内皮祖细胞在血管组织工程中的应用

目的:内皮祖细胞因其来源广泛,易于分离培养,增殖能力强及其自身多方面的特点已成为血管组织工程一种重要的种子细胞,但其进一步在体外成血管的条件与内皮祖细胞的相应特点及其在血管组织工程中的有关作用尚需要深入研究和认识。资料来源:应用计算机检索PUBMED 1997-01/2006-07期间的相关文章,检索词为“Endothelial progenitor cells,Tissue-engineered vascular,Tissue Engineering Blood Vessel”,并限定文章语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与内皮祖细胞的特点或其在血管组织工程的相关研究进展相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到136篇相关文献,30篇文献符合纳入标准,排除的106篇文献为内容陈旧或重复。符合纳入标准的30篇文献中,8篇涉及内皮祖细胞的生物学特性,14篇涉及内皮祖细胞作为种子细胞在组织工程中应用的优势,8篇涉及内皮祖细胞在构建组织工程化血管中的应用。资料综合:①内皮祖细胞可从骨髓、外周血、脾脏等部位分离出来,表达CD133并以此与内皮细胞相鉴别,它可向内皮细胞转化,也可向平滑肌等细胞横向转化。②内皮祖细胞能提高微血管密度及新生血管数量,许多研究表明内皮祖细胞可改善缺血症状、修复心内膜损伤;内皮祖细胞还可促进内皮再内皮化,保护内膜,保持内膜的完整性;结合到缺血血管,内皮祖细胞可提高通畅率防止再狭窄。③利用平滑肌及其它细胞外基质,内皮祖细胞可广泛应用于构建组织工程化血管并有着广阔的前景。结论:内皮祖细胞的相关研究需要在其血管表型、组织重塑过程中的作用及生物学特性等方面有所突破。作为组织工程种子细胞的一员,内皮祖细胞所具有的来源丰富、增殖能力强的优势,使之用于血管组织工程研究的前景十分广阔。     

内皮前体细胞与平滑肌细胞联合培养构建组织工程血管:最适比例验证

目的:由内皮前体细胞分化的内皮细胞与成熟平滑肌细胞联合培养可以为组织工程血管的形成提供更接近天然的条件.实验拟进一步证明两种细胞联合培养可促进血管内皮细胞生长,以及两种细胞的最适比例.方法:实验于2006-01/2007-05在复旦大学上海医学院分子生物学实验室完成.①实验材料:新鲜脐带取自国际第一妇婴保健医院,产妇知情同意.②实验方法及评估:从人脐动脉中用组织块培养法分离并原代培养血管平滑肌细胞,免疫荧光方法鉴定其平滑肌肌动蛋白表达情况;采用密度梯度离心法分离脐血中的内皮前体细胞,经体外定向诱导分化和免疫荧光方法鉴定其表型;无菌条件下制作Ⅰ型胶原凝胶,在其上以3:1～4:1的比例混匀联合培养内皮前体细胞与平滑肌细胞,并观察两种细胞联合培养时的形态,分析两种细胞最合适的种植比例;免疫荧光方法观察在Ⅰ型胶原凝胶联合培养中CD31、vWF的表达以及内皮细胞的生长情况.结果:①原代培养的平滑肌细胞呈典型"波峰谷"形态,荧光染色平滑肌肌动蛋白呈阳性.②脐血来源的内皮前体细胞定向诱导分化为内皮细胞后,呈现出"铺路石"样形态,表达CD31、vWF,结合荆豆凝集素,提示具备成熟内皮细胞特性.③在Ⅰ型胶原凝胶上两种细胞增殖力均旺盛,与平滑肌细胞以3:1～4:1的比例种植在I型胶原凝胶培养一段时间后,内皮前体细胞可从平滑肌细胞处得到支持,形成血管样网络结构.④共培养1周后,CD31与vWF阳性细胞即内皮前体细胞分化而来的内皮细胞互相连接,形成环形结构.结论:内皮前体细胞和平滑肌细胞以3:1～4:1共培养的模式可以促进微血管样结构的形成.     

