滤光片对细胞核DNA含量检测的影响

目的探讨滤光片对图像分析仪测量DNA含量的影响。方法选取10只成年健康雄性小鼠,制备肝细胞涂片,Feulgen染色和天青B染色,显微镜与摄像机之间分别插入400 nm、560 nm、590 nm、600 nm、626 nm、670 nm带通滤光片和中灰滤光片,利用TIGER细胞图像分析仪测量肝细胞核的积分光密度（IOD）与平均光密度（AOD）和面积。结果肝细胞核在Feulgen染色法中呈紫红色,天青B染色法呈蓝色。Feulgen染色和天青B染色分别采用560 nm和600 nm的带通滤光片时,能够测得最大的IOD值,不同倍体肝细胞核间的比值接近2、4,CV值最低。与天青B染色方法相比,Feulgen染色法中不同倍体间的比值更接近2、4,CV值更低。结论适宜的滤光片可提高细胞核DNA含量测量结果的精确性和准确性。Feulgen染色测量结果精确性和准确性明显高于天青B染色,应作为首选的染色方法。     

光衍射现象对细胞核DNA含量检测的影响

利用图像分析仪测量小鼠肝细胞涂片内单个肝细胞核的DNA含量,探讨图像分析仪在测量显微图像的光度时光衍射现象所导致的测量误差.本文选取10只成年健康雄性小鼠的肝组织涂片,Feulgen染色,TIGER细胞图像分析仪测量单个肝细胞核的DNA含量并分析其DNA含量倍体;结果显示,(1)涂片内肝细胞核分布均匀,轮廓清晰,呈紫红色;(2)不同小鼠同一DNA含量倍体的肝细胞核的DNA含量大致相同;(3)二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均大于/[Dept.1]等于2或4,二、四、八倍体肝细胞单个核DNA含量的CV值均小于10%;(4)同一小鼠不同DNA含量倍体肝细胞核的平均光密度值差异较小.结论光衍射现象可导致DNA含量的测量结果偏低,其偏低的程度随待测细胞核的面积增加而减小.     

应用肝细胞涂片评估DNA染色方法的可靠性

目的探讨应用肝细胞涂片评估DNA染色方法的可靠性。方法选取10只成年健康雄性小鼠，制备肝细胞涂片，Feulgen染色和天青蓝染色，TIGER细胞图像分析仪测量肝细胞核的DNA含量与倍体。结果涂片内肝细胞核分布均匀，轮廓清晰；Feulgen染色法中肝细胞核呈紫红色，天青蓝染色法呈蓝色；作为参比的Feulgen染色涂片中不同倍体间IOD的比值比天青蓝染色标本更接近倍体数的比值，其CV值也低于天青蓝染色法。结论小鼠肝细胞涂片可应用于评估显示DNA染色方法的可靠性。     

组织切片对细胞核DNA含量检测的影响

目的探讨组织切片对图像分析仪测量细胞核DNA含量的影响。方法选取10只成年健康雄性小鼠,制备肝细胞涂片和肝组织切片,肝组织切片分成两部分,分别用于Feulgen染色和石蜡包埋,包埋后的组织采用垂直切片,图像分析仪测量切片实际厚度,依据切片机标识厚度和测量厚度分别分组,TIGER细胞图像分析仪分别测量肝细胞涂片和组织切片内肝细胞核的积分光密度(IOD)。结果肝细胞涂片内各DNA含量倍体肝细胞核IOD间的比值接近2和4,IOD之变异系数(CV值)<3.5,肝组织切片IOD间比值明显偏离2和4,IOD之CV值均>6;切片机标识厚度为4、6、8和10μm组织切片平均测量厚度分别为6.75、7.18、6.96和7.59μm,测量厚度最大值为9.25μm,最小值为4.62μm;依据切片机标识厚度分组中不同切片厚度相同DNA含量倍体肝细胞核的IOD值差异均无统计学意义;依据测量厚度重新分组后5、6微米组与7、8、9微米组IOD值间的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论组织切片的实际厚度与切片机标识厚度间存在明显差异,本实验方法可较准确地判断组织切片厚度;厚组织切片测量结果优于薄组织切片,但与细胞涂片相比,厚组织切片仍难...     

