骨髓间充质干细胞研究进展

骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。     

人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立

目的：建立并优化骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）分离纯化及培养扩增的方法。方法：利用Ｐｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）及Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（１．０７７ｇ／ｍｌ）两种分离介质分离骨髓单个核细胞,筛选体外培养ＭＳＣｓ适宜的血清及浓度,通过流式细胞术分析鉴定ＭＳＣｓ的纯度。结果：经Ｐｅｒｃｏｌｌ分离,应用１０％筛选出的血清培养与扩增的ＭＳＣｓ,细胞纯度可达９５％左右;相反,应用常规Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ分离骨髓单个核细胞或增加血清浓度,ＭＳＣｓ纯度显著下降。结论：建立了一种稳定而实用的体外分离与培养ＭＳＣｓ的方法。     

鼠间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的研究

目的:探讨干细胞向成骨细胞诱导分化的特征。方法:利用成骨细胞诱导体系诱导小鼠骨髓间充质干细胞系(D1细胞)向成骨细胞定向分化,D1细胞诱导不同时间后,运用免疫组化方法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP),Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL1)的表达;RT-PCR检测Osterx和OCN mRNA的表达。结果:细胞诱导培养3、7、14和21 d后结果显示:3 d时ALP、COL1呈阴性表达,7 d ALP呈阳性表达,14 d ALP表达最高,21 d ALP表达明显减少;7 d COL1呈阳性表达,14 d和21 d表达显著增强;14 d有矿化结节形成,21 d形成典型的矿化结节。7 d时OSX和OCN基因表达上调,14 d时OSX基因表达下调,21 d其表达上调;14 d时OCN表达上调,21 d后表达下调。结论:间充质干细胞能定向诱导为成骨细胞,OSX基因的表达是其分化的关键。     

骨髓间充质干细胞体外培养和成骨诱导

目的：观察骨髓问充质干细胞（MSC）体外培养及诱导成骨分化的特征。方法：采用密度梯度离心和体外扩增培养人骨髓MSC,并进行成骨诱导。应用茜素红染色法和钙钴法分别进行成骨诱导的MSC钙化结节检测和碱性磷酸酶（ALP）检测。结果：MSC成骨细胞诱导培养第l～3天的细胞增殖旺盛,3～5d即融合成单层。随着诱导培养时间的延长,细胞逐渐堆积并矿盐沉积,形成矿化结节。培养14d和21d后,矿化结节形成率分别为（70．5±3．5）％和（87．5±3．5）%,ALP染色阳性率分别为（41．5±1．5）％和（85．2±1．7）％。结论：在体外培养条件下,骨髓MSC可诱导分化为具有含矿化结节及ALP阳性特征的骨样细胞。     

间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

间充质干细胞是用于组织工程和细胞治疗的重要细胞,它可向成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等分化.生物化学因素和物理因素均对间充质干细胞向心肌细胞分化有影响.间充质干细胞向心肌细胞分化的研究主要集中在生物化学因素上.本文综述了在体外环境下生物化学因素以及力学和电磁刺激对间充质干细胞向心肌细胞分化影响的研究进展.     

猴骨髓间充质干细胞的分离及原代培养特性的研究

目的：探讨猴骨髓间充质干细胞(MSCs)低分化干细胞方面的特性。方法：以Percoll(质量密度1073g/L)非连续密度梯度离心分离出骨髓悬液中的骨髓间充质干细胞，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养，观察细脑的形态、生长状况及其超微结构。结果：原代培养的骨横间充质干细胞增殖缓侵，细胞增殖率和形态分化不均一。如有一些细脑在4wk的培养时间内末见明显增殖，这些增殖不明显的细胞有的未见明显的伸展，呈圆形，有的伸展充分，成片状；在培养2wk后也可见一些明显增殖的细胞，分别形成克隆团状或条状的增生细胞群；培养过程中可见有神经元样及多核细胞出现。原代培养的骨髓间充质干细胞的超微结构也显示了低分化的干细胞特点，如细胞表面具有微绒毛，脑浆内内质网丰富、激离核糖体数量多、线粒体小，核仁大而不规则、可见核裂，超微结构还显示了一些中胚层来源于细瘤的结构特点，如大量的微丝。结论：经Percoll细胞分离介质分离出的骨髓间充质干细胞，在非诱导条件下原代培养过程中，从形态分化、增殖率等方面显示了其多向分化潜能；从超微结构等方面显示了其中胚层来源低分化细胞的特点。这些特点可作为骨髓间充质干细胞鉴定的佐证之一，说明Percoll非连续密度梯度离心法对骨髓间充质干细胞的分离具有可靠性。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化研究进展