犬外周血淋巴管内皮祖细胞的分选及其向内皮细胞的诱导分化研究

目的研究犬外周血中CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞的生物学特征，探讨血管内皮生长因子-C（VEGF-C）／血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）信号途径在淋巴管内皮祖细胞向淋巴管内皮细胞分化中的作用。方法用密度梯度离心法从犬外周血分离单个核细胞，再用流式细胞仪从单个核细胞分选VEGFR-3^＋细胞。通过VEGF-C诱导使VEGFR-3^＋细胞向内皮细胞分化。在扫描电镜和透射电镜下观察细胞表面形态和超微结构，并在共聚焦激光扫描显微镜下观察特征性标志物的表达。结果VEGFR-3^＋细胞同时表达CD34和CD133。经流式细胞仪分析，外周血单个核细胞中CD34^＋／VEGFR-3^＋细胞的含量约为0.13％，VEGFR-3^＋／CD133^＋细胞的含量约为0.08％。CD34^＋／CD^33^＋／VEGFR-3^＋细胞的体积较大，直径约为15μm。经VEGF-C诱导后，细胞数目增多。细胞变为梭形，伸出板状伪足和许多丝状伪足。诱导后1周，细胞表达血管性血友病因子。诱导后2周，细胞表面出现小凹，细胞内可见Weibel-Palade小体。细胞表达淋巴管内皮细胞特异性标志物LYVE-1，CD133标志消失。结论在VEGF-C诱导作用下，外周血中的CD34^＋／CD133^＋／VEGFR-3^＋淋巴管内皮祖细胞能向淋巴管内皮细胞分化。VEGF-C／VEGFR-3信号途径在淋巴管内皮祖细胞的分化过程中起着重要作用。     

补阳还五汤对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

背景：现代医学研究表明,内皮祖细胞和补阳还五汤在治疗缺血性疾病上具有相似的功能,两者之间是否存在着一定的联系？目的：观察补阳还五汤对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响。方法：采用密度梯度离心法分离培养兔外周血内皮祖细胞,经Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色和表面抗原的免疫组织化学检测鉴定后,将贴壁细胞随机分为4组,分别用基础培养基以及含有20,50,100g/L补阳还五汤的EBM-2培养基进行细胞培养72h。检测细胞形态及计数,再采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法、Transwell小室、黏附功能检测、一氧化氮检测及血管内皮生长因子免疫细胞化学分析来评定其增殖、迁移、黏附、分泌一氧化氮和表达血管内皮生长因子的能力。结果与结论：不同质量浓度补阳还五汤均能增加内皮祖细胞的数量,提高内皮祖细胞增殖、黏附、迁移和分泌一氧化氮的能力（P〈0.05）,药物质量浓度在50g/L时影响最为显著（P〈0.01）,而对血管内皮生长因子表达的影响较微弱。提示补阳还五汤能增加内皮祖细胞的数量,提高内皮祖细胞的增殖、迁移和黏附能力,并可能诱导晚期内皮祖细胞的分化。     

电针预处理对脑缺血再灌注大鼠骨髓和血浆中EPCs及VEGF的影响

目的：观察电针预处理对脑缺血再灌注损伤大鼠骨髓和外周血中内皮祖细胞（EPCs）、血管内皮生长因子（VEGF）的影响,研究电针预处理减轻脑缺血再灌注损伤机制。方法：将大鼠用抽签法随机分组,分为治疗组、模型组、假手术组和正常对照组。将大鼠造模脑缺血再灌注后,在第12,24,48小时分别将各组大鼠留取标本,用流式细胞仪检测其骨髓和外周血中EPCs的百分比变化。用ELISA法检测骨髓和血清中VEGF的浓度。结果：脑缺血再灌注损伤的大鼠较正常大鼠的骨髓和外周血中EPCs和VEGF的含量增加。电针预处理过的脑缺血再灌     