三种Feulgen染色方法的比较

目的探索一种快速的Feulgen染色方法,并尝试其在细胞核DNA含量分析中的应用。方法选取十只健康小白鼠的肝细胞涂片,每只小白鼠的肝细胞涂片分成三组,采用快速Feulgen染色法、改良Feulgen染色法、传统Feulgen染色法对这三组分别染色,用TIGER细胞图像分析仪测量肝细胞涂片内单个完整肝细胞核的DNA含量,比较各组染色效果和肝细胞核DNA含量的测量结果。结果应用快速Feulgen染色法,获得了满意的效果,细胞核染色深,结构清晰,背景着色淡,而所需染色时间仅为15分钟;同一种方法染色的不同小鼠肝细胞涂片,相同DNA含量倍体肝细胞核的DNA含量均值的变异系数(CV)<10%,CV(快速)IOD(改良)>IOD(传统);各组2、4、8倍体肝细胞核DNA含量间的比值均接近2或4;结论此种快速Feulgen染色方法优于其他两种方法,可应用于图像分析系统对细胞核DNA含量与倍体的测量和分析。     

肝细胞癌DNA干系倍体分析及其临床意义

目的:测量与分析肝细胞癌DNA干系倍体及其临床意义。方法:使用TIGER细胞图像分析仪测量 4 5例肝细胞癌组织 4 μm、10 μm切片上DNA干系倍体值。4 μm组织切片测量肝细胞癌细胞核DNA的光密度,10 μm组织切片测量单个完整肝细胞癌细胞核的体积,经TIGER细胞图像分析仪计算获得以单个完整肝细胞癌细胞核体积为单位的DNA总量(以体积积分光密度表述),以同一切片内正常淋巴细胞作为内对照,计算其DNA干系倍体值。结果:⑴无 1例DNA干系倍体为二倍体;DNA干系倍体值在 2～ 5范围者 11例;在 5～ 8范围者 2 8例;大于 8者 6例。⑵DNA干系倍体与瘤体大小、有无淋巴结转移、组织学分级、术后生存率等有相关性。结论:DNA干系倍体能较准确反映肝细胞癌的生物学特性,为认识肝细胞癌的病理学特征以及判断预后提供了有价值的客观依据。     

非妇科领域应用液基细胞学与传统涂片细胞核定量参数的比较研究

目的通过液基制片(liquid-based preparations,LBP)方法在非妇科脱落细胞领域制片对细胞核定量参数的影响研究,探讨其应用的优缺点及其应用前景。方法对本院25例胸腹水,应用液基制片,并同步与传统涂片进行了细胞核形态学观察,并应用彩色医学图文分析系统HMIAS-2000对细胞核定量参数加以对比分析。结果液基制片的细胞核明显比传统涂片的细胞核变小,核颜色加深,核形态未见到明显变化;液基制片的细胞核面积比传统制片的细胞核面积减少51.5%(P<0.01),细胞胞浆面积减少59.98%(P<0.01),细胞核浆比增大44.44%(P<0.01),细胞核浆中心距减少51.09%(P<0.01),细胞核周长缩短32.46%(P<0.01),细胞核等效直径比传统制片的细胞核等效直径缩短30.33%(P<0.01),核长径缩短28.13%(P<0.01),核短径也缩短26.47%(P<0.01),核长径与短径之比未见明显改变(P>0.05),核圆形度也未见明显差异(P>0.05),细胞核形状因子未见明显改变(P>0.05),核平均光密度增加了57.14%(P<0.05),核积分光密度未见明显改变(P>0.05),核平均灰度和核异型指数均未见明显变化(P>0.05)。结论液基细胞学制片可明显缩小目标细胞核的大小,且胞浆的减少更加明显,细胞核浆比可发生明显改变,可对明确诊断造成一定的困难。     

肝肿瘤细胞DNA倍体分析中选择参照细胞核的依据

目的　利用细胞图像分析仪测量小鼠肝细胞涂片的 DNA含量 ,探讨细胞图像光度术 (ICM)和流式细胞光度术 (FCM)分析肝肿瘤细胞核 DNA倍体时 ,选取参照细胞核的原则。方法　本文选取 10只成年健康雄性小白鼠的肝组织涂片 ,Feulgen染色 ,TIGER细胞图像分析仪测量单个完整肝细胞核的 DNA含量与倍体。结果　 (1)不同小鼠同一倍体的肝细胞核 DNA含量大致相同 ;(2 )二、四、八和十六倍体肝细胞单个核 DNA含量间的比值接近 2、4、8,它们的 CV<8.0 %;(3)当仅出现二倍体和四倍体时 ,以二倍体的细胞核为主 (80 .4%) ,伴随八倍体和十六倍体的出现 ,四倍体肝细胞核所占百分率大于二倍体。结论　由于肝细胞具有多核和多 DNA倍体的特点 ,分析和计算肝脏肿瘤细胞核 DNA倍体和其它指标时 ,不能简单地遵循以同种属、同个体、同源的正常二倍体肝细胞核作为参照细胞核 ,正常四倍体和八倍体甚至十六倍体肝细胞核作为参照细胞核也应该加以考虑。     

