不同载体介导的绿色荧光蛋白基因在大鼠颌下淋巴结的表达

目的探讨阳离子聚合物Sofast基因转染试剂(Sofast)和阳离子脂质体Lipofectamine2000(Lipo)经不同途径向大鼠转入绿色荧光蛋白基因(PEGFP-N2),观察其在颌下淋巴结(SMLN)的表达。方法45只Wistar大鼠随机分成9组:Lipo/DNA前房注射组(A)、结膜下注射组(B)、颞下方穹隆部注射组(C)和下睑皮下注射组(D);Sofast/DNA前房注射组(E)、结膜下注射组(F)、颞下方穹隆部注射组(G)、下睑皮下注射组(H)和阴性对照组(I)。分别于注射后48小时取同侧SMLN,通过荧光显微镜观查和流式细胞仪(FCM)检测各组的SMLN中PEG-FP-N2的表达。结果A-D、E-H各实验组的SMLN中均可观察到绿色荧光。相同载体不同部位注射DNA后颞下方穹隆部注射组和下睑皮下注射组可以获得相对较高的转染效率。相同部位不同载体注射DNA后Sofast/DNA注射组的转染效率高于Lipo/DNA注射组。结论Sofast在SMLN的基因转染中优于Lipo。DNA/Sofast可以通过颞下方穹隆部注射和下睑皮下注射在SMLN获得相对较高的表达。     

绿色荧光蛋白在大鼠角膜移植术后植片中的表达

目的研究穿透角膜移植术（PKP）后重组腺相关病毒（rAAV）载体介导的绿色荧光蛋白（GFP）在大鼠植片中的转染及表达情况。方法建立32只大鼠穿透角膜移植的动物模型,SD大鼠作为受体,Wistar大鼠作为供体,供体植片置于含1010μg/mL（病毒基因组数/mL）rAAV-GFP的DMEM/F121：1混合培养液中培养30min。按照不同的观察时间点用抽签法将角膜移植术后的大鼠随机分成4组,每组8只。手术后隔日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片的存活情况。于角膜移植术后1、2、4、12周取各组眼球在共焦显微镜下观察角膜组织中GFP的表达情况,Infinity-capt软件测量角膜植片内皮层中荧光的表达强度。结果各组中选取的受体角膜植片无水肿、混浊、新生血管及其他并发症发生。GFP基因表达阳性的角膜内皮细胞呈绿色荧光。各组角膜内皮细胞绿色荧光强度与背景亮度比值,A组：91.83±10.83;B组：128.67±4.32;C组：117.33±3.01;D组：118.50±3.02,转染后1周即有明显表达,4周及12周组较1周组强（P〈0.01）,2周组强度最高（P〈0.01）。结论通过共培养的方法,rAAV-GFP能够有效地转染到角膜内皮细胞中。PKP后GFP基因能够持续、高效、稳定地在移植片的角膜内皮细胞中表达。     

增强型绿色荧光蛋白基因在人胚胎视网膜前体细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转染人胚胎视网膜前体细胞的转染效率及瞬时表达情况,建立人胚胎视网膜前体细胞的示踪方法,为视网膜前体细胞移植提供示踪依据。方法:在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒,通过磷酸钙介导法转染人胚胎视网膜前体细胞．应用流式细胞仪检测其转染效率,荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况。结果:pEGFP-N1在基因转染24 h细胞转染率为28．98％,48 h为32．45％,72 h为30．40％,对照未转染细胞24 h、48 h分别为2．50％和2．04％:体外观察培养细胞转染24 h已有绿荧光表达,48-72 h细胞荧光强度最强,96 h荧光强度减弱。结论:pEGFP-N1质粒能有效转染人胚胎视网膜前体细胞,其转染效率可达到30％,是人胚胎视网膜前体细胞较为理想的瞬时表达载体和细胞示踪报告分子。     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因对体外培养IPE细胞的转染和表达

目的 研究重组腺相关病毒（rAAV)载体介导的绿色荧光蛋白基因（GFP）对体外培养虹膜色素上皮（IPE）细胞的转染和表达，为rAAV携带目的基因治疗视网膜色素变性提供理论依据。方法 酶辅助的显微分离方法体外培养IPE细胞并鉴定。按转染倍数（MOI）为10^3,10^4,10^5,10^6转录已培养3d的传二代IPE细胞，转染后的第1、3、5、7、9d，在倒置荧光显微镜下观察IPE中GFP表达阳性的情况，记录100个IPE细胞中GFP阳性所占的百分比。当GFP表达稳定后，共聚焦显微镜照相，流式细胞仪检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，结果 rAAV-GFP在细胞中的表达呈绿色，弥漫于整个胞浆。MOI=10^3时，转染后48h,GFP开始表达，MOI=10^4,10^5,10^6时，转染后24h时便可看到GFP表达阳性的细胞，细胞的起始表达强度不一，随MOI值的增高而增强，同时GFP的表达强度随着时间延长而逐渐增强，转染后第7-9d达到高峰并维持，此时检测rAAV-GFP对IPE的转染效率，MOI=10^3时是26.7%,MOI=10^4时是53.6%,MOI=10^5时是60.2%,MOI=10^6时是63.7%。结论 rAAV-GFP对体外培养的IPE细胞转染效率可达60%以上，将腺相关病毒载体介导的基因治疗和IPE移植结合起来治疗视网膜色素变性是可行的。     

