壳糖体外介导血管平滑肌细胞内皮型一氧化氮合酶基因转移的初步研究

目的探讨壳糖作为非病毒载体介导质粒体外转染哺乳动物平滑肌细胞的可行性、转染效率及影响转染效率的因素。方法用壳糖包被携带绿色荧光蛋白(GFP)基因和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的质粒PAdTrack-CMV-eNOS,制备壳糖/质粒复合体(CPC-eNOS),在不同条件下将其和Wistar大鼠血管平滑肌细胞孵育,通过检测靶细胞是否表达GFP和eNOS,评价壳糖介导质粒转染的效率。并以裸质粒PAdTrack-CMV- eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS分别作为对照。结果荧光显微镜下472nm观察,CPC-eNOS和重组腺病毒表达载体Ad-eNOS孵育的血管平滑肌细胞均观察到绿色荧光,Western印迹法检测均有eNOS蛋白表达,但裸质粒PAdTrack-CMV-eNOS组均为阴性。CPC-eNOS中氨基/磷酸基比值(N/P比值)为5、pH值为7.0时,对平滑肌细胞的转染效率最高。结论CPC-eNOS能够体外介导转染哺乳动物的血管平滑肌细胞。转染效率与CPC-eNOS的N/P比值和转染介质pH值有关。     

聚乙烯亚胺介导水通道蛋白5基因表达载体体外转染的研究

目的 探讨新型阳离子载体聚乙烯亚胺(PEI)介导水通道蛋白5(AQP5)体外转染人肺腺癌细胞系A549的效果。方法 将含绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1,以lipofectamine2000为阳性对照,流式细胞仪检测转染效率,根据不同N/P比(5、10、15、20、25)与PEI组成转染复合物转染A549细胞,优化最适 N/P比;将AQP5全长cDNA插入pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N-AQP5,转染A549细胞,采用PCR与Western blot法检测被转染细胞中AQP5的表达。结果 流式细胞仪检测GFP发光率,N/P比为15时PEI/pEGFP-N1复合物转染效率最高,可达到89.72%,与脂质体91.44%相近;应用PEI与lipofectamine2000将 pEGFP-N-AQP5成功转染A549,与空白组比较,AQP5的基因及蛋白表达均增高。结论 新型阳离子载体PEI 可成功介导pEGFP-N-AQP5转染A549细胞。     

聚乙烯亚胺/DNA复合物处方工艺优化及体外转染效率

目的:考察聚乙烯亚胺(PEI)相对分子质量、氮磷比(N/P比)、溶剂、离子强度等对PEI/DNA复合物形成、表面性质以及细胞转染效率的影响。方法:制备不同相对分子质量PEI/DNA复合物,通过凝胶电泳和紫外吸收检测确定PEI与DNA的复合能力(N/P比),测定不同溶剂、离子强度下的粒径和Zeta电位,考察复合物在HepG2细胞中的转染情况。结果:PEI与DNA的复合能力与PEI的相对分子质量呈正相关,不同溶剂、离子强度会影响复合物的表面性质,以磷酸盐缓冲液(PBS)为溶剂、PEI(25kD)为载体、N/P比为12～15时,PEI/DNA复合物细胞转染效率明显优于质粒DNA,仅略低于阳性对照组。结论:经优化的PEI/DNA复合物可显著提高DNA在细胞中的转染效率。     

