肿瘤坏死因子—α预刺激培养成熟树突状细胞

目的 利用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导树突状细胞(DC)成熟的作用原理培养成熟DC的新方法。方法Ficoll密度梯度离心分离健康人外周血获得单个核细胞，用含有10％胎牛血清的RPMI640培养基培养。TNF-α预刺激4h后加入粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)及IL-4，48、96h再次同时加入上述3种细胞因子并继续培养，第8—10天收集细胞，记作T—DC。FCM检测FDC表型，用^3H-TdR检测同、异基因混合淋巴细胞反应(MLR)及抗原提呈功能；MTT法检测FDC诱导T细胞的杀伤活性。结果 T—DC表达CD83、CDla、CD54、CDlla、CD80、CD86、HLA—DR、CD83HLA—DR并能刺激T细胞增殖与MLR（同基因、异基因)反应；T—DC具有抗原提呈功能、可诱导特异性杀伤。结论 用TNF-α预刺激4h的方法并在含有GM—CSF、IL-4的完全培养基中培养人外周血单核细胞8d可获得成熟的DC。     

人类系统性红斑狼疮血清对内皮(逆)穿越模型中树突状细胞表型成熟的影响

目的：研究人类系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)血清对正常人单核细胞(monocyte，Mo)分化形成的树突状细胞(dendritic cell，DC)的表型成熟的影响。方法：分离正常人外周血单个核细胞(PBMC)，加入内皮细胞穿越模型中，分别以正常人血清和SLE血清加入培养体系中，36h后收集2次穿越内皮单层得到的，经形态学鉴定的DC细胞，流式细胞术测DC的CD80、CD86、HLA—DR的表达情况。结果：SLE血清诱导的DC其CD80的表达水平明显低于正常人血清刺激组，而二者均高表达CD86、HLA—DR。结论：DC的表型成熟和血清环境有一定关系。     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞及鉴定

目的：建立体外从健康成人外周血单核细胞（Mo）诱导培养成熟的树突状细胞（DE）的方法。方法：采用连续贴壁法分离正常人外周血单核细胞,在GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养。培养5天后收集细胞,重新铺板后继续在TNF-α的完全培养基中培养48小时后,收集细胞和上清液,采用流式细胞术检测DC表型CD80、CD83、CD40的表达;用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-12的浓度;用倒置显微镜动态观察DC形态变化。结果：采用连续贴壁法和用GM—CSF、IL-4和TNF—α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞,且高表达CD80、CD83、CD40,表达率分别为84．29％、90．73％、92．38％。DC分泌的细胞因子IL-12浓度为38．52±11．34pg／ml。结论：采用连续贴壁法和用GM．CSF、IL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养大量的树突状细胞,检测表型CD80、CD83、CD40的表达率和细胞因子IL-12浓度可以鉴定树突状细胞。     

HBV S-ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞功能的影响

目的探讨HBVS—ecdCD40L融合基因修饰对树突状细胞（DC）功能的影响。方法分离健康成人外周血单个核细胞,GM—CSF、IL-4诱导培养树突状细胞,培养第5天,以脂质体介导转染,分为pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组、pcD—NA3．1-S转染组、pcDNA3．1转染组及PBS对照组。转染48h收集DC及上清,流式细胞仪检测DC表面CD80、CD86、HLA—DR表达水平;CCK-8法检测混合淋巴细胞反应（MLR）中DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测IL-12的分泌水平。结果与对照组比较,pcDNA3．1-S—ecdCD40L转染组DC表达CD80、CD86、HLA—DR水平增加,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强,分泌IL-12水平增高。结论HBVS—ecdCD40L融合基因修饰能促进DC活化。增强DC功能,将CD40L胞外段基因与HBV抗原基因融合可能是增强乙肝疫苗免疫效果的有效方法。     