阳离子聚合体介导下角膜基质注射GFP基因及其表达

目的研究角膜层间注射阳离子聚合体/质粒复合物转染角膜组织的有效性和安全性。方法用微量进样器将表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒PEGFPC2和阳离子聚合体的混合溶液16μL注射于Wistar大鼠角膜基质,对照组注射等量NS。注射后不同时间点(1、3、14、21d)收集角膜行HE染色、透射电镜和荧光显微镜检查结果电镜证实角膜细胞内可见PEI/DNA颗粒。HE染色未见炎症细胞浸润。实验组角膜1d后GFP开始表达,3d时达到高峰,全角膜均表达阳性,21d时仍有微弱表达。对照组角膜未见荧光表达。结论角膜基质注射阳离子复合体包装的质粒可将外源性基因安全地、相对高效地转入角膜组织。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的 观察慢病毒载体转染豚鼠巩膜成纤维细胞的有效性及对细胞活性的影响.方法 转染组用慢病毒携带绿色荧光蛋白(lentiviral mediated green fluorescent protein,Lenti-GFP)转染豚鼠巩膜成纤维细胞,对照组加入空白培养液,转染组按最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、200、400加入Lenti-GFP,转染2d、3d、4d、5d、6d和7d后,在倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测病毒对细胞增殖的影响.结果 Lenti-GFP转染细胞后48 h可以看见绿色荧光;在同一MOI值下,随时间延长转染效率增高,第5天达到高峰;在MOI为400,转染5d时转染效率达82.86％;转染5d行MTT检测显示:MOI为50 ～400时,同一转染时间各组IOD值与对照组比较,差异均无统计学意义(均为P＞0.05).结论 慢病毒载体可以在体外稳定而有效地转染豚鼠巩膜成纤维细胞,且不影响细胞活性,是巩膜成纤维细胞理想的基因转染载体.     

脂质体介导增强型绿色荧光蛋白基因在鼠视网膜Müller细胞中的表达

目的研究脂质体介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因对体外培养的鼠视网膜Müller细胞转染的有效性及安全性。方法采用视网膜组织块法培养鼠视网膜Müller细胞,振荡法分离纯化细胞,并对其进行免疫细胞化学鉴定。用阳离子脂质体Lipofectamine 2000负载pEGFP-N1质粒转染Müller细胞,荧光显微镜检测转染后12、24、48、72h的转染效率。台盼蓝排斥实验检测转染和未转染细胞的活力,明确脂质体Lipofectamine 2000对Müller细胞的毒性作用。结果成功培养视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色阳性。Lipofectamine 2000介导质粒pEGFP-N1转染Müller细胞后12、24、48、72h的转染效率分别为（9.7±1.9）%、（18.1±16）%、（17.2±2.5）%、（16.9±1.7）%。台盼蓝排斥实验显示Lipofectamine 2000转染前后活细胞率分别为（98.2±5.6）%、（96.1±6.2）%。结论脂质体Lipofectamine 2000可安全有效地介导Müller细胞的转染,为进一步明确Müller细胞的病理、生理功能及靶向Müller细胞的基因治疗提供了新的手段。     

绿色荧光蛋白逆转录病毒及其介导的视网膜色素上皮细胞基因转移研究

目的 制备携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)基因的逆转录病毒,感染原代与建株的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE)细胞,评价逆转录病毒对人RPE细胞的感染能力,为视网膜病变的基因治疗奠定基础。方法 分离编码GFP的cDNA片段并插入逆转录病毒载体pLNCX,借助脂质体将重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转入单嗜性及双嗜性包装细胞,G418筛选抗性克隆,分离GFP表达水平最高的克隆;收集含病毒颗粒的上清液感染NIH3T3及体外培养的人原代与建株的RPE细胞。结果 重组逆转录病毒载体pLNCX-GFP转染各种包装细胞后,可产生GFP逆转录病毒。由双嗜性包装细胞产生的GFP逆转病毒能够感染原代与建株的人RPE细胞,GFP基因可持续在RPE细胞内表达。结论 逆转录病毒能够简便、快速、稳定将目的基因转入RPE细胞,可作为眼底病变基因治疗介导目的基因转移的重要工具。     