补阳还五汤对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

背景:现代医学研究表明,内皮祖细胞和补阳还五汤在治疗缺血性疾病上具有相似的功能,两者之间是否存在着一定的联系?目的:观察补阳还五汤对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响。方法:采用密度梯度离心法分离培养兔外周血内皮祖细胞,经Dil-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色和表面抗原的免疫组织化学检测鉴定后,将贴壁细胞随机分为4组,分别用基础培养基以及含有20,50,100g/L补阳还五汤的EBM-2培养基进行细胞培养72h。检测细胞形态及计数,再采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法、Transwell小室、黏附功能检测、一氧化氮检测及血管内皮生长因子免疫细胞化学分析来评定其增殖、迁移、黏附、分泌一氧化氮和表达血管内皮生长因子的能力。结果与结论:不同质量浓度补阳还五汤均能增加内皮祖细胞的数量,提高内皮祖细胞增殖、黏附、迁移和分泌一氧化氮的能力(P<0.05),药物质量浓度在50g/L时影响最为显著(P<0.01),而对血管内皮生长因子表达的影响较微弱。提示补阳还五汤能增加内皮祖细胞的数量,提高内皮祖细胞的增殖、迁移和黏附能力,并可能诱导晚期内皮祖细胞的分化。     

Distinct phenotypes and regenerative potentials of early endothelial progenitor cells and outgrowth endothelial progenitor cells derived from umbilical cord blood

The capability of postnatal neovascularization makes circulating endothelial progenitor cells (EPCs) promising for regenerative medicine and tissue engineering. Using EPCs isolated from umbilical cord blood, this study aimed to clarify the transition of functional properties from early EPCs (e-EPCs) to outgrowth EPCs (og-EPCs) for potential applications in regenerative medicine. Mononuclear cells were collected from umbilical cord blood via density gradient centrifugation and further negatively selected by CD45. EPCs were sorted from mononuclear cells by the expression of CD34. e-EPCs (7 days of culture) and og-EPCs (3 weeks of culture) were characterized by morphology, intake of acetylated low-density lipoprotein, vessel-cord formation, cell surface phenotype and the expression of angiogenic genes. e-EPCs and og-EPCs were also compared for osteogenic differentiation under the stimulation of BMP-2. Chemotaxis by SDF-1 was compared among og-EPCs and the first- and second-day attached e-EPCs. Based on the expression of angiogenic genes, e-EPCs possessed few angiogenic properties in vitro and og-EPCs were angiogenic. e-EPCs, however, expressed significant CXCR4 and migrated toward the SDF-1 gradient. og-ECPs did not express CXCR4 and showed no response to SDF-1. During culture, gaining an angiogenic phenotype by og-EPCs is associated with the loss of homing potential. These contrast properties determine different potentials of e-EPCs and og-EPCs in regenerative medicine.     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的:探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。方法:实验于2004-09/2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血,经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞,在含有体积分数为0.1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4μg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增,分别在培养的第6和14天,流式细胞仪检测其KDR,CD133,CD34和vWF阳性率,并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定。结果:①人外周血单个核细胞经体外诱导分化,培养第6天的贴壁细胞表达KDR,CD133,CD34和vWF,流式细胞仪检测其阳性率分别为(46.4±9.3)%、(33.8±11.7)%、(73.5±6.3)%和(38.9±8.2)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR,CD34和vWF,不表达CD133,流式细胞仪检测其阳性率分别为(81.5±7.6)%、(88.9±5.4)%和(78.3±13.6)%,能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL。结论:外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞,为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

