Ⅱ.浓缩与纯化

粗制类淋巴细胞干扰素先用三氯乙酸沉淀进行初步浓缩纯化,可浓缩7.8～37.9倍,纯化2.2～10.9倍,延长三氯乙酸与干扰素在4℃作用时间至20小时可提高得率。此种初步浓缩纯化的材料用兰葡聚糖-Sepharose 4B 柱层析法作进一步浓缩纯化。干扰素在柱上吸附良好,流穿及平衡液洗脱的干扰素仅占2.6～7.5%,而绝大部份杂蛋白则在此阶段流出,当加入0.5～1.0M Nal 磷酸盐缓冲液时干扰素大量洗脱,而此时蛋白浓度甚低,纯化效果良好,比活性大部份达到10~7单位/mg 蛋白,少数为10~6单位/mg 蛋白,个别组份可达到10~8单位/mg 蛋白,并有一定浓缩作用,得率也较高。     

一种简易的纯化单克隆抗体方法

<正> 从小鼠腹水中纯化抗体常是单克隆抗体特征鉴定,生产应用中的一个重要步骤。目前最常用的方法为离子交换层析法,但该法既不适于多种细胞及腹水同时纯化鉴定,也不适于大规模生产,且洗脱液中抗体含量较低,常需浓缩后才能使用。近来,Reik M(1987)等报导了正辛酸纯化法。本实验室在从腹水纯化抗HCG单克隆抗体中,用正辛酸法与DEAE柱层析进行对照、分析,结果     

灭活SARS病毒的纯化鉴定及初步应用

为制备纯化的灭活SARS病毒,取广东省CDC提供的灭活SARS-CoV病毒培养液进行超滤,收集相对分子质量介于100000至500000之间的组分,并浓缩。对纯化过程中各组分进行抗原活性鉴定和蛋白质含量测定,并加佐剂后免疫动物,测定抗体免疫应答。结果表明,超滤后活性抗原蛋白质回收率7.6%,纯化倍数为9,抗原活性达到1:480。免疫家兔获得的血清ELISA效价达到1:10000以上,中和抗体效价达到1:2000以上。表明该纯化工艺能获得较高纯度的灭活SARS-CoV病毒颗粒。     

用RhD阳性红细胞从含抗D抗体的IgG中提纯抗D抗体

目的：研究从含抗-D抗体的IgG中纯化抗D抗体的方法。方法：抗D含量为0.814μg/ml的健康人血浆,经柱层析法分离获得含抗D的IgG后,用遗传表现型CCDee的RhD阳性＂O＂型红细胞经亲和层析法从IgG中纯化抗-D抗体。检测相关指标。结果：经过亲和层析法纯化后去除了近90%的非目的IgG,使产物可以进一步浓缩以提高单位体积制剂中抗-D抗体浓度。所得制剂经检测各项指标均符合中国生物制品规程的要求。结论：本方法可从含抗D的IgG制剂中进一步纯化抗D抗体,为血浆综合利用提供参考。     

流行性乙型脑炎Vero细胞纯化灭活疫苗的研究

目的研制新的流行性乙型脑炎传代细胞疫苗。方法将流行性乙型脑炎弱毒株ＳＡ１４１４２适应于Ｖｅｒｏ细胞,作纯化灭活疫苗,比较不同培养方法病毒在Ｖｅｒｏ细胞的增殖规律,对病毒的浓缩和纯化条件进行研究,并将所制备的疫苗按不同蛋白浓度免疫动物。结果发现普通转瓶培养,可长时间维持病毒的高滴度。在感染病毒后,以无牛血清的培养基替代含牛血清的培养基,不仅可维持病毒的高滴度增殖,而且可多次收获,确立了应用８％ＰＥＧ８０００浓缩病毒液,１５％～６０％的蔗糖密度梯度超速离心纯化的工艺,每剂量为０５μｇ纯化疫苗的中和抗体水平,即可达到与现有商品疫苗相一致的滴度。结论ＳＡ１４１４２株制备的Ｖｅｒｏ细胞纯化疫苗,有望成为一种新的反应轻、效价高的疫苗。     

