抗磷酸胆碱B细胞k链V基因经基因置换重排至Jk下游区的研究

为探讨外来抗原－－磷酸胆碱（ＰＣ）激发的抗体反应中是否存在基因置换的调节机制，采用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），序列分析及Ｓｉｏｕｔｈｅｒｎ杂交对三种来自抗ＰＣ Ｂ细胞单抗的重，轻链进行了分析，结果显示：（１）三种单抗具有相同的重、轻链Ｖ（Ｄ）Ｊ表型及ＶＨ与ＶＬ拼接顺序，提示三者源于共同的Ｂ细胞前体，（２）在２４－１Ｂ１０和２４－１Ｂ１１杂交瘤的抗体轻链中，ＶＫ区与ＪＫ２相连；而在２４－２Ｂ２中     

重症肌无力T细胞受体基因重排的研究

<正>重症肌无力(MG)是抗体介导的自身免疫病,自身抗体的产生依赖于T细胞;T细胞受体(TCR)是T细胞表面识别特异抗原的结构.我们用限制性片段长度多态性(RFLP)方法检测MG患者TCR基因重排,以了解TCR分子的多样性程度,为寻找特异免疫疗法提供线索.1 材料与方法20例MG患者及15例正常对照,每例取抗凝外周血7ml,离心分离淋巴细胞,按常规用蛋白酶K方法分离总DNA.取10μg DNA分别以EcoRI、HindⅢ及Bg1Ⅱ酶切,经电泳分离并变性后转移到尼龙膜上,与TCR-α、β及γ探针进行Southern杂交.放射自显影.     

IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用

 目的：建立准确可靠、操作性强、适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain,IgH）基因单克隆重排检测方法,用于B细胞性非霍奇金淋巴瘤（B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL）的辅助诊断。方法：采用骨架区(framework region,FR）引物FR2、FR3和重链连接区 （joining region of heavy chain,J_H）引物LJH、VLJH组合、A管+B管模式、半巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法对121例B-NHL、58例T细胞性非霍奇金淋巴瘤（T-cell non-Hodgkin lymphoma,T-NHL）和19例淋巴结反应性增生的石蜡组织进行IgH基因单克隆重排检测,分析IgH基因单克隆重排检出率在B-NHL组、T-NHL组和淋巴结反应性增生组中的差异,以及B-NHL中联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3之间IgH基因单克隆重排检出率的差异。结果：118例成功检测的B-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为81%（96/118）;54例成功检测的T-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为4%（2/54）;19例成功检测的淋巴结反应性增生中未检出IgH基因单克隆重排。B-NHL组与T-NHL组、淋巴结反应性增生组相比,IgH基因单克隆重排检出率差异具有显著性（P<0.05）。B-NHL中, FR2基因单克隆重排检出率为58%（68/118）,FR3基因单克隆重排检出率为55%（65/118）,联合应用FR2和FR3,IgH基因单克隆重排检出率为81%（96/118）,联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3的检出率有显著差异（P<0.05）。结论：采用FR2、FR3、LJH及VLJH引物组合、A管+B管模式和半巢式PCR法进行石蜡组织IgH基因单克隆重排检测,简单易行,结果准确可靠,阳性率较高,可用于临床B-NHL的辅助诊断。     

抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达

目的 获得鼠抗人精浆蛋白单抗（mAb)κ链基因，并将其转染到HeLa细胞进行表达。方法 从分泌抗人精浆蛋白mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA，用RT－PCR法获取κ链cDNA。将其克隆入真核表达载体pcDNA3，用脂质体转染法转染HeLa细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠mAb杂交瘤细胞系E4B7中克隆了κ链基因。序列测定表明，Vκ属于鼠免疫球蛋白XⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体pcDNA3-E4B7κ转染HeLa细胞后，在HeLa细胞中检测到了κ链的表达。结论 获得了序列正确的κ链基因，并在HeLa细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Fab段打下了良好基础。     

抗结肠癌单抗κ轻链基因的克隆和序列分析

小鼠抗结肠癌单抗ＣＬ－３经体内、外研究证实它对结肠癌细胞具有很高的特异性。为了使该单抗能够应用于肿瘤导向治疗，我们采用基因工程技术，从ＣＬ－３杂交瘤细胞系中克隆出了ＣＬ－３单抗κ轻链基因，并对该基因的全部核苷酸序列进行了测定。     