不同实验室小鼠肝细胞核DNA总量图像分析结果的比较研究

目的了解图像分析仪测量组织细胞化学物质含量或总量结果的国内现状,为制定用于细胞化学物质量测定的图像分析系统的生产及使用过程中应达到的统一的技术性能标准提供参考。方法正常成年小鼠肝细胞悬液涂片,部分涂片统一进行Feulgen染色,未染色涂片与已染色涂片各一张寄给六个实验室,进行Feulgen染色,测量两种染色涂片的单个完整肝细胞核DNA的量,结果送回本实验室,按统一标准比较单个完整肝细胞核DNA总量的直方图。结果 1.从统一和不同实验室染色涂片测得的DNA总量直方图形状较相似,说明细胞核DNA的Feulgen染色法具有较广泛的适应性;2.各实验室表述DNA量的术语极不规范;3.不同的图像分析仪测得不同投影面积大小肝细胞核的平均光密度或平均光度或平均灰度的值相差较大,而同一图像分析仪测得的值的差异较小;4.不同的图像分析仪和不同的测量参数区分三种DNA总量细胞核群体的能力存在明显的差异,说明这些图像分析仪测量细胞化学物质量的可靠性不同;5.改变图像分析仪关键硬件的设置,摄取相同细胞核的黑白图像和彩色图像,测量结果显示,细胞核DNA的彩色图像与黑白图像在不同的图像分析仪测量软件上可得到不同的测量结果。结论测量细胞化学物质的量,不但应重视图像分析系统测量软件的性能,而且其图像形成和采集硬件的系统性能与功能状态同样不可忽视,建立用于细胞化学物质量测定的图像分析系统性能的评价标准是非常必要的、有益的和刻不容缓的。     

人肝细胞癌DNA干系倍体异质性的组织原位分析

目的探讨人肝细胞癌DNA干系倍体异质性的临床意义。方法选取45例肝细胞癌患者的归档蜡块,分别制备4μm、10μm的连续组织学切片,利用细胞图像分析仪测量细胞核DNA干系倍体值及其形态学参数。在4μm切片上测量细胞核DNA的平均光密度,在10μm切片上测量单个完整细胞核的体积。经细胞图像分析仪计算获得以单个完整细胞核体积为单位的DNA总量,以同一切片内正常淋巴细胞作为内参照,计算其DNA干系倍体值和异质性率。统计学分析DNA干系倍体异质性率与组织学分级、瘤体大小、淋巴结转移以及AFP表达水平的关系。结果肝细胞癌DNA干系倍体异质性率与组织学分级、瘤体大小、AFP表达水平有关联,与淋巴结转移无关联。结论组织原位法分析肝癌DNA干系倍体异质性对肝细胞癌的诊断、恶性度判定及预测预后均具有重要的参考价值。     

两种染色方法在细胞核DNA含量检测中的应用及比较

目的 探讨改良、快速两种Feulgen染色方法达到最佳染色效果的水解时间段，为科研和临床的应用提供方法学指导。方法 选取5只成年健康雄性SD大鼠的肝组织，制成肝细胞涂片，分别在室温和60℃温度下水解不同时间，应用改良和快速两种方法染色，TIGER图像分析仪检测和分析单个肝细胞核的DNA含量。结果 （1）不同大鼠肝细胞涂片在同一水解温度、时间作用下，相同DNA倍体含量肝细胞的DNA含量大致相同，CV值均小于10％；（2）二、四、八倍体肝细胞核的DNA含量比值均接近2或4；（3）同一大鼠相同水解温度不同水解时间，同一倍体的肝细胞核DNA含量存在差异：60℃水解温度下，IOD（5-7min）〉IOD（9-15min）〉IOD（1min,20min），室温水解温度下，IOD（50min）〉IOD（20-30min,70-90min）〉IOD（5-1min,100min）。结论 HCL水解肝细胞涂片时间过长或过短均不能理想的染色，快速法和改良法Feulgen染色达较佳染色效果的时间段分别为：快速法5—7min，改良法20-90min。     

显微图像分析系统测量细胞核DNA含量误差的研究

检测显微图像分析系统测量细胞核ＤＮＡ含量的误差对于判断肿瘤细胞ＤＮＡ倍体分析的准确性具有重要意义。本文检测了ＴＩＧＥＲ显微图像分析仪的系统噪声、聚焦变化、光源亮度与光谱差异、背景光强度分布不均匀的测量误差。结果显示，（１）尽管实现了Ｉｏ和Ｉ在同一空间位置的测量，但是，它们仍给测量结果引入了测量误差，以背景光强度分布不均导致ＩＯＤ的测量误差最大；（２）应根据目标细胞的大小和密度，选择适当的物镜倍率，样品制备应使ＡＯＤ达到一定的密度值以上，才能最大限度地降低测量误差；（３）鸡红细胞核是综合检测和评价显微图像分析系统测量细胞光密度性能的良好生物学标准。     