多聚乙烯亚胺介导肿瘤细胞基因转染

目的:利用阳离子多聚物多聚乙烯亚胺(PEI)纳米凝胶将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)转入同步化的肿瘤细胞中并检测绿色荧光蛋白的表达率,探讨PEI作为载体介导肿瘤细胞基因转染中细胞周期对转染效率的影响?方法:通过6 MV X线照射及药物阻滞使Hela及A549细胞同步化,在5个PEI/DNA梯度比(2/2?4/2?6/2?8/2?10/2 ?滋g/?滋g)下利用PEI介导EGFP报告基因转染进入上述同步化细胞,流式细胞仪和荧光显微镜下测定绿色荧光蛋白表达率,通过梯度试验分析细胞周期时相与表达率之间的关系?结果:在不同增殖状态及PEI/DNA比值梯度下,一定剂量-时间的X射线和顺铂可以使Hela细胞同步化于S期,一定剂量-时间的艾素可以使A549细胞同步化于G2/M期,而血清饥饿法培养则可以使细胞阻滞于G0/G1期,在不同细胞周期时相下EGFP的转染效率不同,两种同步化细胞均表现出S期及G2/M期细胞的转染率显著高于对照组(P < 0.05)和G0/G1期细胞(P < 0.0001)?结论:PEI导入基因的表达效率受细胞周期制约,PEI介导的基因转染受到宿主细胞摄取?转运入核及转录能力的影响,而该进程都是细胞周期依赖性的?     

新型非病毒纳米基因载体PEI-β-CyD对软骨细胞和骨髓间充质干细胞转染有效性评估

目的评估新型非病毒纳米基因载体聚乙烯亚胺-β-环糊精(PEI-β-CyD)对软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2转染的有效性。方法体外培养软骨细胞系C5.18和骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2,MTT法观察并比较PEI-β-CyD和相对分子质量为25 000的聚乙烯亚胺(PEI25KDa)对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性。在不同的N/P(载体有效氮含量/外源基因有效磷含量)复合条件下,利用PEI-β-CyD和PEI25KDa分别转染C5.18细胞和C3H10T1/2细胞,倒置荧光显微镜结合流式细胞仪分析转染效率。结果 PEI-β-CyD对C5.18细胞和C3H10T1/2细胞的细胞毒性均小于PEI25KDa。PEI-β-CyD与PEI25KDa对C5.18细胞的转染效率比较,差异无统计学意义(P>0.05);PEI-β-CyD对C3H10T1/2细胞的转染效率显著高于PEI25KDa(P<0.05)。结论 PEI-β-CyD对于软骨细胞系C5.18及骨髓间充质干细胞系C3H10T1/2是一种低毒有效的非病毒纳米基因载体,在软骨组织工程和细胞治疗研究及应用领域具有良好...     

分枝状聚乙烯亚胺对不同细胞系的转染效率和细胞毒性作用

目的探讨分支状聚乙烯亚胺(PEI)作为载体对不同细胞株的转染效率和细胞毒性。方法培养人类胚胎肾细胞293T、人上皮癌细胞Hela、小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12。悬浮转染p EGFP质粒与PEI的复合物,利用荧光细胞计数法分析转染效率;悬浮转染p Luc(luciferase基因来自Renilla)质粒与PEI的复合物,利用分光光度计分析各细胞的荧光素酶活性;采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法分析PEI对293T、Hela、BMSC和PC12细胞的毒性,分析转染效率和细胞毒性之间的相关性。结果293T、Hela、BMSC和PC12细胞的转染效率分别为(92.1±4.5)%、(29.2±3.4)%、(21.5±2.1)%和(17.0±3.2)%。293T、Hela、BMSC和PC12细胞的荧光素酶活性分别是2.87×108、3.35×107、1.94×107和1.08×107RLU·mg protein-1。293T、Hela、BMSC和PC12细胞转染效率排序:293T>Hela>BMSC>PC12细胞。同时,MTT比色法结果表明细胞毒性排序:293T>Hela>BMSC>PC12细胞。转染效率与细胞毒性呈正相关(r=0.865,P<0.05)。结论 PEI对不同细胞株的转染效率和细胞毒性存在一定的正相关性。     

阳离子多聚物jetPEITM对原代培养的猪血管平滑肌细胞的转染效率研究

目的 研究转染试剂jetPEITM对原代培养的猪血管平滑肌细胞的转染效率.方法 原代培养小型猪胸主动脉血管平滑肌细胞,体外合成双链寡核苷酸,jetPEITM与寡核苷酸按不同的氨基与磷酸基的比例(N/P)混合转染细胞,采用流式细胞仪和共聚焦荧光扫描仪检测jetPEITM对寡核苷酸的转染效率及细胞内定位情况,MTT法检测jetPEITM的细胞毒性作用.结果 原代培养的猪血管平滑肌细胞jetPEITM转染率在N/P=10时可高达(90.89±2.23)%,转染底物主要分布在细胞浆内,核内转染效率极低,在N/P比值在5～10之间时,细胞毒性作用不高于20.00%.结论 在原代培养的猪的血管平滑肌细胞,jetPEITM可以高效运送寡核苷酸进入细胞浆内,细胞毒性作用低.     