下一代测序技术在弥漫大B细胞淋巴瘤基因重排检测中的应用

目的探究下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)辅助诊断中的应用价值。方法收集陕西省人民医院病理科存档的20例组织蜡块,其中15例诊断为DLBCL,5例诊断为淋巴组织反应性增生(reactive lymphoid hyperplasia, RLH)。采用天根公司石蜡包埋组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,安捷伦4200评价DNA质量。采用LymphoTrack IGH FR2 Assay和LymphoTrack Dx TCRG Assay进行组织克隆性测定。结果 5例RLH均为多克隆性,11例DLBCL出现NGS IgH FR2单克隆重排(阳性率73.3%,11/15),另有4例未检测出单克隆性重排(2、5、8、15号)。15例中有3例出现TCRG重排性扩增(6、7、14号)。经PCR凝胶电泳法进行验证:4例NGS检测的IgH FR2多克隆性病例均检测到IgH单克隆性基因重排;3例NGS检测到TCRG单克隆性重排病例中,PCR凝胶电泳法只检测到1例呈TCRG克隆性重排。结论高通量测序方法特异性较高,但由于其检测过程复杂,影响因素较多,检测方法的敏感性受到一定影响。虽然该方法可以准确得到基因重排序列,但由于其检测成本较高,对技术平台和人员要求更高,其在临床上的应用尚需时日。     

基于TCR基因位点的FT-aCGH分析鉴定T-ALL中异常TCR Vβ-IgH重排

目的:鉴定T细胞-急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)异常基因重排。方法:利用基于T细胞受体(TCR)基因位点的精细定位的寡核苷酸阵列比较基因组杂交(FT-aCGH)技术分析1例T-ALL样本与对照组基因组DNA的差异,了解7号和14号染色体TCRβ、TCRγ和TCRαδ位点上可能的断裂点位置,根据所提供的初步结果,根据断裂点涉及的基因序列设计特异引物,采用连接介导PCR(LM-PCR)和序列分析等方法分析与之发生重排的基因序列。结果:FT-aCGH结果显示所检测T-ALL样本中,各TCR基因位点都存在断裂点,经过LM-PCR和序列分析,以及利用PCR和特异引物检测基因组DNA结果确定了T-ALL克隆为Vα8-Jα22基因重排,并发现了7号染色体在TCRβ基因位点,Vβ20-1基因片段与14号染色体位于免疫球蛋白重链区基因位点的IgHVII-26-2基因片段发生异常重排,形成t(7;14)(q34;q32)染色体易位。结论:利用FT-aCGH和LM-PCR技术在1例T-ALL中发现了一种新的Vβ20-1-IgHVII-26-2异常重排,这种异常重排有可能可以作为该肿瘤克隆的生物标记物。     

Hodgkin病单个H/R-S细胞Ig基因重排的研究

目的 探讨Ｈｏｄｇｋｉｎ病（ＨＤ）Ｈｏｄｇｋｉｎ／Ｒｅｅｄ－Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（Ｈ／Ｒ－Ｓ）。方法 从８例ＨＤ溶冻切片上共提取Ｈ／Ｒ－Ｓ细胞６８个,用ＩｇＨ通用引物ＦＲⅢａ／ＪＨ和κ、λ轻链家族性特性性引物行ＰＣＲ检测。结果 １例淋巴细胞为主型（ＬＰ）ＨＤ的Ｈ／Ｒ－Ｓ细胞重复出现ＩｇＨ和Ｖκ家族重排;２例结节硬化型ＨＤ（ＮＳＨＤ）中,１例Ｈ／Ｒ－Ｓ细胞有单次的ＩｇＨ、Ｖκ４和Ｖλ３重排;１列有重复     

伴有MYC基因重排和11q异常的高级别B细胞淋巴瘤的临床病理学分析

目的 探讨伴有MYC基因重排和11q异常的高级别B细胞淋巴瘤(high grade B cell lymphoma with concurrent MYC rearrangement and 11q aberrations, HGBCL-MYC-11q)的临床病理特征、分子遗传学特征、治疗及预后。方法 收集3例HGBCL-MYC-11q的临床资料,行HE、免疫组化EnVision法染色、EBER原位杂交和FISH检测,并复习相关文献。结果 患者均为男性,年龄分别为10、61和74岁。Ann Arbor分期均为Ⅳ期。3例均为活检,分别发生于鼻咽部、上咽部和回盲部。3例形态学相似,肿瘤细胞弥漫浸润性生长,细胞中等大或中等偏大,形态较单一,细胞核圆形到稍不规则,染色质细腻,核分裂象易见;1例局灶可见坏死;1例“星空”现象明显。肿瘤细胞均表达CD20、BCL6和MUM1;2例表达CD10,2例表达BCL2;Ki67增殖指数高(例1、例3近100%,例2约70%);不表达CD3、CD30和TDT;EBER原位杂交检测均为阴性。FISH检测3例均见C-MYC基因重排及11q异常,其中1例仅见11q...     

