钠泵抑制物噬菌体单链抗体库的构建

目的　应用噬菌体展示技术构建钠泵抑制物单链抗体库 .方法　用 OUA- OVA(ouabain- ovalbumin)免疫小鼠 ,取脾脏 ,分离淋巴细胞 ,提取 m RNA,逆转录成 c DNA第一链 ,用简并引物经 PCR分别扩增轻、重链抗体库 ,经重叠延伸PCR由 L inker将轻、重链拼接成 Sc Fv(单链抗体 ) ,用 RS引物以 Sc Fv为模板进行第 2次 PCR,同时在 5 及 3 端分别加上 Sfi I,N ot I酶切位点 .经 Sfi I,N ot I酶切后 ,在 T4连接酶的作用下将 Sc Fv与 p CANTAB 5 E噬菌粒连接 ,电转化进入TG1大肠杆菌 ,挑取 12个单菌落提取质粒用 Eco R 和 H ind 进行酶切鉴定 ,后经 M13KO7辅助噬菌体拯救 ,离心收集上清即为全套 Sc Fv基因的噬菌体表面展示文库 .结果　以OU A- OVA免疫小鼠 ,检测血清中抗体效价可达 (1∶ 2×10 6 ) ,用通用引物分别扩增出轻、重链片段的大小为 32 5 bp和 34 0 bp,将两者拼接得到约 72 0 bp大小的单链抗体库 ,以8× 10 1 1 的转化效率转染 TG1细胞 ,Eco R 和 H ind 酶切后 ,12个单菌落所提噬菌粒 DNA中有 10个切出了约为 2 .1kb的目的条带 ,所构建的噬菌体抗体库库容量约为 1.2× 10 8.经 M13KO7超感染后 ,测噬斑滴度为 9× 10 1 4 pfu· L- 1 .结论　成功地构建了钠泵抑制物噬菌体单链抗体库 .     

正常人天然IgG抗体噬菌体呈现库的构建

目的 建立一个正常人天然ＩｇＧ抗体委员长 菌体呈现库。方法：从一献血员取５０ｍＬ新鲜血液,分离淋巴细胞。提取ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡＰＣＲ扩增重链Ｆｄ和轻链ｃＤＮＡ,依次将ＰＣＲ产物插入载体ｐＣｏｍｂ３Ｈ相应位点。以点印迹检测噬菌体表面Ｆａｂ的表达,结果 所有４个ＩｇＧ亚类的重链Ｆｄ片段、部分κ轻链和λ轻链ｃＤＮＡ得到扩增。先期插入的重链Ｆｄ的实际库容达１．１×１０＾６,插入率２０％。后期插入的     

噬菌体抗体库技术

１９７５年创立的Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术［１］,使第一代抗体－血清多克隆抗体发展到了第二代抗体－单克隆抗体（ＭｃＡｂ）,并在医学和生物学领域得到广泛应用。但鼠源ＭｃＡｂ对人体具有免疫原性,而杂交瘤技术制备人源ＭｃＡｂ未获进展,这就极大地限制了ＭｃＡｂ作为...     

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT...     

单链噬菌体抗体库的建立

单链噬菌体抗体库的建立孟繁平１杨康鹃２郑承勋１１延边大学医学院微生物学教研室２延边大学医学院生物学教研室关键词抗体；噬菌体；抗原中图法分类号Ｒ３９２．１在机体的免疫系统中，Ｂ细胞受抗原刺激后一方面分化成短命的浆细胞产生抗体，另一方面分化成长命的记忆细...     

噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的筛选

目的　构建噬菌体抗体库及筛选抗人肝癌特异性噬菌体抗体。　方法　以ＲＴ－ＰＣＲ法从经Ｂｅｌ７４０４细胞免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾淋巴细胞扩增免疫球蛋白的Ｆｄ 段及к链基因,克隆到表达载体ｐＣＯＭＢ３Ｈ－ＳＳ中并将抗体Ｆａｂ 段表达于单链噬菌体表面,构建噬菌体抗体库;以Ｂｅｌ７４０４细胞为抗原对噬菌体抗体库进行４轮“吸附－洗脱－扩增”的亲和筛选,挑取部分克隆检测与抗原的结合活性。　结果　建成容量为２×１０６ＣＦＵ 的噬菌体抗体库,在亲和筛选过程中,噬菌体收获率逐轮得到提高,第４轮为第一轮的２４５ 倍,含Ｆａｂ 基因的克隆比率也由２６％ 增到８３％ ,挑取的１０ 个克隆中有８ 个与Ｂｅｌ７４０４细胞有结合活性。　结论　噬菌体抗体库技术系高效筛选体系,为肿瘤单克隆抗体的制备提供了有效的途径     