对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺作为非病毒转基因载体的体外研究

目的合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合低相对分子质量聚乙烯亚胺聚合物作为非病毒转基因载体,并评价其毒性、压缩DNA的能力,携带报告基因转染细胞的能力。方法采用新方法合成对叔丁基杯[4]芳烃酸偶合聚乙烯亚胺聚合物,通过核磁共振方法表征。将合成的新聚合物与DNA混合,得到新聚合物/DNA复合物,用琼脂糖电泳试验测定不同N/P比值形成复合物时对质粒DNA电泳的阻滞情况,评价其压缩DNA能力。透射电镜法检测复合物的大小,MTT法检测其对细胞的毒性作用,使用新聚合物携带报告基因转染细胞,并与PEI25000比较转染率。结果新聚合物压缩质粒DNA的能力随N/P比值增大而增强,在N/P比为6时可以完全阻滞质粒DNA的电泳,在N/P比为60时,复合物粒径约291 nm,复合物的表面电荷约14.6 m V。细胞毒性试验表明新聚合物与PEI25000相比毒性明显下降,携带报告基因转染MCF-7细胞转染效率与PEI25000相近。结论对叔丁基杯[4]芳烃酸聚乙烯亚胺新聚合物具有较强压缩质粒DNA能力,对细胞毒性低,转染效率高,是一种可应用于基因治疗的新型非病毒载体。     

硬脂酸修饰的聚乙烯亚胺作为siRNA载体的体外评价

目的:考察硬脂酸(SA)修饰的聚乙烯亚胺(PEI)的细胞毒性及转染siRNA的性能.方法:硬脂酸通过羧基与伯氨基脱水缩合嫁接到PEI分子上;激光粒度仪检测粒径及zeta电位;MTT法评价PEI被修饰后的细胞毒性;流式细胞仪、荧光显微镜、荧光酶标仪检测材料转染siRNA的性能.结果:修饰产物PEI-SA结合核酸分子前后粒径分别为(61.2±22.4) nm和(70.9±41.4)nm,zeta电位分别为(25.5±4.5)mV和(18.0±4.5) mV; PEI-SA浓度低于64μg/mL时没有细胞毒性,而修饰前的PEI浓度高于8 μg/mL时就有明显的细胞毒性;PEI-SA对siRNA的转染效率最高可达(94.7±1.3)％,高于修饰前PEI组及脂质体组;转染进入细胞的siRNA量随siRNA的浓度升高及转染时间增长而增多.结论:硬脂酸对PEI的修饰,降低了PEI的细胞毒性,增高了转染效率.PEI-SA可以作为一种有效的非病毒基因载体.     

肝细胞靶向性Gal-Bu对大鼠肝细胞的转染效率检测

目的 检测肝细胞靶向性半乳糖基化聚乙烯亚胺衍生物Gal-Bu对大鼠肝细胞(BRL-3A)的转染效率.方法 对PEI-Bu化学修饰以半乳糖基团制备Gal-Bu,琼脂糖凝胶电泳检测其复合质粒DNA的能力;MTT法检测Gal-Bu对BRL-3A的细胞毒性;以荧光素酶质粒作为报告基因,测定Gal-Bu在BRL-3A细胞的转染效率;半乳糖竞争抑制实验观察Gal-Bu对肝细胞的靶向性.结果 琼脂糖凝胶电泳表明在质量比＞15时,Gal-Bu具有复合DNA的能力.在5～ 100 μg/mL浓度范围内,Gal-Bu和PEI 25 000的细胞毒性随浓度升高而增大;在同一浓度下,Gal-Bu的细胞毒性小于PEI 25 000(P ＜0.01).GaI-Bu/DNA在质量比为50时达到最高转染活性,其数值为PEI 25 000的5.6倍(P＜0.01),且接近Lipofectamine 2000.半乳糖竞争抑制实验表明,100 mmol/L的半乳糖可显著降低Gal-Bu的转染效率(P＜0.0I),但是并不影响PEI-Bu的转染效率(P＞0.05).结论 Gal-Bu是一种低细胞毒性、高转染活性的非病毒肝细胞靶向基因载体,在肝脏疾病的基因治疗领域中具有潜在的应用前景.     