T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用

目的：探讨T细胞受体( T cell receptors, TCR)基因重排检测对T细胞性淋巴瘤诊断的价值。方法收集T细胞性淋巴瘤30例和淋巴反应性增生组织30例,提取DNA,应用BIOMED-2引物系统中的56条引物进行PCR扩增,核酸分子异源双链凝胶电泳分析结果。结果30例T细胞性淋巴瘤标本中TCRβ、TCRγ、TCRδ的检出率分别为83．3%(25/30)、93．3%(28/30)、13．3%(4/30),三者联合检测的检出率为96．7%(29/30),30例淋巴反应性增生组织中均未检测出TCR基因重排。结论利用BIOMED-2引物系统检测TCR 基因重排可作为T细胞性淋巴瘤的辅助诊断工具。     

B细胞非霍奇金淋巴瘤IgH基因重排检测及凝胶扫描技术应用的初步研究

目的 采用凝胶扫描技术,力求对采用聚合酶链反应(PCR)检测非霍奇金淋巴瘤(NHL)抗原受体基因重排结果分析时建立量化标准,以利于临床医师应用时客观判断,并为其筛选随访病例提供依据。方法用PCR对96例B-NHL分别采用IgH FR3A及FR2A检测IgH基因克隆性重排。65例经IgH FR3APCR已证实为IgH基因克隆性重排B-NHL及8例良性病变淋巴组织和5例正常人外周血单核细胞,IgH FR3APcR产物8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染后图像行凝胶扫描,绘制曲线并计算h1／h2比值。结果(1)采用FR3A引物,克隆性IgH基因重排在96例B-NHL中检测率为68％,采用FR2A引物,检测率为61％,结合FR3A、FR2A引物,总检测率为83％。(2)凝胶扫描曲线示65例B-NHL的h1／h2均＞3,而5例正常人外周血单核细胞曲线均表现为钟型,8例良性病变淋巴组织h1／h2比值均＜1．5。结论非霍奇金淋巴瘤抗原受体基因重排检测的凝胶扫描分析曲线中,h1／h2峰高比值至少＞3可提示为IgH基因克隆性苇排,＜1．5可能提示IgH基因多克隆重排。比值介于1．5和3之间,提示有随访意义。联合FR3A,FR2A引物,可提高B-NHL IgH基因克隆性重排的检测率。     

MALToma Ig重链蛋白、IgH基因重排/断裂检测的临床意义

目的探讨Ig重链蛋白、IgH基因重排/断裂在黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma,MALToma)诊断中的应用价值。方法选取40例MALToma作为实验组,15例反应性淋巴组织增生(reactive lymphoid hyperplasia,RLH)作为对照组,应用免疫组化、PCR、FISH技术分别检测两组中Ig重链蛋白、IgH基因重排、IgH基因断裂情况。结果(1) Ig重链蛋白表达根据免疫组化结果可分为三种模式:单种Ig重链蛋白表达(模式Ⅰ)、Ig重链蛋白全阴性(模式Ⅱ)、多种Ig重链蛋白表达(模式Ⅲ)。实验组模式Ⅰ/Ⅱ的阳性率(87. 5%)显著高于对照组(0)(P 0. 01)。(2)实验组IgH基因重排、IgH基因断裂的阳性率分别为72. 5%(29/40)、32. 5%(13/40),而对照组未检出IgH基因重排、IgH基因断裂(P 0. 01,P 0. 05)。(3) Ig重链蛋白模式Ⅰ/Ⅱ和IgH基因重排联合检测以及Ig重链蛋白模式Ⅰ/Ⅱ、IgH基因重排和IgH基因断裂联合检测的阳性率均高达97. 5%。(4)在Ig重链蛋白模式Ⅱ中,有9例检出IgH基因断裂(90%);在模式Ⅰ/Ⅲ中,仅有4例检出IgH基因断裂(13. 3%),两组相比差异有统计学意义(P 0. 01)。Ig重链蛋白表达和IgH基因断裂呈正相关(rs=0. 323,P0. 05)。结论联合检测Ig重链蛋白表达模式和IgH基因重排可有效辅助鉴别MALToma和RLH; IgH基因断裂可能与Ig重链蛋白表达缺失高度相关。     