骨髓间充质干细胞(MSC)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞群体,MSC既具有干细胞的特性又具有明显的可塑性,获取简便,体外培养条件不高,分离增殖能力强,可以自身获取,因此它可以作为种子细胞。与造血干细胞相比,MSC在疾病治疗上更为理想。目前MSC及其在组织工程方面的研究已取得较大进展。     

人骨髓间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化

为建立分离纯化、大鼠扩增人骨髓间充质MSC，改进其冰冻保存的方法，并初步探索其体内向软骨细胞分化的最佳方法，以Percoll(1.073g/ml）密度梯度离心法分离人骨髓中单个核细胞，用含经筛选的10％的胎牛血清的低糖DMEM体外培养扩增骨髓干细胞（MSC），FCM鉴定细胞纯度，传代2次以后的细胞吸附于明胶海绵内，以TGF－β为主要刺激因子体外诱导1周，植入裸鼠皮下。在不同的时间取出组织块，甲苯胺蓝染色显示细胞外基质。结果发现，体外培养扩增的人间充质MSC表达CD166、CD29、CD44等表面抗原，不表达CD34、CD45、HLA－DR等抗原；MSC可以不经消化，直接在原培养瓶内冻存在－70℃低温冰箱，3个月后复苏的细胞生物学特性没有明显改变；体外诱导的细胞植入裸鼠皮下4周后即出现软骨细胞特有的结构。说明骨髓MSC具有独特的生物学特征，体外培养的MSC具有体内成软骨能力，应用MSC构建软骨组织具有一定的可行性。     

真皮来源间充质干细胞的分离培养及成神经分化的研究

目的：研究真皮来源间充质干细胞的分离培养方法及其向神经细胞分化的条件及可行性。方法：取大鼠真皮组织，采用贴壁传代培养筛选法，分离培养真皮间充质干细胞，流式细胞术检测细胞周期，经β-巯基乙醇诱导，倒置显微镜下观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果：分离的早期贴壁的真皮来源间充质干细胞经过连续传代培养至第4代，细胞形态较为均一，86％的细胞处于G0／G1期，细胞表面波形蛋白表达阳性，但因子Ⅷ和角蛋白表达阴性。经β-巯基乙醇诱导，真皮间充质干细胞可向神经细胞分化，细胞突起增多，具有神经元的形态学特征，分化后的细胞表达神经元标志物——神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经微丝（NF-200）。结论：大鼠真皮组织中存在着成体多能干细胞，一定条件下可分化为神经元。提示真皮可能是成体多能干细胞的又—来源，有望在神经组织修复和再生中发挥作用。     

改良直接贴壁法体外分离培养兔骨髓间充质干细胞及其鉴定

目的 观察并鉴定兔骨髓间充质干细胞生物特性,建立一套简单、高效的培养方法.方法 采用直接贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞,倒置显微镜下观察其形态.MTT法测定其增殖水平并绘制其生长曲线.流式细胞仪测定第三代骨髓间充质干细胞表型.结果 细胞培养第5d,镜下见细胞呈小集落生长,形态呈多边形;7～8 d小集落融合成大集落,10d左右可传代.第二代细胞镜下呈梭形成纤维样细胞,即间充质干细胞;细胞生长曲线成S形;流式细胞仪检测细胞表达CD 73、CD 90、CD 105、不表达CD 34、CD 45.结论 改良直接贴壁法可获得大量、纯化、稳定的间充质干细胞.     

BMP12诱导恒河猴骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞

目的研究骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞的可能性。方法通过电穿孔法将外源基因BMP12导入骨髓间充质干细胞中，诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞；在形态学和分子生物学水平上对诱导后的细胞加以鉴定。结果光镜下，诱导后的细胞形态发生明显改变；RT-PCR结果表明，诱导后的细胞有BMP12和Collagen Ⅰ的mRNA表达，而没有Coilagen Ⅲ的mRNA表达；诱导后98.39％的细胞呈CD44^ 、HLA-DR^-。结论BMP12能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为腱细胞，间充质干细胞有可能成为肌腱组织工程种子细胞来源之一。     