毕赤酵母表达肽抗生素hPAB-β的纯化

目的 在成功构建肽抗生素hPAB-β重组毕赤酵母的基础上,深入探讨酵母表达hPAB-β的规模化纯化方法.方法 采用高密度发酵法在3.7L发酵罐中对pPIC9K-hPAB-β/GS115优5重组菌株进行发酵,收集发酵液,依次采用W-UF-II过滤系统超滤、反相层析、阳离子交换、分子筛层析等纯化技术对目标表达产物逐级进行纯化,目的 蛋白用15%的Tricine-SDS-PAGE电泳进行跟踪分析.最终纯化产物的生物学活性用平板琼脂扩散法进行测定.结果 在培养至工程菌菌体湿重约200~250g/L时,以甲醇诱导培养基诱导目的 蛋白表达,48h后菌体湿重达280g/L,目标产物表达量约75mg/L.发酵液经Mr10000膜超滤,达到去除大部分酵母色素和浓缩样品的目的 (体积浓缩约2/3).再经反相层析、离子交换、分子筛层析纯化,最终目的 产物的纯度达98%以上,得率达32.5%.且纯化的目的 蛋白具有良好的杀灭金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的活性.结论 酵母表达肽抗生素hPAB-β经膜超滤、反相层析、离子交换和分子筛层析四步纯化,实现了去除非目的 蛋白、酵母色素及脱盐的目的 ,为规模化制备hPAB-β创造了前提.     

单克隆抗体对体外培养恶性疟原虫的保护性抑制作用

采自非洲恶性疟患者的带虫血、用EBY转化方法培养出五株人恶性疟原虫单克隆抗体:11_n13 (IgG)、CE22-14 D10(IgM)、38.16(IgM)39.53Ⅱ(IgM)及HOO_(2-2)G_9(IgG)、经过FPLC纯化、Amicon膜浓缩、ELSA或FSPC测定含量。含量在15～100g/ml。 以~3H-次黄瞟呤渗入疟原虫DNA方法,放射活性的高低表示症原虫生长或受抑制、用不同浓度的上述单克隆抗体与症原虫共同培养,同时加入~3H-次黄嘌呤,48小时后测定放射活     

肾综合征出血热双价纯化疫苗的研制

目的: 研制肾综合征出血热双价纯化疫苗。方法:肾综合征出血热病毒I型LR1 株和II型R22株分别在Vero细胞上接种培养。I、II型病毒培养液依次经β 丙内酯灭活、超滤浓缩、蔗糖区带离心纯化及层析脱糖等处理。将检定合格的I、II型单价病毒原液等量混合后, 用AI(OH)3 佐剂吸附,制备 3批双价纯化疫苗。结果: 该 3批疫苗已经自检和中国药品生物制品检定所复检合格, 并已进行临床试验。结论: 采用Vero细胞培养制备肾综合征出血热双价纯化疫苗方法可行。     

抗人体神经特异性烯醇酶单克隆抗体的产生

人神经特异性烯醇酶(enolase NSE),被认为是神经内分泌(amine precursor uptake and decarboxylation APUD)细胞肿瘤及肺的小细胞肿瘤的标志。为了获得NSE的单克隆抗体,作者首先创立了一个简单方法,即从脑组织中纯化人NSE。纯化的第一步是粗提取的脑组织直接染色聚焦。洗脱烯醇酶的各部分在pH4.5左右进行SDS凝胶电泳,通过凝胶板银染色可以表明大部分NSE片段已被纯化,因此,只有纯化的片段能被选择性地收集并浓缩。这种方法比较简便易行。由于色谱分离的烯醇酶峰的所有片段都被非选择的收集,接着     

全血标本DNA的扩增

全血和血浆是最常用于诊断疾病的标本。但由于在血液标本中存在着抑制PCR的因子,因此,在进行PCR之前,一般都要仔细纯化血液标本中的核酸。经典的从临床血液标本中纯化核酸的方法所涉及的一些试剂和步骤,如有机溶剂、变性剂、去污剂以及浓缩、沉淀,也对随后的PCR分析产生影响。因此,建立一种简便易行的血液标本的制备方法,是很有意义的。     