人外周血内皮祖细胞的培养与鉴定

目的：探讨人外周血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打基础。 方法：实验于2004-09／2005-05在解放军第四军医大学西京医院肝胆外科实验室完成。采集献血员抗凝外周血，经Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞，在含有体积分数为O．1胎牛血清、20μg/L的血管内皮细胞生长因子和4mg/L的碱性成纤维细胞生长因子的M199培养液中培养和扩增，分别在培养的第6和14天，流式细胞仪检测其KDR，CDl33，CD34和vWF阳性率，并通过检测其对异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素的吸附和内吞、DiI-aeLDL来进行细胞功能学的鉴定。 结果：①人外周血单个核细胞经体外诱导分化，培养第6天的贴壁细胞表达KDR，CDl33，CD34和vWF，流式细胞仪检测其阳性率分别为（46．4&;#177;9．3）％、（33．8&;#177;1l、7）％、（73．5&;#177;6、3）％和（38．9&;#177;8、2）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。②培养第14天的贴壁细胞表达KDR，CD34和vWF，不表达CDl33，流式细胞仪检测其阳性率分别为（8l、5&;#177;7、6）％、（88．9&;#177;5．4）％和（78、3&;#177;13．6）％，能特异性吸附异硫氰酸荧光素标记的荆豆凝集素并内吞DiI-aeLDL。 结论：外周血来源的单个核细胞在一定的培养条件下可以分化为内皮祖细胞，为自体外周血内皮祖细胞移植的临床应用打下基础。     

血管内皮祖细胞与内皮细胞生长因子在冠状动脉粥样硬化性心脏病状态时的变化

目的:观察冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)患者循环内皮祖细胞与血管内皮细胞生长因子的变化及其相互间的关系。方法:①对象:于2005-11/2006-10在泰山医学院聊城临床学院心内科住院并行冠状动脉造影检查确诊为冠心病患者37例和冠状动脉造影正常者(对照组)7例。其中稳定型心绞痛患者12例、不稳定型心绞痛患者14例、急性心肌梗死患者11例。②方法:采集研究对象外周血进行内皮祖细胞的分离培养,激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞,通过集落形成试验、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验计数内皮祖细胞的数量,测定内皮祖细胞的迁移和黏附能力。用酶联免疫吸附法检测44例入选者血浆内皮细胞生长因子水平,比较其与循环内皮祖细胞的数量、迁移和黏附能力有无相关性。结果:急性心肌梗死组内皮祖细胞集落形成数是对照组的2.7倍,其迁移能力较其他3组升高(P<0.01),但其黏附能力与不稳定型心绞痛组相比差异无显著性;不稳定型心绞痛患者内皮祖细胞数量及迁移能力较稳定型心绞痛和对照组升高(P<0.01);稳定型心绞痛患者内皮祖细胞数量及迁移、黏附能力均比对照组减低(P<0.05)。不稳定型心绞痛和急性心肌梗死患者血浆内皮细胞生长因子水平明显高于对照组(P<0.01)。内皮细胞生长因子浓度与循环内皮祖细胞数量及迁移能力呈正相关,与循环内皮祖细胞黏附能力无相关性。结论:急性心肌梗死(发病7d内)和不稳定型心绞痛可引起循环内皮祖细胞数量增多,迁移和黏附能力增强,这种变化可能与血浆内皮细胞生长因子水平增高有关。     

肝细胞生长因子对体外培养冠心病患者外周血内皮祖细胞生物学功能的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养冠心病患者外周血内皮祖细胞(EPCS)生物学功能的影响。方法选取2014年1月至2014年9月就诊的冠心病患者16例作为研究组,同时期未患有冠心病的健康体检者16例作为对照组。每组又均再随机分为HGF组和非HGF组。观察并比较两组患者外周血中CD133+细胞数量、血浆中HGF含量以及EPCS生物学功能。结果研究组患者CD133+细胞数量显著低于对照组患者(P0.05);研究组患者HGF含量显著高于对照组患者(P0.05)。研究组非HGF干预增殖能力吸光度、粘附细胞数和迁移细胞数均显著低于对照组非HGF干预组(均P0.05)。研究组患者中HGF干预组增殖能力吸光度、粘附细胞数和迁移细胞数均显著高于非HGF干预组(均P0.05)。对照组患者HGF干预组增殖能力吸光度显著高于非HGF干预组(P0.05),粘附细胞数和迁移细胞数比较差异均无统计学意义(均P0.05)。结论 HGF可显著增强冠心病患者外周血中EPCs增殖、粘附和迁移等生物学功能。     