腺相关病毒-1介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠角膜基质细胞体内外转染的研究

目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。     

腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的比较四种不同血清型腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)介导增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)的转染效率及安全性,筛选合适的基因转染载体。方法原代分离培养GSF并鉴定,利用AAV2、AAV5、AAV8、AAV9介导EGFP基因并按不同感染复数(multiplicity of infection,MOI)10、100、1000、10 000转染GSF,空白对照组加入空白培养基,转染后2 d、3 d、4 d、5 d荧光显微镜下观察GFP表达强度及细胞生长状态,流式细胞术检测细胞转染率及凋亡率,CCK-8法检测细胞活力。结果 AAV感染GSF后2 d各组均可见弱荧光,荧光强度随时间延长及MOI值增大而增强,而AAV9-EGFP组全程弱荧光,空白对照组全程无荧光。转染后5 d,MOI=10 000时各组荧光最强,基因转染率组间整体比较,差异具有统计学意义(P<0.05);组间两两比较,AAV8-EG...     

绿色荧光蛋白特性及其在角膜内皮疾病研究中的应用

来源于发光水母的绿色荧光蛋白（GFP）于1994年首次被作为报告基因应用。其内源的荧光基团受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿光,并可在细胞内稳定表达,不需要任何反应底物及其他辅助因子,不影响细胞功能,检测直观方便,可在活体内进行,已成为当今生命科学各领域中应用广泛的新型标记基因。作为一种性质独特、理想的荧光示踪标记物,GFP在角膜内皮疾病的基因治疗研究中,也展示了广阔的应用前景。就GFP的特性及GFP标记示踪技术在角膜内皮疾病基因研究中的应用进展进行综述。     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在晶状体上皮细胞中的表达

目的研究Ⅱ型重组腺相关病毒(recombinantadeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导的增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞的转染和表达情况,为rAAV携带目的基因防治后囊膜混浊提供理论依据。方法组织块培养法体外培养兔晶状体上皮细胞。rAAV2-EGFP按感染复数(multiplic-ity of infection,MOI)为103、104、105、4×105、106转染传2代细胞,转染后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天在倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP表达的阳性情况,记录200个细胞中EGFP阳性表达所占的百分比。当EGFP表达稳定后用激光共聚焦显微镜照相。用倒置显微镜观察rAAV转染对细胞生长和形态的影响。结果当MOI=103、104时,转染后第72小时晶状体上皮细胞中EGFP开始表达,当MOI=105、4×105、106时,转染后第24小时便可见EGFP阳性表达。随着MOI值的增大及时间的延长,EGFP表达效率逐渐增高,转染后第8~第9天达到高峰并维持,此时,MOI=103、104、105、4×105、106的转导效率分别为16%、41%、55%、86%、94%。对照组和转染组细胞的生长和形态特征无明显改变。结论腺相关病毒载体可以携带报告基因稳定转染晶状体上皮细胞,并且转染效率高,因而腺相关病毒携带目的基因防治后囊膜混浊是可行的。     

阳离子聚合物介导的质粒EGFP基因逆行转染视网膜神经节细胞

目的 研究上丘和外侧膝状体注射阳离子聚合体/质粒复合物转染视网膜神经节细胞（RGCs）的有效性.方法 将表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒和阳离子聚合物的混合溶液分别注射于Wistar大鼠双侧上丘和外侧膝状体,注射后10 d灌注固定大鼠,取视网膜和视神经行冰冻切片,荧光显微镜下观察.结果 荧光显微镜下见视网膜内层和视神经轴突纤维中有绿色荧光表达.结论 上丘和外侧膝状体注射阳离子复合物包装的质粒可将外源性基因相对高效地转入RGCs.     

绿色荧光蛋白标记的恶性组织细胞增生症瘤细胞眼前房移植模型

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的恶性组织细胞增生症瘤细胞cy15在眼前房生长及浸润的模型,探讨cy15细胞在前房生长的规律及GFP标记活细胞的优势。方法将带有GFP的逆转录病毒MP71-GFP-PRE转入cy15瘤细胞,获得稳定表达GFP的cy15GFP细胞系。20只BALB/C小鼠(20只眼)每只眼前房注入2μl细胞密度为2×106个/ml的cy15GFP瘤细胞悬液,术后分别在裂隙灯和荧光显微镜下观察瘤细胞在前房的生长情况,连续观察30d,分别在瘤细胞植入前房后第15d、20d、30d时处死小鼠做眼球HE病理切片。结果成功地建立了稳定表达GFP的cy15GFP细胞系。接种的20只BALB/c鼠眼前房均可见肿瘤细胞生长,借助于荧光显微镜能动态地观察到肿瘤细胞在活体小鼠眼前房的生长浸润过程。结论建立的GFP标记的肿瘤细胞眼前房接种模型为研究眼内肿瘤细胞生长与浸润的规律以及抗肿瘤药物的筛选提供了一种新的手段。