IL-4,GM-CSF体外诱导猪单核来源树突状细胞和功能鉴定

目的探讨体外大量培养扩增猪外周血单核细胞来源DC（monocyte—derived DC,MoDC）,对细胞表型,免疫学功能及生物学活性进行鉴定。方法提取猪外周血单核细胞（PBMC）,经GM—CSF和IL-4诱导,体外培养5-8d,得到悬浮的MoDC,培养第5天加入浓度为1μg/ml的LPS诱导成熟。通过倒置相差显微镜下观察MoDC细胞形态,流式细胞术检测表面CD80／86,SLA-II,CD172a等分子表达,BrdU法测定混合淋巴细胞培养MoDC对同种异体T细胞的刺激能力,ELISA法检测MLR上清液中IFN—γL-4水平。结果IL-4／GM—CSF刺激猪PBMC,可以获得MoDC,其表型为CD1^＋CD14^＋CD172a^＋CD80／86^＋SLA—II^＋,经LPS刺激后CD80,CD86,SLA—II表达升高。结论应用细胞因子诱导猪PBMC成功获得了MoDC,为今后进一步研究移植耐受诱导和应用于异种移植打下基础。     

人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定

目的：建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞（dendritic cell,DC)的方法。方法：分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,白细胞介素－4（IL－4）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导培养获得DC,电镜及共聚集显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果：从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重且人GM－CSF,IL－4,TNF－α的共同诱导培养,得到大量成熟DC,形态学观察可见典型DC特征,荧光激少在细胞分离器（FACS）检测表明,诱导的DC高表达HLA－DR（96％）,CD83（94．2％）,CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40（97．7％）,CD80（98．2％）分子,同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能。     

四种细胞因子组合从小鼠骨髓细胞体外诱导优势不成熟CD8a＋DC

【目的】探索从小鼠骨髓细胞体外诱导大量优势不成熟CD8a＋DC（DC2）的新方法。【方法】取小鼠骨髓细胞，采用GM—CSF5ng／mL，IL-420ng／mL，Fh3L25ng／mL，SCF100ng／mL4种细胞因子组合，37℃，5％CO2体外培养诱导。第3、7、16天流式细胞术4色荧光标记法分析细胞表型，细胞计数分析总细胞产量，采用电镜、免疫荧光及相差摄影观察细胞形态。【结果】小鼠骨髓细胞经GM—CSF＋IL-4＋Flt3L＋SCF诱导第3天在CDllc＋的DC细胞群中可产生97．09％的CD8a＋优势DC2细胞（占总细胞的34．6％），其中CD8a＋MHCⅡ-的不成熟DC占61．77％：随培养时间延长比例下降．但培养第16天时CD8a＋的不成熟DC仍占优势。总细胞计数分析显示随培养时间延长，细胞总数下降。电镜、免疫荧光及相差摄影等形态学检查显示所诱导的DC呈现典型树突状形态特征。【结论】GM—CSF＋IL-4＋Fh3L＋SCF可以体外快速诱导小鼠骨髓细胞产生大量优势不成熟CD8a＋DC．是体外制备不成熟DC2的一种较好的新方法。     

人外周血树突状细胞的诱导及其对自身T细胞的激发作用

目的 体外诱导和扩增树突状细胞(DC)并分析其对自身T细胞的激发作用。方法 正常人外周血单个核细胞经贴壁去除悬浮细胞，加入细胞因子(IL—4、GM—CSF和TNF—α)培养8天。用流式细胞仪分析细胞表型，用ELISA测定培养上清中IL—12的含量，将诱导的树突状细胞与自身T细胞混合培养用^H—TdR法测定细胞的增殖指数。结果 正常人外周血诱导的树突状细胞高表达分化抗原CDla(89．1％)、CD40(99．8％)、CD80(95．1％)、CD83(45．7％)、HLA—DR(97．6％)，同时所获的比能分泌IL—12和有效地激活自身T细胞，并促其增殖。结论 正常人外周血的单个核细胞经细胞因子的序贯培养，可获得高纯度、功能性的DC细胞。     

Gamma射线照射对体外培养人树突状细胞表型的影响

目的：了解Gamma射线照射是否影响体外培养的人树突状细胞的表型。方法：利用含有重组的人GM－CSF（800U／ml)和IL－4（500U／ml)的RPMI 1640培养基从人的外周血单个核细胞（PBMC）诱生树突状细胞（DC）。在培养的第6d加入5mg/L的脂多糖（LPS）继续培养24h促使DC完全成熟，于第7d收获DC并分成2部分，一部分未经Gamma射线照射的DC用作对照组，另一部分的DC用30Gy剂量的Gamma射线照射。采用流式细胞仪分析DC的表面分子。结果：Gamma射线照射减少树突状细胞CD86，CD80和HLA－DR，尤其是CD86分子的表达（P＝0.0072)。结论：Gamma射线照射影响DC的表型。     