骨髓间充质干细胞亚群心肌分化基因的筛选

目的利用基因芯片筛选小鼠骨髓间充质干细胞4个亚群的差异表达基因,寻找心肌分化特异性基因。方法将小鼠骨髓间充质干细胞通过CD45和CD31的磁珠分选,获得SCA-1^＋/CD45^-/CD31^-、SCA-1^＋/CD45^-/CD31^＋、SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^＋及SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^-4群细胞。采用基因芯片技术完成Agilent小鼠全基因4＊44K芯片表达谱基因检测,分析差异表达基因。根据基因芯片中所检测的基因表达量在SCA-1^＋/CD45^＋/CD31^＋亚群中最高,且为其他亚群表达量的两倍以上为原则,通过RT-PCR验证各亚群及未分选细胞中的差异基因的表达量。结果根据皮尔森关联算法计算4组细胞亚群之间的关联值位于0.979～0.995之间,通过RT-PCR检测发现,Rock2基因在SCA-1^＋CD45^-CD31^-亚群中表达最高,而在SCA-1^＋CD45^＋CD31^＋亚群中表达很低,Itga4在未分选群中表达最高;Cxadr在SCA-1^＋CD45^-CD31^-亚群中表达最高;Epor在SCA-1^＋CD45^-CD31^＋亚群中表达最高;myl3在SCA-1^＋CD45^＋CD31^＋亚群中表达最高。结论 Rock2、Cxadr、Itga4、Epor和myl3基因在干细胞亚群向心肌分化中发挥不同作用。     

法舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

 目的探讨HA-1077(fasudil,法舒地尔)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为表皮细胞的影响.方法采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞,免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测.设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2,采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测,观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响.结果采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs,分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞,随着时间延长,阳性率逐渐提高.7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5/8、CK10/13、CK19阳性率均远高于诱导组(P＜0.01).结论HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升,Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用.     

去舒地尔对人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的影响

目的 探讨HA-1077（fasuclil，法舒地尔）对人骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为表皮细胞的影响。方法 采用直接贴壁法培养并扩增人胚胎股骨骨髓干细胞，免疫细胞化学及流式细胞仪进行表面标志的检测。设对照组、诱导组、HA-1077诱导组1、HA-1077诱导组2，采用免疫细胞化学及流式细胞仪对各组细胞角质蛋白表达变化进行检测，观察其对MSCs分化为表皮细胞的影响。结果 采用直接贴壁法可以获得大量高纯度的人骨髓MSCs，分组培养后第2天开始出现少量细胞角质蛋白阳性表达细胞，随着时间延长，阳性率逐渐提高。7天后流式细胞仪显示单纯诱导组及HA-1077诱导组CK5／8、CKl0／13、CK19阳性率均远高于诱导组（P〈0．01）。结论 HA-1077可能通过抑制Rho-ROCK途径的激活从而促进MSCs体外培养中角蛋白表达的显著提升，Rho-ROCK途径可能在促进MSCs分化为表皮细胞过程中起着重要调控作用。     

在体诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞的初步观察

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs)分化为表皮细胞的可行性，方法：抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离、纯化间充质干细胞及培养扩增后，应用5－溴脱氧尿嘧啶（5－BardU)标记技术进行细胞标记。将已标记的细胞以注射方式回植到提供骨髓的香猪的皮内及皮下，分别于注射后1，2周取材，常规石蜡包埋，连续切片，行5－BrdU和角蛋白免疫组织化学染色，对比研究。结果：大多数5－BrdU阳性细胞聚集在真皮中的小血管周围。但有少数5－BrdU阳性标记细胞出现在表皮的棘层和颗粒层，并同时表达角蛋白，结论：在皮肤微环境下骨髓间充质干细胞具有分化为表歧细胞的潜能。     