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

背景：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染缸管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。目的：构建VEGF表达载体，并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。设计、时间及地点：观察性试验，于2007-12／2008-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。材料：质粒PDC315-VEGFl65自备，质粒pIRES2-EGFP由美国国立卫生研究院Stanko Stojilkovic教授惠赠。方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体pIRES2-EGFP-VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录．聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平，ELISA检测VEGF165蛋白表达情况。结果：成功构建VEGF真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF。转染重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF后，在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGF165蛋白表达水平均明显增加。结论：VEGF表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

他汀类药物和促红细胞生成素对人外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的:观察他汀类药物和促红细胞生成素对外周血内皮祖细胞数量和迁移功能以及增殖功能的影响,并比较其作用效应。方法:实验于2004-06/2005-10在华中科技大学附属协和医院血研所实验室完成。采集来华中科技大学附属协和医院体检的正常人自愿者外周血标本36份,分离培养内皮祖细胞1周后,将贴壁细胞随机分成4组:①对照组:用含体积分数为0.02的胎牛血清M199培养基。②阿托伐他汀组:用1mmol/L阿托伐他汀处理培养基。③人重组促红细胞生成素组:用100IU/L人重组促红细胞生成素处理培养基。④联合组:用1mmol/L阿托伐他汀与100IU/L人重组促红细胞生成素联合处理培养基。培养24h后,检测并比较各组15个随机选择的×200视野的内皮祖细胞的数量,迁移能力以及增殖能力。结果:①内皮祖细胞数量:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。②内皮祖细胞迁移能力:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。③内皮祖细胞增殖能力:他汀组,促红细胞生成素组,联合用药组均较对照组有显著提高(P<0.01),他汀组和促红细胞生成素组间并无差异(P>0.05),而联合用药组与前三组相比均有显著性差异(P<0.01)。结论:他汀类药物阿托伐他汀和人重组促红细胞生成素均能在体外提高内皮祖细胞的数量,迁移能力以及增殖能力,且联合用药该效应更加明显。由于内皮祖细胞在心血管疾病的治疗中起着重要的作用,这两类药的联合应用将具有积极的临床意义。     

改性聚乙二醇水凝胶封装生长因子和内皮祖细胞及其可控性缓释

背景：大量研究表明,为了实现聚合物材料的内皮细胞化,向材料表面负载生物活性因子是一种重要的手段,并且在聚合物材料表面引入人体血管内皮细胞将有助于提高材料的生物相容性。 目的：合成封装碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和内皮祖细胞的水凝胶,观察生长因子的缓释效果,以及内皮祖细胞在水凝胶中的培养状态。 方法：合成含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽段的聚乙二醇水凝胶,先后加入大鼠内皮祖细胞、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子溶液、基质金属蛋白酶反应底物肽段溶液。将上述水凝胶浸泡于PBS中,每12h用ELISA法检测上清液中生长因子的水平;72h后在水凝胶PBS溶液中再分别加入不同质量的基质金属蛋白酶2（100,1000ng）、基质金属蛋白酶9（100,1000ng）,每12h用ELISA法检测上清液中生长因子的水平。将封装内皮祖细胞的聚乙二醇水凝胶置于培养基中培养5d,消化后用流式细胞仪检测存活细胞数。 结果与结论：12—72h内,碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子的释放百分比一直维持在41％左右,72h后分别加入不同质量的基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9,发现两种细胞因子的释放百分比呈稳步上升,72h后已达95％以上,且基质金属蛋白酶质量越大两种因子的检测释放百分比越高。培养5d后,在聚乙二醇水凝胶中仍有88．17％的内皮祖细胞存活。表明白组装聚乙二醇水凝胶既可以实现碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子的可控性释放,又可以支持内皮祖细胞的增殖生长。     