可降解非病毒基因载体PEG-b-(PG-g-PEI)的合成与表征

目的结合重组低分子量PEI 和PEG结构修饰两种手段合成出新型可生物降解的非病毒基因载体聚乙二醇-b-(聚谷氨
酸-g-聚乙烯亚胺)。方法用相对分子质量600 的聚乙烯亚胺氨解嵌段聚合物PEG-b-PBLG,合成非病毒基因载体聚乙二
醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);利用核磁共振氢谱、凝胶渗透色谱、激光粒度分析仪、zeta电位仪和凝胶电泳对载体及其与DNA
复合物进行了表征,并通过体外细胞实验考察了载体的细胞毒性与转染效率。结果我们成功合成出窄分布的非病毒基因载体
聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺);凝胶电泳测定结果表明当N/P比大于5时载体能很好地包裹DNA;载体与DNA形成的
复合物粒径为120 nm,zeta电位25 mV;通过MTT实验和体外质粒转染实验显示出载体在测量范围内具有极低的细胞毒性和
很高的转染效率。结论聚合物聚乙二醇-b-(聚谷氨酸-g-聚乙烯亚胺)有望作为非病毒基因传递载体。
     

聚乙烯亚胺介导的报告基因在体外转染效率的研究

目的　探讨阳离子聚合体载体PEI2 5 (分枝状 ,2 5KDa)在体外的转染效率。方法　PEI2 5和LipofectamineTM2 0 0 0作为转染试剂 ,瞬时转染CHO细胞系 ,通过检测荧光素酶来评估PEI和LipofectamineTM2 0 0 0的转染效率。结果　当N P =5 ,6 ,7时 ,PEI2 5的转染效率与LipofectamineTM2 0 0 0相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　经济实用的PEI适用于体外的瞬时转染。     

含RGD肽CP9修饰的聚乙烯亚胺复合物的理化特性及其转基因功能的研究

目的：构建含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽CP9修饰的聚乙烯亚胺（PEI），观察其理化特性和转基因功能。方法：通过琥珀酰亚胺-3-（2-嘧啶二硫）丙酸酯（N-Succinimidyl-3-（2-pyridyldithio）]propionate，SPDP）将CP9偶联到PEI上，合成新型转基因载体CP9-PEI。用^1H-NMR和FT-IR验证CP9的偶联；用凝胶电泳阻滞实验、电镜和粒径检测，观察CP9-PEI浓缩质粒DNA的能力以及浓缩质粒DNA后形成的转染颗粒形态和粒径；通过CP9-PEI在人肝癌细胞株HepG2中的转染实验来验证CP9对PEI的转染效率的影响；通过游离CP9肽的竞争抑制实验验证CP9-PEI的整合素靶向功能。结果：CP9成功偶联到PEI上；CP9-PEI能有效浓缩质粒DNA，形成的转染颗粒形态为圆形或类圆形，在N／P比为10时，粒径约为200nm。CP9-PEI的转染效率是PEI的2倍，游离CP9肽能抑制CP9-PEI的转染效率。结论：修饰了CP9的PEI能有效增加转染效率，具有整合素的靶向能力，是一种具有应用前景的转基因载体。     