糖皮质激素对DKK1基因调控骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的 观察不同浓度糖皮质激素刺激下骨髓间充质干细胞(BMSCs)中DKK1基因表达的变化及其对BMSCs增殖分化能力的影响.方法 分离培养人BMSCs,分为对照组[不含地塞米松(Dex)]、Dex8组(含10-8mol/L Dex)及Dex6组(含10-6mol/L Dex).分别用含0、10-8、10-6mol/L Dex培养液刺激BMSCs,采用Real-time PCR检测DKK1基因的表达量,并通过克隆形成实验检测其对BMSCs增殖能力的影响.分别用含0、10-8、10-6mol/L Dex的成骨诱导液及成脂诱导液刺激BMSCs,于3d后提取RNA,采用Real-time PCR检测DKK1基因、成骨基因(Runx2、OCN)及成脂基因(C/EBP、PPARγ)的表达量,并于3周后通过茜素红染色及油红O染色检测其对成骨、成脂分化能力的影响.结果 与对照组及Dex8组比较,Dex6组DKK1基因的表达最高,而对应的克隆形成能力最低.成骨诱导环境下,Dex8组Runx2、OCN的表达最高,而DKK1的表达最低,茜素红染色只有Dex8组出现钙化结节.成脂诱导环境下,Dex6组C/EBP、PPARγ及DKK1的表达最高,油红O染色Dex6组出现大量的脂滴.结论 高浓度糖皮质激素刺激下,DKK1表达上调,BMSCs增殖受抑.DKK1对BMSCs的骨向分化具有抑制作用,而对其脂向分化具有促进作用.糖皮质激素导致骨质疏松可能与其调控DKK1的表达、影响BMSCs的增殖和分化有关.     

成年鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养条件及定向分化为心肌样细胞的可行性。方法通过取成年SD大鼠股骨干骨髓,进行体外培养和传代,用10μmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)分别对原代、一代和三代MSC进行体外定向诱导,用免疫组化方法分析检测分化后细胞的心肌特异性抗原(肌丝蛋白、肌钙蛋白)并通过RT-PCR鉴定心肌细胞特异因子基因(ANP、GATA-4)的表达。结果原代、一代MSC在体外经5-aza诱导4周后,细胞形态无明显变化,而经5-aza诱导4周后的三代MSC形态变大,呈杆形、球形,诱导细胞相互连接,连接细胞出现肌管样结构。免疫组化检测经10μmol/L 5-aza诱导4周的原代、一代MSC未见肌丝蛋白、肌钙蛋白T阳性细胞,而诱导三代MSC肌丝蛋白阳性比例近20%,肌钙蛋白阳性比例约8%。RT-PCR显示诱导三代MSC 4周后有ANP和GATA-4心肌细胞特异基因表达。结论MSC能够在体外经5-aza诱导分化为心肌样细胞,具有向心肌细胞转化的潜力,是自体心肌细胞移植的一种良好供体。     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗脑瘫2年随访

 目的 观察自体骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)转化神经干细胞治疗脑瘫的临床效果。方法 选择2010-06至2011-06期间, GMFCS级别III～Ⅴ级,自愿接受干细胞移植的脑瘫患儿11例为移植组,同时选择年龄、性别及疾病严重程度相仿的11例脑瘫患儿为对照组。移植组采用hMSCs转化神经干细胞移植治疗和运动功能锻炼为主的康复治疗,对照组仅仅给予运动锻炼为主的康复治疗。采用脑瘫患儿粗大运动功能评定(GMFM)量表评价移植组和对照组在治疗前和治疗后1、3、6、12、18、24个月的GMFM得分。结果 (1)移植组治疗后1个月、3个月、6个月的GMFM较GMFM0上升率均明显高于对照组(P=0.025);移植组治疗后3个月GMFM3较1个月GMFM1的上升率比较有明显差异,而治疗后6个月GMFM6较3个月GMFM3的上升率比较无统计学差异,提示移植组运动能力在移植后2~3个月时快速显示明显的康复效果。对照组GMFM上升率无此特征;(2)随访12个月、18个月及24个月发现移植组和对照组的GMFM12、GMFM18、GMFM24较之前6个月的GMFM的上升率无差异,而较治疗之前的GMFM0的上升率有显著差异(P<0.01)。(3)两组治疗后1个月、3个月的语言商与治疗前语言商比较,上升率差异均无统计学意义,两组治疗后6个月、12个月移植组语言商较治疗前上升率明显高于对照组(P<0.01)而18个月及24个月随访提示语言商上升率较对照组无增快显现,但较治疗前语言商上升率有明显差异(P<0.05)。结论 hMSCs转化神经干细胞移植治疗脑瘫安全,有效,对脑瘫患儿的运动功能改善明显,在移植后3个月明显显效。6个月以后运动康复效果逐渐消失,但患儿运动能力无倒退现象。语言功能的改善显效较晚,在移植治疗后6个月后显效,12个月后语言快速改善效果消失,但没有语言能力的倒退。