多西环素对树突状细胞功能的影响

目的探讨多西环素对树突状细胞的免疫表型和功能的影响。方法采集健康人的外周血,密度梯度离心法获得外周血单个核细胞,用rhIL-4和rhGM—CSF诱导分化为树突状细胞,通过LPS诱导树突状细胞成熟。树突状细胞诱导成熟过程中向培养基中分别加入0μg／mL、100μg／mL和300μg／mL的多西环素,通过流式细胞术检测树突状细胞表面HLA—DR、CD83和CD80的表达,用ELISA检测树突状细胞分泌TNF—α、IL-6、IL-12和IL-10,与T细胞共培养检测刺激同种异型T细胞的增值能力。结果与对照组相比,100ng／mL和300ng／mL多西环素处理组诱导树突状细胞表达HLA—DR表达下调。多西环素可下调树突状细胞分泌IL-1B、IL-12、TNF-α和IL-6,也可抑制树突状细胞刺激同种异型T细胞增殖,并呈剂量依赖性。结论多西环素作用于树突状细胞成熟过程,导致树突状细胞下调HLA-DR的表达,抑制树突状细胞分泌IL-1B、IL-6、IL-12和TNF—α,下调其刺激同种异型T细胞的增值能力。     

系统性红斑狼疮患者血清中IL-10抑制抗原递呈细胞表面HLA-DR和CD80的表达

目的:研究系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus,SLE)患者血清中的IL-10对正常单核细胞分化形成的树突状细胞(dendriticcells,DCs)及其前体单核细胞抗原递呈相关膜表面分子表达的影响。方法:分离正常人外周血单个核细胞(PBMC),并采用GM-CSF IL-4方案诱导分化形成DCs,在此过程中加入不同IL-10水平的SLE患者血清或混有IL-10中和抗体的SLE患者血清,联合培养7天后收集细胞,经形态学鉴定,以流式细胞术检测HLA-DR、CD80、CD86的表达。结果:在SLE血清的作用下,DCs的HLA-DR、CD80的表达下调,CD86表达不受影响;中和SLE血清中的IL-10后,HLA-DR、CD80表达能够恢复。其前体细胞单核细胞的HLA-DR、CD80的表达也可被SLE血清下调,用中和抗体中和IL-10后,其表达可部分恢复。结论:高IL-10水平的SLE血清能够抑制DCs及其前体单核细胞表面分子HLA-DR、CD80的表达,对抗原递呈细胞的功能可能产生影响。     

Effect of Interferon-alpha in systemic lupus erthematosus (SLE) serum on the differentiation and maturation of dendritic cells derived from CD34+ hematopoietic precursor cells

Objective: To study the effect of interferon-alpha IFN-α in the serum of SLE patients on the differentiation and maturation of dendritic cells (DCs) derived from CD34+ hematopoietic precursor cells (HPCs). Methods: Serum samples from SLE patients and normal controls were collected and the concentration of IFN-α detected by ELISA. CD34+HPCs were purified from cord blood by a magnetic cell sorting system (MACS), and cultured to differentiate to DCs. Normal serum, normal serum with exogenous IFN-α, SLE serum with raised levels of IFN-α, or SLE serum with anti-IFN-α neutralizing antibody was added to the culture medium. The phenotype of DCs was analyzed by flow cytometry (FCM) and the capacity of DCs to stimulate allogenic T lymphocyte proliferation was evaluated in a mixed lymphocyte reaction by the Cell Counting Kit-8. Cytokine production was assessed by ELISA. Results: Serum levels of IFN-α were significantly higher in SLE patients than in normal controls and this correlated positively with disease activity. Cultured in SLE serum with raised levels of IFN-α, CD34+ HPCs could differentiate into DCs that expressed higher levels of HLA-DR, CD80 and CD86, and showed an enhanced allogenic T-cell stimulatory capacity, while producing lower levels of IL-12 and higher amounts of IL-10 compared with those DCs cultured in normal serum. Conclusion: Increased levels of IFN-α in SLE serum promotes the differentiation and maturation of DCs derived from CD34+ HPCs and could contribute to the pathogenesis of SLE.     