氮磷比对PEI介导BMP-7基因转染骨髓间充质干细胞的影响

目的:研究氮磷比(N/P值)对非病毒基因载体聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因转染骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,MSC)的影响,优化PEI/DNA复合物制备参数,为其应用于骨组织工程提供实验基础.方法:制备不同N/P值的含BMP-7基因的PEI/DNA复合物,测定复合物的粒径、Zeta电位以及PEI保护DNA抵御DNA酶消化的能力,检测复合物对MSC细胞的毒性以及转染表达BMP-7蛋白量.结果:当N/P值在3-30范围时,形成微粒粒径稳定在100 ～ 150 nm;当N/P值在5～ 30范围时,Zeta电位稳定在30 ～ 40 mV.当N/P值＞3时,随着PEI的增加,PEI对DNA的保护功能增强.当N/P值为7～10时,可以获得最高的基因转染效率.当N/P值大于10时,细胞毒性明显增加.结论:N/P值为7～ 10时,含BMP-7基因的PEI/DNA复合物细胞毒性小,转染效率高.     

新型纳米载体SuperfectTM最适转染条件的研究

目的:对新型纳米转染载体SuperfectTM的转染效率和细胞毒性进行初步研究,以探讨其最适的转染条件。方法:以50%融汇率的小鼠黑色素瘤细胞为靶细胞,在不同条件下将,报告基因质粒pEGFP-C1与载体Super-fectTM混合为复合物进行转染。各实验组:不同的质粒剂量(0.25μg,0.50μg)、不同的N/P(N:载体分子表面胺基的数量,P:DNA中磷酸基团的数量)比(2∶1,5∶1,10∶1)及复合物与细胞的孵育时间(3 h,6 h)。各对照组:裸质粒转染组、载体转染组,非转染组为对照。转染72 h后,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测细胞毒性。结果:在不同条件下,SuperfectTM的转染效率有显著性差异(P<0.05),其细胞毒性与载体剂量和孵育时间相关。当质粒剂量为0.5μg,N/P比为5∶1,复合物与细胞孵育3 h时,SuperfectTM不仅具有较高的转染效率,而且表现出较低的细胞毒性。结论:SuperfectTM是一种高效低毒的转染载体,其最适转染条件主要与N/P比及复合物与细胞的孵育时间相关。SuperfectTM在基因治疗领域将具有良好的应用前景。     

携带GFAP启动子的慢病毒载体介导外源基因在肝星状细胞的特异表达

 目的  旨在构建包含由GFAP启动子介导的荧光素酶的慢病毒载体,检测体内外靶向肝星状细胞的外源基因表达的特异性和效率。方法  通过报告基因实验筛选介导效率较高的GFAP启动子,以CMV 启动子作为阳性对照分别介导荧光素酶在小鼠肝星状细胞(JS1)、人肝星状细胞(LX-2)及人肝细胞(L-02)中的表达。通过尾静脉注射将包装的慢病毒注射到四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠体内,通过活体成像和Western blot检测慢病毒颗粒在小鼠体内的分布,并通过免疫双荧光染色检测肝星状细胞的特异表达。结果  人GFAP启动子比小鼠GFAP启动子驱动基因表达的效率高,而且在LX-2和JS1细胞中,人GFAP启动子介导的荧光素酶的活性及表达显著高于L-02细胞。活体成像显示小鼠腹部有荧光素酶的表达。GFAP启动子介导的荧光素酶可以与肝星状细胞的特异性生物标记蛋白GFAP、Desmin和α Sma共定位。结论  成功构建包含由GFAP启动子介导的荧光素酶的慢病毒载体,在体外细胞系以及小鼠体内肝中均可以实现荧光素酶在肝星状细胞中特异性表达。     

A RGD-Containing Oligopeptide (K)_(16)GRGBSPC: A Novel Vector for Integrin-Mediated Targeted Gene Belivery