他汀类药物和促红细胞生成素对人外周血内皮祖细胞数量和功能的影响

目的：观察他汀类药物和促红细胞生成素对外周血内皮祖细胞数量和迁移功能以及增殖功能的影响，并比较其作用效应。 方法：实验于2004-06／2005-10在华中科技大学附属协和医院血研所实验室完成。采集来华中科技大学附属协和医院体检的正常人自愿者外周血标本36份，分离培养内皮祖细胞1周后，将贴壁细胞随机分成4组：①对照组：用含体积分数为0．02的胎牛血清M199培养基。②阿托伐他汀组：用1mmol／L阿托伐他汀处理培养基。③人重组促红细胞生成素组：用100IU／L人重组促红细胞生成素处理培养基。④联合组：用1mmol／L阿托伐他汀与100IU/L人重组促红细胞生成素联合处理培养基。培养24h后，检测并比较各组15个随机选择的&;#215;200视野的内皮祖细胞的数量，迁移能力以及增殖能力。 结果：①内皮祖细胞数量：他汀组，促红细胞生成素组，联合用药组均较对照组有显著提高（P〈0．01），他汀组和促红细胞生成素组间并无差异（P〉0．05），而联合用药组与前三组相比均有显著性差异（P〈0．01）。②内皮祖细胞迁移能力：他汀组，促红细胞生成素组，联合用药组均较对照组有显著提高（P〈0．01），他汀组和促红细胞生成素组间并无差异（P〉0．05），而联合用药组与前三组相比均有显著性差异（P〈0．01）。③内皮祖细胞增殖能力：他汀组，促红细胞生成素组，联合用药组均较对照组有显著提高（P〈0．01），他汀组和促红细胞生成素组间并无差异（P〉0．05），而联合用药组与前三组相比均有显著性差异（P〈0．01）。 结论：他汀类药物阿托伐他汀和人重组促红细胞生成素均能在体外提高内皮祖细胞的数量，迁移能力以及增殖能力，且联合用药该效应更加明显。由于内皮祖细胞在心血管疾病的治疗中起着重要的作用，这两类药的联合应用将具有积极的临床意义。     

人脐带血内皮祖细胞体外培养和鉴定

背景:传统免疫磁珠法分选内皮祖细胞的方法操作复杂、费用大,细胞获得率较低,且内皮祖细胞的增生及分化受限.目的:尝试改良人脐带血内皮祖细胞体外诱导分化及鉴定的方法,为实现内皮祖细胞移植、改善血管功能提供足量细胞来源.方法:采用密度梯度离心方法获得人带血单个核细胞,体外进行诱导、分化和扩增,通过免疫组织化学、免疫荧光和流式细胞仪等技术对脐血来源的内皮祖细胞进行鉴定.结果与结论:脐带血单个核细胞在培养过程中出现梭形贴壁和铺路石样等形态;在细胞培养至第7天,免疫组织化学显示:CD31、vWF在体外培养过程中的表达阳性;免疫荧光染色表明:(83.0±4.3)%的贴壁细胞双染呈阳性,并且DiI-acLDL标记的内皮祖细胞红色荧光在体外可以持续6周以上;第7天贴壁细胞流式细胞仪分析显示:CD34、CD133和KDR分别为(17.8±3.7)%、(22.1±4.4)%、(81.5±5.0)%.结果提示,实验成功从脐带血单个核细胞中分离培养出内皮祖细胞,在其体外可扩增并向为内皮细胞方向分化.     

Number and activity of endothelial progenitor cells from peripheral blood in patients with hypercholesterolaemia