三氧化二砷对系统性红斑狼疮患者外周血成熟和分化的影响

目的：观察不同浓度三氧化二砷（ATO）对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血体外培养树突状细胞分化成熟和功能的影响,探讨其作用机制,初步阐明DC是否为ATO治疗SLE的作用靶点。方法：分离SLE患者外周血单个核细胞,用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）、白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）细胞因子诱导DC成熟,加入不同浓度ATO培养。培养第9d收集DC细胞,流式细胞仪检测CD80、CD86和HLA-DR的表达。MTT法检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力,ELISA法检测混和淋巴细胞反应培养上清IL-10和IFN-γ水平。结果：1.ATO处理后的DC表达CD80、CD86和HLA-DR百分数较对照组明显降低,P均〈0.05,且随ATO浓度的增加DC表达CD80、CD86和HLA-DR百分数降低;2.ATO处理后的DC与T细胞混合培养,其刺激T细胞增殖相应的OD值较对照组明显降低,且随浓度增加降低越明显。3.其混合培养的上清液中IL-10水平较无ATO处理的DC与T细胞的混合培养上清液明显降低,P〈0.05,而IFN-γ水平无统计学差异,P〈0.05结论：ATO在体外可抑制SLE患者外周血DC的成熟,未成熟DC能抑制T细胞增殖及T细胞向Th2细胞转化,从而纠正SLE患者的部分免疫紊乱。     

人外周血树突状细胞的诱导与鉴定

目的：体外诱导、培养人外周血单核细胞获得不同成熟阶段的树突状细胞（DCs）。方法：用贴壁法从健康人外周血浓缩白细胞获取单核细胞,第一阶段在GM-CSF+IL-4存在的条件下培养7 d,获得未成熟DCs;第二阶段在GM-CSF+TNF-α联合诱导下培养至14 d,获得成熟的DCs。对DCs的形态进行显微镜下观察,用流式细胞仪检测其表型,用MTT的方法对DCs的功能进行检测。结果：获得的未成熟DCs中度表达CD1a、共刺激分子,高表达HLA-DR分子,在DCs的成熟期共刺激分子、HLA-DR及CD83、CD25分子均高度表达,刺激同种异型T淋巴细胞增殖的能力强。结论：成功地建立了诱导人外周血单核细胞获得不同发育阶段DCs的方法,并获得了大量纯度较高的DCs。     

当归多糖促进慢性粒细胞白血病细胞性树突状细胞的诱导生成

目的 探讨当归多糖(APS)对慢性粒细胞白血病细胞诱导生成树突状细胞(DCs)的影响。方法 取慢性粒细胞白血病(CML)患者骨髓单个核细胞，分别予粒-巨噬集落刺激因子(GM—CSF)／白介素-4(IL-4)培养或GM-CSF／IL-4联合各浓度APS(50，100，200mg／L)培养，普通光镜和电镜观察细胞形态，台盼蓝拒染法检测细胞成活率，流式细胞仪检测DCs的免疫表型(CD80，CD86，CD83)，自体或异体混合淋巴细胞反应检测DCs刺激T淋巴细胞的增殖能力。结果GM-GSF/TL-4或GM-CSF，IL-4／APS诱导培养的慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞均表现出典型的树突状形态而且表达高水平的免疫表型。GM-CSF／IL-4／APS培养的DCs的细胞成活率和增殖能力显著提高，CD83，CD80，CD86表达显著升高，APS组慢性粒细胞白血病细胞诱导的树突状细胞(CML-DCs)刺激T淋巴细胞的增殖能力更强。结论 GM-CSF/IL-4/APS培养的DCs的CD83，CD80、CD86表达率明显高于GM-CSF／IL-4组。GM-CSF／IL-4／APS诱生的CML-DCs刺激T淋巴细胞增殖能力强于GM-CSF／IL-4组。APS能促进IL-4和GM-CSF对CML-DCs的诱生与成熟。     