BCL-2、BCL-6、C-MYC基因重排的高级别B细胞淋巴瘤临床病理分析

目的探讨C-MYC、BCL-2和BCL-6基因重排的高级别B细胞淋巴瘤(high-grade B-cell lymphoma,HGBL)的病理形态、免疫表型及治疗方案。方法收集58例B细胞淋巴瘤患者临床资料,对其进行免疫组化及基因检测。结果 58例B细胞淋巴瘤中伴有C-MYC、BCL-2和BCL-6重排的HGBL仅1例,C-MYC和BCL-2、C-MYC和BCL-6重排各1例。3例患者均为中老年人,临床表现多为多部位受累,1例乳酸脱氢酶水平升高,Ann Arbor分期均为Ⅲ+Ⅳ期;生存期短。3例HGBL免疫组化检测均为生发中心B细胞型,Ki-67增殖指数均较高(90%～95%)。结论伴有BCL-2、BCL-6、C-MYC基因重排的B细胞淋巴瘤侵袭性强,常伴多部位及淋巴结外侵犯,分期晚,治疗反应差,诊断时需结合组织病理学和FISH基因检测结果,且需与其他类型的淋巴瘤相鉴别。     

BIOMED-2聚合酶链反应Ig基因重排对成熟非霍奇金B细胞淋巴瘤诊断的价值

目的 探讨BIOMED-2聚合酶链反应(PCR)在成熟非霍奇金B细胞淋巴瘤(B-NHL)诊断中的价值.方法 收集成熟B-NHL组织标本72例,其中弥漫性大B细胞淋巴瘤37例,黏膜相关淋巴组织结外边缘区淋巴瘤35例为研究对象,并以反应性增生病变25例作为对照.提取以上组织的DNA,并以PCR来检测其完整性和可扩增性,选取质量合格的DNA.85.6%(83/97)的样品DNA长度>300 bp,其中60例成熟B-NHL和23例反应性增生可用于BIOMED-2 PCR检测免疫球蛋白重链(IgH)和kappa轻链(IgK)基因重排的克隆性.结果 利用BIOMED-2 PCR检测的60例成熟B-NHL中,57例存在Ig基因的克隆性重排,其检测敏感性为95%,23例反应性增生病例中未出现Ig基因的克隆性重排,其检测特异性为100%.结论 BIOMED-2 PCR适用于石蜡包埋组织.该方法具有很高的敏感性和特异性,对成熟B-NHL诊断的辅助价值很高.     

正常人外周血和胸腺T细胞中TCR δRec151051—Jδ1和δRec151298—Jδ1基因重排的分布特点

目的 分析正常人外周血和胸腺细胞中TCR δRec151051-Jδ1和δRec151298-Jδ1基因重排分布特点。方法 利用半巢式和巢式PCR扩增10例正常人外周血单个核细胞（PBMCs）、4例分选的外周血CD3^ T细胞和7例正常人胸腺细胞DNA的TCR δRec基因与Jδ1、Dδ3和ψJa重排的基因片段,从不同含量DNA的PCR分析,了解其重排分布频率。结果 TCRδRec151051分别与Jδ1、Dδ3和ψJa的重排和TCR δRec151298-Dδ3重排见于大多数外周血T细胞和胸腺细胞中,而TCR δRec151298与Jδ1和ψJa的重排则多见于胸腺细胞中,对不同含量的DNA的PCR分析显示δRec重排的分布频率在外周血和胸腺细胞有所不同。结论 TCR δRec151051、TCR δRec151298与Jδ1、Dδ3和ψJa的重排均存在于多数正常人T细胞中,TCR δRec151051-Dδ3最常见于成熟和未成熟T细胞中,而TCR δRec151298-Jδ1和TCR δRec151298-ψJa则主要见于未成熟T细胞中。     