Hypercholesterolaemia contributes to atherosclerosis and coronary artery diseases by inducing endothelial cell injury and dysfunction. Recent studies have provided increasing evidence that EPCs (endothelial progenitor cells) participate in ongoing endothelial repair and postnatal neovascularization. However, the changes in EPCs in patients with hypercholesterolaemia have not been elucidated to date. Therefore we investigated the number and functional activity of EPCs in patients with hypercholesterolemia. Total MNCs (mononuclear cells) were isolated from 20 patients with hypercholesterolaemia and 20 matched control subjects. EPCs were characterized as adherent cells double-positive for DiI-LDL (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanide percholate-labelled low-density lipoprotein) uptake and lectin binding by direct fluorescent staining under a laser scanning confocal microscope, and were characterized further by demonstrating the expression of KDR (kinase insert domain-containing receptor), CD34 and AC133 by flow cytometry. Proliferation, migration and in vitro vasculogenesis activity of EPCs were assayed using the MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] assay, modified Boyden chamber assay and an in vitro vasculogenesis kit respectively. EPC adhesion assay was performed by replating cells on fibronectin-coated dishes and then counting the adherent cells. As a result, the number of EPCs was significantly reduced in patients with hypercholes-terolaemia compared with that in control subjects (41.8 +/- 8.7 compared with 64.5 +/- 16.6 EPCs/x 200 field respectively; P < 0.05). The number of EPCs was inversely correlated with total cholesterol (r = -0.659, P < 0.001) and LDL-cholesterol (r = -0.611, P < 0.001) levels. In addition, the functional activities of isolated EPCs, such as proliferative, migratory, adhesive and in vitro vasculogenesis capacity, were also impaired. In conclusion, the results of the present study may state a novel pathophysiological mechanism of hypercholesterolaemia: the reduction of EPCs with decreased functional activity.     

不同来源内皮祖细胞培养及其生物学特性比较

背景:在缺血性疾病中,机体的代偿性反应包括细小动脉形成和血管新生,而内皮祖细胞在其中发挥着重要的作用,参与了机体多种生理、病理性血管重建过程.目前对内皮祖细胞的来源、生物学特性还存在许多争议.目的:分离培养人外周血、脐带血、骨髓以及脐带来源的内皮祖细胞,并对其生物学特性进行比较.方法:采用密度梯度离心法分离人外周血、脐带血以及骨髓单个核细胞进行贴壁培养,脐带来源的内皮祖细胞通过植块贴壁培养或胶原酶消化脐静脉内膜获得的单个核细胞进行贴壁培养.对获得的贴壁细胞进行细胞形态学、增殖活力、细胞周期、免疫表型的检测.结果与结论:①外周血与脐带血来源的贴壁细胞呈长梭形,集落状生长,其上附有成簇圆形细胞,随着培养时间延长,圆形细胞渐脱落,梭形细胞无明显增殖趋势,消化后细胞不能传代;流式显示细胞高表达CD45,部分表达KDR,但不表达CD31.②骨髓和脐带来源的贴壁细胞呈短梭形、多角形;传代后细胞增殖迅速,且细胞形态与增殖活力没有明显下降;多数细胞处于G0/G1期;流式检测显示细胞均不表达CD14、CD45,也不表达CD106、HLA-DR,但高表达CD44、CD90、CD62E、CD73、CD95、CD105;部分表达内皮系标记KDR、vWF;酶消化法获得的脐带内皮祖细胞还表达CD31;共聚焦显微镜扫描显示细胞具有吸收ac-LDL并结合UEA-1的能力.结果说明外周血、脐带血、骨髓与脐带组织中可分离培养出分化程度、增殖活力不同的内皮祖细胞.     

外周血内皮祖细胞数量变化与颅内动脉瘤的生成

背景:动脉内膜损伤是动脉瘤发生的始动因素,内皮祖细胞能修复受损的动脉内膜.目的:建立大鼠颅内动脉瘤模型,探讨动脉瘤大鼠内皮祖细胞数量变化及意义.方法:40只SD大鼠随机分为两组,正常组作为正常对照,不给予任何干预.模型组大鼠手术结扎双侧肾动脉后支以及左侧颈总动脉,术后喂食含8%氯化钠鼠粮.于2周,1,2,3个月末测量大鼠内皮祖细胞变化,并与3个月末测量各组大鼠血压及动脉瘤大小,RT-PCR检测willis环相关基因表达.结果与结论:模型组大鼠内皮祖细胞数目于2周后就开始下降,与正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05),一直持续到3个月末(P < 0.01).模型组大鼠动脉瘤壁基质金属蛋白酶9表达明显高于正常组正常大鼠(P < 0.01),而内皮型一氧化氮合酶明显低于正常(P < 0.05).结果提示循环内皮祖细胞数量降低可能是动脉瘤生成的一个重要因素.