测定抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的改良ELISA法及其初步应用

<正> 酶联免疫吸附试验(ELISA)已在单纯疱疹病毒(HSV)的研究及临床 HSV 感染的抗原抗体检测中广泛应用。该法多应用浓缩纯化的病毒抗原作为包被抗原。国外曾报道用培养于微板内的 HSV 感染细胞作为抗     

用一种新而快速固相放射免疫法检测小鼠的Ig类和亚类的单克隆抗体

用常规平板法分析杂交瘤上清液既浪费时间,又需要大量的材料,而且在使用原始上清液前还需要浓缩.K?ohler(1980年)的夹心法要求待测定的杂交瘤上清液必须浓缩,相关的抗原一定是有效力的,并且能粘着于聚合物的表面,其他方法也很浪费时间.本文所介绍的固相放射免疫试验,在不浓缩、不纯化的杂交瘤上清液中能检测出免疫球蛋白的类和亚类,而且不用抗原.本法是一种免疫夹心法,其要点是:(1)用免疫蛋白类或亚类特异性抗血清IgG包被微量板孔聚合物表面,(2)加不纯化、不浓缩的杂交瘤上清液,(3)再加~(125)Ⅰ标记的兔抗小鼠IgG的抗体,(4)最后计数cpm.     

不同层析介质纯化H5N1型流感病毒的研究

目的分别用新型复合层析介质Capto Core700和传统分子筛介质Sepharose 4FF纯化MDCK细胞制备的H5N1型流感病毒浓缩液, 并比较分离纯化效果。方法用Capto Core700与Sepharose 4FF纯化灭活H5N1型流感病毒浓缩液, 透射电镜分析不同样品中病毒颗粒的形态;分别用单向免疫扩散法(single radial immunodiffusion, SRID)、福林酚法(Lowry法)、双抗体夹心ELISA、qPCR检测不同层析介质纯化前后病毒血凝素含量、总蛋白质含量、宿主细胞蛋白质(host cell protein, HCP)含量和宿主细胞DNA(host cell DNA, HCD)含量, 计算病毒抗原回收率和杂质去除率;用动物实验检测不同纯化病毒的免疫原性, 并用t检验分析两种层析介质纯化效果差异。结果 Capto Core700与Sepharose 4FF纯化的H5N1型流感病毒在透射电镜下均呈典型的流感病毒形态;两种层析介质纯化后病毒血凝素回收率差异无统计学意义(P>0.05), 但前者的杂质(总蛋白质、HCP、HCD)去除率均高于后者,...     

凝胶电泳蛋白质组学蛋白样品纯化方法比较

目的 探讨超滤法和7种不同沉淀方法纯化含PBS的蛋白样品对蛋白凝胶电泳的影响。方法 应用超滤法和7种沉淀方法［包括硫酸铵、氯仿甲醇、酸化丙酮甲醇、乙醇、丙酮、三氯乙酸（TCA）、TCA/丙酮］纯化PBS稀释的混合食管癌组织蛋白（10例）,二喹啉甲酸（BCA）、Bradford及2D法测定蛋白浓度并进行一维和二维聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳,Image Master软件分析二维电泳图谱蛋白点。 结果 Bradford法和2D法适用于二维电泳水化液溶解的蛋白样品浓度测定。超滤法和硫酸铵沉淀法的蛋白回收率分别为40%和4%,其他方法的蛋白回收率约为22%。丙酮沉淀法纯化蛋白的二维电泳图谱蛋白点边界清晰、分辨率高且数目最多;其次是乙醇沉淀和氯仿甲醇沉淀法;再其次是超滤法,该法纯化蛋白的二维电泳图谱蛋白点表现不同程度的弥散;酸化丙酮甲醇沉淀蛋白的二维电泳图谱中蛋白点丢失最多。 结论 丙酮沉淀法适用于原始浓度高、体积小的蛋白样品除盐及浓缩,超滤法是原始体积较大、浓度较低蛋白样品浓缩纯化的首选方法。     