多重PCR方法检测多发性骨髓瘤患者重排基因的研究

目的　探讨分子生物学方法在多发性骨髓瘤诊断中的意义。方法　采用多重 Ｐ Ｃ Ｒ 联合 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交方法检测２９ 例多发性骨髓瘤患者骨髓及外周血标本 Ｉｇ Ｈ Ｃ Ｄ ＲⅢ及 Ｔ Ｃ Ｒ ＶγⅠ Ｊγ重排基因。结果　８９ ．７ ％ （２６／２９） 和６５ ．５ ％ （１９／２９） 的患者骨髓标本存在 Ｉｇ Ｈ 及 Ｔ Ｃ Ｒ ＶγⅠ Ｊγ重排基因,而在外周血标本,仅５５ ．２ ％ （ １６／２９） 和３７ ．９ ％ （１１／２９） 存在 Ｉｇ Ｈ 及 Ｔ Ｃ Ｒ 重排基因。联合检测 Ｉｇ Ｈ Ｃ Ｄ ＲⅢ和 Ｔ Ｃ Ｒ ＶγⅠ Ｊγ重排基因,９３ ．１ ％ （２７／２９） 骨髓标本及５８ ．６ ％ （１７／２９） 外周血标本存在 Ｉｇ Ｈ 或／ 和 Ｔ Ｃ Ｒ 重排基因,外周血标本Ⅱ期和Ⅲ期患者重排基因阳性率（７１ ．４ ％ ） ,显著高于Ⅰ期患者（２５ ％ ）（ Ｐ＜ ０ ．０５） 。结论　 Ｐ Ｃ Ｒ 技术检测多发性骨髓瘤患者重排基因对诊断是有帮助的, 尤其是骨髓标本。多重 Ｐ Ｃ Ｒ 方法可在一个 Ｐ Ｃ Ｒ 循环中同时扩增两个重排基因,更简便、经济,更适宜临床实际应用。     

中线T细胞淋巴瘤的TCR—γ基因重排研究

目的对中线Ｔ细胞淋巴瘤的克隆性进行研究。方法用一组针对Ｔ细胞受体γ链基因Ｖ区片段的家族特异性引物和ＰＣＲ方法,对１１例（２２个标本）中线Ｔ细胞淋巴瘤病例进行了Ｔ细胞受体γ基因重排的检测。结果２２个标本中２１个有Ｔ细胞受体γ链基因的克隆性重排（９４４５％）。在９例原发灶的连续活检和１例原发灶及其转移灶的标本中均未发现增生的克隆家族的改变。结论中线Ｔ细胞淋巴瘤的病变组织中存在Ｔ细胞的单克隆性增生,为该肿瘤的Ｔ细胞起源提供了分子生物学的证据。在中线Ｔ细胞淋巴瘤的疾病过程中（包括转移灶）增生Ｔ细胞的家族未发生变化,支持肿瘤的单克隆起源学说     

化疗前后B-NHL淋巴瘤IgH基因重排变化的研究

目的B—NHL是我国较多见的肿瘤之一。通过对B—NHL患者化疗前后IgH基因重排变化的观察，探讨IgH基因单克隆重排带对B—NHL的诊断价值及能否作为B—NHL化疗缓解后的分子指标之一。方法对20例B—NHL初治化疗前及化疗缓解后患者用两种PCR方法进行IgH基因重排物的检测，同时用10例非淋巴瘤肿瘤组化疗前及化疗缓解后患者及10例健康人以作对照。结果20例初治化疗前B—NHL患者18例检测到IgH基因单克隆重排带，化疗缓解后此18例中1例IgH基因单克隆重排带转阴，另出现2或3克隆性重排带各2例，总变化率为27．8％，余未变化。2例IgH基因单克隆重排带阴性者化疗后依然阴性。对照的非淋巴瘤肿瘤组化疗前及化疗缓解后患者及健康人IgH基因单克隆重排带均为阴性，患者治疗后也未见改变。结论IgH基因单克隆重排带，可以作为B—NHL及其微小残留灶克隆性变化的辅助诊断指标之一。     

抗BAFF单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆及鉴定

目的:在本实验室成功制备小鼠抗人BAFF单克隆抗体的基础上,通过分子克隆方法获得该抗体可变区基因序列。方法:从1株小鼠抗人BAFF单克隆抗体杂交瘤细胞FMMUB4中提取总RNA,以此为模版反转录成cDNA,用针对小鼠单克隆抗体重链和轻链可变区基因序列的特异性引物分别进行PCR反应,PCR产物连接入载体,经筛选阳性克隆、酶切鉴定后送测序,测序结果进行生物信息学分析。结果:成功克隆了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因,测序结果证实序列正确。结论:获得了抗BAFF单克隆抗体FMMUB4重链和轻链可变区基因序列,为下一步构建相关基因工程抗体打下良好基础。