噬菌体抗体库的构建及抗肝癌抗体的初步筛选

目的　通过肝癌细胞林 Bel74 0 4 分次免疫 BAL B/ C小鼠后提取脾细胞总 RNA。　方法　采用 RT- PCR的方法扩增免疫球蛋白的 κ链和 Fd段基因 ,择取噬首粒基因克隆区的酶切位点 Xba +Sac 和 Spe +Xho ,使用定向克隆的方法 ,将 κ链和 Fd段基因克隆到原核表达载体噬菌粒p COMB3H- SS中 ,通过噬菌体表面表达技术构建抗人肝癌的噬菌体抗体库。以 Bel74 0 4 活细胞为抗原对该库进行 4轮“吸附 -洗脱 -扩增”的亲和筛选 ,测定噬菌体回收比例并对抗体库进行鉴定。挑取部分含 Fab基因的克隆 ,用内切酶 Spe +Neh 除去基因 后自连环化 ,制备可溶性抗体 Fab分子 ,以 EL ISA法检测与 Bel74 0 4 细胞的结合活性。　结果　共提取脾细胞总 RNA80 0 μg,经 PCR增后 ,先后将 κ链和 Fd段基因克隆到噬菌粒 p COMR3H- SS中 ,建成容量为 2× 10 6CFU的噬菌体抗体库 ,在 4轮的亲和筛选过程。虽然洗涤次数增加 ,但噬菌体的回收比率逐轮提高 ,4轮分别为 (6 .5×10 - 7) % ,(5 .7× 10 - 6 ) % ,(7.5× 10 - 5) %和 (1.6× 10 - 4) % ) ,共增加 2 4 5倍。在洗脱下来的噬菌体中含 Fab基因的克隆比率 ,也得到明显提高 ,即由筛选前的 2 5 %增至 83%。酶切鉴定显示 ,含 Fab基因的载体可分别被限制性核酸内切酶Xba +Sac 和 Spe +Xho     

B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库的构建

目的构建B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库。方法从人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞免疫的BALB/c小鼠脾细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增免疫球蛋白轻链κ基因及重链Fd片段,然后经酶切、纯化、连接等步骤将轻链κ基因和重链Fd片段依次克隆入噬菌体载体pComb3H-SS中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue。结果构建了抗人B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库,轻链κ基因、重链Fd片段与载体的重组率分别为100%和78%,库容量为2.18×107。结论成功构建了抗人B细胞淋巴瘤Fab噬菌体抗体库,方便进一步筛选抗人B细胞淋巴瘤抗体。     

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

目的　利用噬菌体表面展示技术 ,构建人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .方法　从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总 RNA,反转录成 c DNA后 ,用PCR扩增人 Ig G1Fd段及κ轻链 ,并克隆至噬菌粒载体p COMB3中 ,转化宿主菌株 XL 1- Blue,以辅助噬菌体M13K0 7超感染噬菌粒文库 ,构建成人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .结果　得到一个含克隆数为 1.2× 10 6 ,实际滴度约为 2 .5 6× 10 1 5 pfu· L- 1的 Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库 .结论　Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建 ,为下一步利用亲和富集筛选技术 ,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础     

前列腺癌肿瘤血管生成的研究

目的：探讨肿瘤微血管与前列腺癌生长,转移的关系。方法：应用免疫组化技术结合放射免疫测定检测第Ⅷ因子相关抗原和前列腺特异性抗原（PSA）在19例前列腺癌和40例前列腺增生中的表达和平均值及其相关关系。结果：前列腺癌组织中微血管密度（MVD）和PSA值明显高于前列腺增生,转移性前列腺癌MVD和PSA值高于非转移性前列腺癌,前列腺癌MVD与PSA呈正相关,结论：血管形成与前列腺癌的发生,发展和转移密切相关,肿瘤的增长和转移有赖于肿瘤血管的生成。     

前列腺癌及前列腺非典型增生中Ras p21的免疫组化检测

用抗ras癌基因蛋白质产物p21单克隆抗体SCI-oncogema I,采用常规ABC免疫组织化学方法检测了66例前列腺癌、46例前列腺非典型增生、20例慢性前列腺炎、50例良性前列腺增生和6例正常前列腺组织石蜡标本中p21的表达,结果显示,前列腺癌的阳性表达率明显高于其他几组病变(P<0.01),其阳性表达率随肿瘤组织学分级增高而增高。前列腺癌周的不典型增生组织对p21的反应强度显著高于单纯性不典型增生组织。上述结果说明,ras癌基因产物p21的过量表达,在前列腺非典型增生向前列腺癌的发展过程中起着重要作用,并且可以作为一种新的肿瘤标记物来估计前列腺癌的生物学行为。     

前列腺增生和前列腺癌患者血清性激素含量分析

分析５０例前列腺增生（ＢＰＨ）、６例前列腺癌（ＰＣＡ）和４０名对照组（Ｃ）患者血清睾丸酮（Ｔ）、雌二醇（Ｅ２）、孕酮（Ｐ）、黄体生成素（ＬＨ）、和促卵泡素（ＦＳＨ）的测定结果。发现ＢＰＨ和ＰＣＡ组血清Ｔ稍低于Ｃ组，但血清ＦＳＨ明显高于Ｃ组（Ｐ＜０．０５）。ＢＰＨ组按不同年龄分成３组显示血清Ｐ随年龄增加而增加（Ｐ＜０．０５），Ｔ／Ｅ２比值随年龄增长而降低。结果提示性激素代谢的平衡紊乱与ＢＰＨ和ＰＣＡ的发生有一定关系。     