A 23 amino acid, bifunctional integrin-targeted synthetic oligopeptide was evaluated for ex vivo gene delivery to rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs). Synthesis of the peptide (K)16GRGDSPC was performed on a solid-phase batch peptide synthesizer. BMSCs were transfected with plasmid DNA coding for luciferase by (K)16GRGDSPC and the transfection efficiency was assayed. The influences of chloroquine and polyethyleneimine on the transfection efficiency were also examined. The target specificity of (K)16GRGDSPC to mediate exogenous gene into BMSCs was analyzed using cell attachment test and gene delivery inhibition test. The results showed that the transfection efficiency of the oligopeptide vector was lower than that of Lipofectamine. But in the presence of endosomal buffer chloroquine or endosomal disrupting agent polyethyleneimine, the transfection efficiency of the vector was greatly enhanced. In addition, RGD-containing peptides inhibited BMSCs' attachment to the 96-well plates pretreated with fibronectin or vitronectin and significantly decreased the transfection efficiency of the oligopeptide vector. These studies demonstrated that oligopeptide (K)16GRGDSPC was an ideal novel targeted non-viral gene delivery vector, which was easy to be synthesized, high efficient and low cytotoxicity. The vector could effectively deliver exogenous gene into rat BMSCs.     

聚乙烯亚胺介导miR-2861模拟物转染MC3T3-E1细胞的体外成骨分化

目的：通过非病毒载体聚乙烯亚胺（PEI）介导miRNA-2861（miR-2861）模拟物转染MC3T3-E1细胞系,探讨miR-2861/PEI复合物在前成骨细胞中的转染效率及其对细胞增殖和成骨向分化的影响。方法：将适量的PEI分别与miR-2861和阴性对照（NC）以元素N/P=10的比例混合形成基因/载体复合物。将miR-2861/PEI复合物作为实验组,NC/PEI复合物作为阴性对照组以排除人工合成的双链基因对成骨作用的干扰。采用MTT法筛选PEI复合miR-2861模拟物的最佳使用浓度;应用荧光成像和茎环法RT-PCR技术分别检测10、30、50和100 nmol·L^-1 miR/PEI复合物对MC3T3细胞的瞬时转染效率和miR-2861的表达情况;采用qRT-PCR技术和茜素红染色检测用选定浓度瞬时转染miR-2861/PEI复合物作用下MC3T3细胞的成骨能力。结果：与空白对照组比较,100 nmol·L^-1 miR-2861/PEI复合物作用72h时MC3T3细胞增殖率明显下降（P<0.05）。随转染浓度增加,miR-2861/PEI复合物在MC3T3细胞中的转染效率逐渐升高。茜素红染色及定量分析,实验组诱导21 d后出现较多的钙盐沉积结节,而空白对照组和阴性对照组均较少。结论：以PEI作为载体可使miR-2861模拟物有效转染MC3T3-E1细胞并在细胞中高表达,miR-2861模拟物具有一定的促MC3T3-E1细胞成骨向分化的作用。     

以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型的建立研究

目的 以PRDM1基因启动子为靶点构建双荧光素酶报告基因载体,建立体外药物筛选细胞模型,并对中草药小分子化舍物进行筛选.方法 将人PRDM1基因启动子序列(267、1 257 bp)克隆入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic中,构建重组质粒pGL3-PRDM1并与内参质粒pRL-TK瞬时共转染工具细胞,通过检测荧光素酶报告基因表达水平的变化反映PRDM1基因启动子的启动转录活性,并对共转染质粒比例、工具细胞选择等条件进行探索和优化,相关药物处理进行验证.结果 成功构建了荧光素酶报告载体pGL3-PRDM1.用0.5、1、2、4μmol/L的5-Aza-CdR处理重组的U266细胞筛选模型,与0μmol/L 5-Aza-CdR相比,增加5-Aza-CdR的刺激,荧光强度及PRDM1基因启动子的活性呈剂量依赖性增强.与0μmol/L相比,青蒿琥酯从5 μmol/L浓度开始对PRDM1基因启动子活性呈明显降低(P＜0.05),在20 μmol/L浓度时降到最低;白芍总苷呈现小剂量促进PRDM1启动子活性,高剂量抑制PRDM1基因启动子活性.青蒿琥酯对细胞生长增殖影响较小,白芍总苷对细胞生长增殖的影响较复杂.结论 成功建立了以PRDM1基因启动子为靶点的药物筛选模型,并筛选出青蒿琥酯能抑制PRDM1基因启动子活性.