神经生长因子在诱导树突状细胞分化中的作用

目的：在体外探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)在刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cells,DCs)分化过程中的作用。方法：首先取C57BL/6小鼠股骨、胫骨骨髓细胞,按培养过程中干预因素不同分为 磷酸盐缓冲液(phosphate buff ered saline,PBS)刺激组(PBS组,n=6)、NGF刺激组(NGF组,n=6)、粒巨噬细胞集落刺激 因子(granulocyte monocyte colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4共刺激组(GM-CSF+IL-4组,n=6)、NGF加GM-CSF和 IL-4共刺激组(NGF+GM-CSF+IL-4组,n=6),培养第7天采用流式细胞仪比较各组间CD11c+细胞阳性率和CD8a−亚型比 例;然后用GM-CSF+IL-4刺激培养未成熟的DCs,经CD11c免疫磁珠阳性分选得到纯化的未成熟DCs,将其分为PBS组 (n=6)、NGF组(n=6)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组(LPS组,n=6)、NGF+LPS组(n=6),分别用PBS,NGF,LPS, NGF+LPS诱导细胞成熟,24 h后酶联免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测上清液中IL-6, IL-10和IL-12的水平。结果：1) NGF组CD11c+DCs百分比高于PBS组,低于GM-CSF+IL-4组(均P<0.05);GM-CSF+IL-4 组与NGF+GM-CS F+IL-4组间比较,差异无统计学意义(P>0.05),且在4组中均以CD8a−DCs为主;2)NGF可以增强 LPS诱导的DCs分泌IL-6,IL-10和IL-12(均P<0.05),而单独NGF刺激对DCs分泌IL-6,IL-10和IL-12无影响(均P>0.05)。 结论：NGF可以诱导小鼠骨髓细胞向CD11c+DCs的定向分化,并且以CD8a−亚型为主;NGF能增强LPS诱导的DC分泌 IL-6,IL-10和IL-12。     

二十二碳六烯酸对人外周血树突状细胞成熟的影响

目的探讨二十二碳六烯酸(DHA)在体外对人外周血来源树突状细胞(DCs)成熟状态及免疫学功能的影响。方法经淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心法分离出单个核细胞,用含rhGM-CSF和rhIL-4培养液诱导5d,获得未成熟DCs,并分为4组:未成熟组、成熟组、DHA组和饱和脂肪酸(SA)组。经DHA孵育24h,内毒素脂多糖(LPS)作用48h,于第8天,Wright-Giemsa染色观察各组DCs形态;流式细胞仪检测表型,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测DCs共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR mRNA的表达;ELISA检测各组细胞上清液中IL-12及TNF-α的含量。结果 DHA组细胞上清液IL-12和TNF-α的含量比成熟组低(P<0.01),而SA组与成熟组比较差异无统计学意义(P>0.05)。DHA干预下平均荧光强度呈明显下调。成熟组CD80、CD86及HLA-DR mRNA相对表达量比未成熟组高(P<0.01);DHA组比成熟组低(P<0.01);而SA组与成熟组相比无差异(P>0.05)。结论 DHA可下调DCs共刺激分子CD80、CD86及HLA-DR的表达,降低IL-12及TNF-α的释放,减弱DCs的抗原提呈能力,且可抑制DCs体外成熟。     

体外诱导培养人树突状细胞的生物学特性及其神经免疫调节功能分析

目的研究人表皮树突状细胞在皮肤的免疫反应和疾病发生发展过程中的作用。方法取胎儿脐带血分选单核细胞,在体外用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4(IL-4)进行定向诱导分化,培养树突状细胞(MoDC),观察培养细胞在不同阶段的变化;用流式细胞仪分析诱导分化细胞的细胞膜表面标志性抗原HLA-DR、CD1 a和CD80的表达;对诱导分化的细胞分别给予脂多糖体(LPS),LPS和降钙素相关基因肽(CGRF)和单纯CGRF刺激,检测不同处理后MoDC表达IL-12 mRNA变化。结果脐带血干细胞在体外诱导分化培养第7天呈现明显树突状分支,并可检测到HLA-DR和CD1 a分子的表达。结论CGRP对MoDC表达IL-12 mRNA的调节有双重性。