3重组质粒被筛选和鉴定。测序表明,FCC1／HN株p41-3基因大小为2137bpo,编码375个氨基酸,恶性疟原虫FCC1/HN株与FCBR株p41-3基因核苷酸序列同性为98．98％,编码氨基酸序列同源性为99．73％。结论 从恶性疟原虫FCCl/HN株 基因组DNA中获取p41-3基因,成功构建真核表达重组质粒pcDNA3-p41-3,并测定了FCC1／HN株p41-3基因的序列;FCC1／HN株与其它分离株p41-3基因有高度的同源性。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和序列分析

目的 利用pgenesil-1质粒载体,以bcl-2为靶基因,设计构建重组体,以用于后继的RNA干扰研究.方法 设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切电泳鉴定后,进行测序分析.结果 将合成的DNA片段退火后克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的 序列.结论 靶向bcl-2基因转录shRNA的重组质粒可以在体外成功构建,为下一步利用该重组体干扰肿瘤细胞中bcl-2的mRNA转录,探索肿瘤基因治疗的新途径打下基础.     

乙型肝炎患者血清IL—2,IL—6及SIL—2R的检测意义

本文用酶联免疫吸附实验（Ｅｌｉｓａ）检测了８７例乙型肝炎各型患者及２１例乙肝病毒携带者血清中白细胞介素２（ＩＬ－２）、白细胞介素６（ＩＬ－６）、可溶性白细胞介素２受体（ＳＩＬ－２Ｒ）水平。结果如下：乙型肝炎各型患者及健康携带者的ＩＬ－６水平均明显高于正常对照（Ｐ〈０．０５）；急性肝炎（ＡＨ）、慢性活动性肝炎（ＣＡＨ）、肝硬化（ＬＣ）、重症肝炎（ＦＨ）血清ＩＬ－２明显低于正常对照（Ｐ〈０．０５）；Ｓ     

以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建

目的：构建以HBV HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒，以探讨HBV基因免疫的新途径。方法：PCR扩增HBc第1－72aa及93－183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheI/XhoI位点，构建真核表达载体pHBcdM。合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点，构建HBc-Mep融合基因真核表达质粒。经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒。结果：双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因。结论：成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc-Mep，为研究pHBc-MeP作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。     

PTEN基因真核表达载体重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码肿瘤抑制基因PTEN的正义与反义真核表达重组载体并进行其序列测定．方法 新鲜胎盘组织抽提基因组RNA；根据基因库PTEN基因序列分别设计合成三对反义引物及一对正义引物，采用RT-PCR法扩增编码PTEN的基因片段；将PTEN基因定向克隆到pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达载体，筛选阳性重组子并鉴定；对重组子进行序列测定。结果RT-PCR所扩增的PTEN基因片段为241，239，227bp(反义)及1209bp(正义)，表明所克隆的基因为编码PTEN的基因片段。结论 成功构建编码肿瘤抑制基因PTEN的pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达质较pcDNA3．1／Hygro(—)PTEN。     

赖型钩体flaB2与VR1012中的CpG基序分析

目的：对问号赖型钩端螺旋体（赖型钩体）DNA疫苗[包括内鞭毛蛋白基因（flaB2)和质粒DNA表达载体（VR1012）]的CpG基序（CpG motifs)进行分析，为DNA疫苗免疫机制的阐明和提高DNA疫苗的效能奠定基础。方法：以flaB2与VR1012构建重组DNA的免疫原，对flaB2及VR1012全核苷酸序列进行计算机分析（分类、计数和定位）。结果：CpG的“C”的侧翼为两个嘌呤，“G”的侧翼为两个嘧啶，在flaB2中共3个，分别为GACGCT，GACGTC和GACGCC；在VR1012中共11个，分别为GACGTC1个，GACGCT2个，GACGCC1个，GACGTT1个，GGCGTT2个，GGCGCT2个，GGCGCC1个，AACGCT1个，其中特别重要的TGACGTCA4个和TAACGCCA有1个，位于5'端456－463；509－516；592－599；778－785和486－493；4个TGACGTCA和1个TAACGCCA均位于5'端且相对集中。结论：赖型钩体flaB2与VR1012构成的DNA疫苗含有TGACGTCA等CpG，这些基序又称免疫刺激序列，构成了DNA疫苗中的佐剂。     

硫代修饰的CpG基序及IL一2表达质粒对癌胚抗原DNA疫苗诱导抗体的影响

目的　探讨增强癌胚抗原DNA疫苗在BALB/c小鼠体内诱导的体液免疫应答的方法。方法　将合成的、经硫代修饰的CpG基序和IL - 2表达质粒分别作为免疫刺激剂与癌胚抗原 (CEA)DNA疫苗一起肌肉注射小鼠 ,ELISA法检测动物体内产生CEA和抗 -CEA的水平。结果　单独以CpG基序或IL - 2表达质粒做免疫刺激剂均不能增加CEA的表达 ,但都能促进抗 -CEA的产生 (P <0 .0 5 )。结论　CpG基序和IL - 2表达质粒对DNA疫苗产生抗体有促进作用     

食管癌相关基因2原核表达质粒的构建与诱导表达

目的：构建食管癌相关基因2（ECRG2）原核表达质粒，在大肠杆菌（E．coli）中诱导表达重组蛋白。方法：用聚合酶链反应法扩增ECRG2基因开放阅读框（ORF），构建表达载体pGDX-4T-1-ECRG2，测序鉴定后转化E．coli（BL21）进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，目的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、Western免疫印迹鉴定。结果：SDS-PAGE测定GSr／ECRG2蛋白分子质量约34ku，Western blot验证出目的蛋白特异表达。结论：ECRG2ORF插入pGEX-4T-1质粒并在E．coli中成功表达。     

HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的 观察HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞株HepG2细胞内表达情况。方法 将构建的HBc与HBV多表位复合基因真核表达质粒pHBcMep以Lipofectamine介导转染HepG2细胞，通过间接免疫荧光、Western-blot检测表达产物。结果 经G418筛选的阳性转染细胞经间接免疫荧光染色后在紫外光激发时发出明显的荧光，而末转染质粒或转染pcDNA3．1的HepG2细胞则无明显荧光。Western-bot结果显示表达产物约为33kDa，并能与抗preS2多抗特异性结合。结论 HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞内获得正确表达。     

日本血吸虫抗独特型抗体NP30重链6×CDR3/IL-2融合基因构建及表达

目的:构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30重链可变区6×CDR3基因/IL-2融合基因,以观察其对动物的抗血吸虫感染保护作用。方法:通过PCR方法体外扩增NP30 6×V_HCDR3和IL-2基因,经测序后先后重组入原核表达质粒pET-28a(+)相应的位点上,将构建正确的6×V_HCDR3/IL-2-pET-28a(+)表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导表达。结果:构建的6×V_HCDR3/IL-2融合基因中,6×V_HCDR3和IL-2序列均正确,融合基因经IPTG诱导表达重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析分子质量约为30ku,表达量约占菌体总蛋白的20％。结论:成功构建并原核表达了NP30 6×V_HCDR3/IL-2融合基因。     

HSV-tk和H60基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的：构建携带自杀基因HSV-tk和免疫相关基因H60的逆转录病毒载体pIRKS-H60、pIRES-TK和pTK-IRES-H60。方法;以质粒pUC19-H60为模板,用PCR方法扩增H60基因,并亚克隆至pMD18-T载体,构建中介载体pMD18-H60。双酶切质粒pMD18-H60和tgCMV／HyTK,获得H60和TK基因片段,再克隆至逆转录载体pIRES,构建重组载体pIRES-H60和pIRES-TK。然后把HS0基因片段克隆至载体pIRES-TK,构建重组载体pTK-IRES-H60。转染重组载体至包装细胞PA317进行病毒包装,用病毒液感染NIH3T3细胞,检测病毒液的滴度。结果：测序结果显示PCR扩增的H60基因序列正确,重组载体经PCR和酶切鉴定得到相应的基因片段。经筛选得到稳定的产病毒细胞株PA317／pIRES-H60、PA317／pIRES-TK和PA317／pTK-IRES-H60,病毒滴度分别为8×10^4、1×10^5、7．1×10^4cfu／mL。结论：成功构建逆转录病毒载体pIRES-H60、pIRES-TK和pTK-IRES-H60,建立了稳定的病毒细胞株,所产生的假病毒颗粒具备一定的感染力。     

沉默信息调节蛋白6基因重组腺病毒的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的:构建高表达小鼠沉默信息调节蛋白6(SIRT6)基因的重组腺病毒Ad-SIRT6,并在HepG2细胞中验证其表达。方法:通过PCR获取SIRT6基因编码序列,克隆入pAd-Track-CMV载体质粒中;将重组质粒PmeⅠ线性化处理后与腺病毒骨架质粒pAdEasy共同电转入大肠杆菌BJ5183中,获得Ad-SIRT6质粒pAd-SIRT6;用PacⅠ线性化处理后,转染Ad293细胞,包装获得Ad-SIRT6。用该病毒感染HepG2,进行RT-PCR及Western blot验证目的基因的表达。结果:pAd-Track-CMV-SIRT6测序结果正确;pAd-SIRT6转染Ad293后,扩增并纯化得Ad-SIRT6;转染HepG2后,经RT-PCR及Western blot验证,可表达外源性SIRT6基因,且SIRT6总蛋白表达量增高(P<0.05)。结论:成功构建可高表达SIRT6基因的Ad-SIRT6,为进一步研究SIRT6基因在肝糖脂代谢中的作用机制奠定了基础。     

前列腺特异性膜抗原启动子增强子调控UPRT基因真核质粒的构建及表达

目的 构建前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达重组质粒(pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)。方法 采用PCR技术从大肠杆菌JMpPSMAenhaocer／promoter-UPRT109基因组中扩增UPRT基因，通过分子克隆技术将其克隆到包括前列腺特异性膜抗原启动子增强子靶向性调控的pEGFP-1的质粒。利用重组质粒pPSMAenhaocer／promoter-UPRT)转染LNcap细胞，MTT法检测5-氯尿嘧啶(5-FU)对转染LNcap细胞存活率的影响。结果 质粒pPSMAenhaocer／promoter-EGFP双酶切去除EGFP，连接上UPRT基因，成功构建pPSMAenhaocer／promoter-UPRT,并转染LNcap细胞。使LNcap细胞对5-FU的杀伤敏感性大大提高。结论 pPSMAenhaocer／promoter-UPRT的构建和表达，为进一步研究UPRT基因对5-FU的靶向性杀伤前列腺癌细胞增强作用和对前列腺癌自杀基因系统(CD／5一FC系统)的放大效应奠定了基础。     

白细胞介素2基因的表达及热休克对它的影响

研究人外周血T淋巴细胞中白细胞介素2(IL-2)mRNA的表达和分泌IL-2的活力,实验结果表明植物血凝素(PHA)单独诱导IL-2的能力很弱,诱导过程较长;加入促癌剂12-0-十四酰佛波-13-乙酯(TPA)后能诱导IL-2的早期转录,并增强16h后PHA诱导的转录作用和培养细胞的上层液中IL-2的活力。45℃,10min的热休克不影响IL-2的诱导合成。在分析、比较PHA,TPA和/或热休克影响的基础上,对T淋巴细胞激活过程中IL-2基因表达的调控机制进行了讨论。