食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体的制备及其特性的初步鉴定

【目的】制备抗食管癌细胞核仁抗原单克隆抗体 ,用于寻找肿瘤的标志物和癌的病理诊断。【方法】以食管癌组织核基质为抗原 ,采用足垫法免疫Balb/c小鼠 ,运用杂交瘤技术建立分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株 ,制备食管癌细胞抗原片和食管癌冰冻切片 ,采用免疫组化检测并采用蛋白印迹法 (Westernblotting)分析 ,鉴定是否为特异性单克隆抗体。【结果】获得一细胞株 (1 7/E)能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株 ,1 7/E能与食管癌细胞和其他 10种癌细胞的核仁反应 ,不与正常食管上皮细胞核仁反应。Westernblotting分析表明 ,1 7/E与食管癌组织核基质 41ku处有一反应带 ,与正常食管组织核基质无反应。【结论】 1 7/E可能是对食管癌等多种肿瘤细胞核仁抗原的特异性单克隆抗体 ,为深入研究肿瘤细胞核仁抗原的生物学特性及肿瘤病理诊断提供了有效的制剂 ,并具开发的潜在价值。     

噬菌体随机肽库在确定单抗识别表位中的应用

以抗人感冒病毒凝血素蛋白单克隆抗体12CA5为筛选配基,从丝状噬菌体（M13）表面展示的随机6肽库中筛选抗体特异性识别的多肽,噬菌体与单抗的结合可以用酶联免疫吸附法鉴定,而展示的氨基酸序列可以通过测定相应克隆的插入外源核苷酸来确定,筛选所犁多肽与单抗的表达,特别是C-蝗四个氨基酸残基PDYA有高度的同源性,说明该四肽在单抗与抗原的结合中起到十分重要的作用。     

COX-2、bcl-2和PCNA在前列腺癌中的表达及其意义

目的探讨COX-2、bcl-2和PCNA与前列腺癌(PCa)生物学行为的关系。方法采用SP免疫组织化学法分别检测12例良性前列腺增生(BPH)和70例PCa标本中COX-2、bcl-2的表达。结果BPH和PCa组织中COX-2阳性率分别为8.33%和61.43%,PCa组织的COX-2、bcl-2和PCNA的表达明显高于BPH(P<0.05),且在PCa组织中COX-2、bcl-2和PCNA的表达随肿瘤分化程度降低和临床分期的增高而上调,转移组明显高于非转移组(P<0.05),bcl-2、PCNA在PCa中的表达与COX-2的表达之间存在相关性(P<0.05)。结论COX-2的异常表达与PCa的生物学行为密切相关,COX-2可能通过促进前列腺细胞增殖和抑制细胞凋亡在PCa的发生过程中发挥重要作用。     

ERK在前列腺癌及增生组织中的表达及其意义

目的:通过细胞外信号调节激酶(ERK)在前列腺癌(PC)、前列腺增生症(BPH)及正常前列腺中的表达,探讨ERK在BPH和PC形成过程中的作用。方法:采用免疫组织化学S-P法对32例BPH、12例PC、6例正常前列腺患者标本进行检测。结果:在BPH、PC的上皮细胞和基质细胞胞浆、胞核中均有着色,正常前列腺基质细胞胞浆、胞核均着色,上皮细胞无核着色。上皮细胞核染色中,3组差异有统计学意义(P≤0.05)。基质细胞核染色中,BPH与其他2组差异有统计学意义(P≤0.05),PC与正常前列腺比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ERK可能是促进BPH和PC发生的主要信号传递途径,EBK在BPH和PC中的过度表达可能是几种生长因子过度表达的结果。     

抗结直肠癌缺陷蛋白合成肽单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备针对结直肠癌缺陷（ｄｅｌｅｔｅｄ ｃｏｌｏｒｅｃｔａ ｃａｒｅｉｎｏｍａ,ＤＣＣ）蛋白抗原决定簇多肽的单克隆抗体。方法 用合成的ＤＣＣ蛋白抗原决定簇多肽（氨基酸序列从１９５～２０４）为抗原,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,经细胞融合,有限稀释法筛选出能分泌抗ＤＣＣ合成肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体进行了初步鉴定。结果 细胞融合率７５％,经３次亚克隆,最后保留一株能稳定分泌抗ＤＣＣ民肽单     

TURP治疗198例高危前列腺增生症患者围术期的护理体会

目的：讨论经尿道前列腺电切术( TURP )治疗高危前列腺增生症( BPH )围术期的护理方法。方法对行TURP术治疗的198例高危BPH患者,给予充分术前准备、手术耐受力评估、控制手术时间。术后严密观察生命体征变化,积极防御水中毒等并发症。膀胱冲洗,及时处理膀胱经痉挛,以及出院后健康指导。结果198例患者均接受TURP术,术后排尿通畅,无严重并发症发生,痊愈出院。结论对行TURP术高危患者施以精心围手术期护理,可使患者平稳安全地度过围手术期,减少术后并发症,缩短患者住院时间,加快患者康复。