用小剂量α干扰素治疗慢性活动性乙型肝炎的效果观察

<正> 慢性活动性乙型肝炎自发缓解的情况较少。近来我们参照Matsumura的方法应用小剂量α干扰素(下称IFN)观察7例(治疗组4例,对照组3例),现将结果报告于下。部份纯化全血细胞干扰素,系用献血者的全血细胞以新城鸡瘟病毒诱生IFN,粗制IF经用硫氰酸钾沉淀低温乙醇提取法进行浓缩纯化,比活性5.8×10~6。     

人γ干扰素的纯化与分析 Ⅰ.玻璃珠吸附层析法纯化人γ干扰素

<正> 为了探讨人γ干扰素(HuIFN-γ)的生物学作用机理以及提高临床疗效,纯化工作已成为当前 HuIFN-γ研究的一个急待解决的问题。由于 HuIFN-γ不能用盐析法进行浓缩,近年来,国外采用 CPG(Controlled-pore     

冻融浓缩法及其在单克隆抗体培养上清鉴定中的应用

本文采用冻融浓缩法对抗HRP McAb培养上清进行了浓缩,并以多种方法考核了其浓缩结果。发现经冻融处理后的样品,其溶质集中在浓缩管的下端,越近管底溶质浓度越高。在溶液接近管底1/3厚度的液层中,培养上清的颜色、蛋白含量及抗HRP的活性分别为未浓缩样品的2.01～6.40倍,1.65～9.91倍和2～32倍。与羊抗赢IgG做双向免疫扩散,最高效价可达1∶32。由于本法操作简便,故在单克隆抗体鉴定及其它生物活性物质的定性研究中具有一定实用价值。     

放射免疫测定弓形体病

本文介绍用放射性抗原微量沉淀试验(RA-MP)及放射对流免疫电泳自显影法(RCEP)对人畜共患的弓形体病的诊断研究。 纯化抗原从急性感染小白鼠的腹水液制得。多次洗涤沉淀后、脱脂、反复冻融、超声波处理、低温高速离心,取上清液浓缩后分别用G-200及G-100葡聚糖凝胶分离纯化,取出有活性的第一蛋白峰,合并后测,作为纯化抗原。用氯氨T法以~(125)I标记纯化抗原。用10微克/0.2毫升抗原与~(125)I碘化钠2毫居里按常规加氯氨T反应,偏重亚硫酸钠终止反应,控制反应物总体积不超过400微升。 在放射性微量沉淀试验中,游漓的标记抗原与     

不同剂量紫外线照射后对浓缩血小板保存中细胞因子含量 …

目的：研究不同剂量Ｂ波段紫外线（ＵＶＢ）照射后对浓缩血小板保存过程中细胞因子含量的影响。材料与方法：采用富含血小板血浆（ＰＲＰ）法制备浓缩缩血小板,并分别以１．５Ｊ／ｃｍ＾２、２Ｊ／ｃｍ＾２、２．５Ｊ／ｃｍ＾２ＵＶＢ进行照射后,于标准条件下保存５天,间隔取样用ＥＬＩＳＡ方法检测ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８及ＴＮＦα含量结果浓缩血小板在保存过程中,所检测的四种细胞因子含量随保存时间的延长均逐渐升高     

HIV-1 Gag蛋白酵母表达产物的纯化及免疫原性检测

目的 纯化HIV-1Gag蛋白，并检测其免疫原性。方法 将表达HIV-1Gag蛋白的酵母工程菌GS115／pPICGAG接种到YPD培养基中多次传代后，用PCR检测其目的基因。该酵母工程菌在BMMY培养基中经甲醇诱导表达，上清液初步浓缩后上柱进行凝胶过滤层析，并将纯化蛋白免疫Balb／c小鼠，检测其血清抗体水平。结果 该酵母工程菌经多次传代后外源基因不丢失。Western blot检测结果表明纯化蛋白具有很好的反应原性，其纯度可达85％。纯化蛋白免疫小鼠后可诱导特异性抗体产生。结论 表达HIV-1Gag蛋白的酵母工程菌具有很好的遗传稳定性，其表达产物可诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。