Nickel-bound chromatin, nucleic acids, and nuclear proteins from kidney and liver of rats treated with nickel carbonate in vivo

The in vivo binding of nickel to chromatin, nucleic acids, and nuclear proteins from rat kidney and liver was investigated. Evidence is presented for the direct interaction of nickel with chromatin from rat tissues following i.p. injection of nickel carbonate. A gentle DNA isolation procedure was developed and used to isolate nickel-bound whole chromatin, DNA + histone octamer complex (polynucleosomes), and deproteinized DNA from kidney and liver nuclei. A similar procedure was developed for isolating nickel-bound RNA from the cytoplasm. The level of nickel bound to whole chromatin from kidney was higher than that from liver, and these levels could be related to the nuclear concentration of nickel. Much higher levels of nickel were bound to the DNA + histone octamer complex and purified, deproteinized DNA from kidney as compared to liver. Substantial levels of nickel were bound to nonhistone proteins and/or chromatin-associated RNA from kidney and liver nuclei. Nickel was also associated with histone octamer proteins from kidney; however, little or no nickel was associated with histone octamer proteins from liver. 63Ni binding to nuclear proteins in rats given injections of 63Ni(II) was investigated by using two different gel electrophoretic systems. Electrophoretic conditions in both systems were found to remove protein-bound 63Ni. These results are discussed relative to the molecular mechanism of nickel carcinogenesis.     

Inhibition of rat liver RNA polymerases by action of the methylating agents dimethylnitrosamine in vivo and methyl methanesulfonate in vitro.

Dimethylnitrosamine maximally inhibits rat liver nuclear RNA synthesis by 50% at a dose of 40 mg/kg of body weight. The inhibition develops during the first 4 hr and persists through the 12th hr. All parenchymal cells of the lever lobule seem to be affected. The decreased RNA synthesis can be accounted for entirely by an inhibition of the RNA polymerase activities quantitatively solubilized and partially purified. A similar inhibition of the polymerase activities was demonstrated in the intact nuclei by inactivating the endogenous template with actinomycin D and assaying the polymerases with an added exogenous template, poly(deoxy-adenylate-deoxythymidylate). Chromatin was prepared by two methods differing in the extent to which they remove the endogenous polymerase activity. Each preparation was transcribed with either added Escherichia coli or partially purified rat liver nucleoplasmic RNA polymerase. With either polymerase or chromatin preparation, no inhibition of the template activity of liver nuclear chromatin isolated from the DMN-treated animals was detected. A similar mechanism of inhibition of RNA synthesis was produced by the action of the methylating agent methyl methanesulfonate on whole nuclei in vitro. The dose-dependent inhibition of RNA synthesis could be accounted for by an inhibition of the RNA polymerase activities quantitatively solubilized and partially purified from the affected nuclei. Chromatin prepared from the methyl methanesulfonate-treated nuclei had a normal template capacity with either E. coli or rat liver nucleoplasmic RNA polymerase. No preferential methylation of the RNA polymerases by [14C]methyl methanesulfonate could be demonstrated. It is concluded that the action of the two methylating agents on RNA metabolism is similar and that the inhibition of liver nuclear RNA synthesis results from inactivation of the RNA polymerases. At the same time, dimethylnitrosamine and methyl methanesulfonate leave the chromatin template intact, at least quantitatively, for the synthesis of RNA. The implications of such an effect on RNA synthesis are discussed.     

Effect of bleomycin on [3H]Thymidine 5'-Triphosphate incorporation into host liver and hepatoma nuclei.

The effect of bleomycin on [3H]thymidine 5'-triphosphate ([3H]TTP) incorporation into isolated sucrose nuclei from host liver and Morris hepatomas has been compared. Bleomycin stimulates [3H]TTP incorporation 13-fold in host liver and hepatoma 16 nuclei, 8-fold in hepatoma 7800 nuclei, and 3-fold in hepatoma 7777 nuclei. Differences in the nuclear membranes are not responsible for the different response of the nuclei. Nuclei, denuded of their membranes by Triton X-100 treatment, give similar results to sucrose nuclei. Analysis of DNA extracted from liver or hepatoma nuclei incubated with bleomycin indicates that bleomycin produces scissions in the nuclear DNA and that some repair synthesis takes place. Incubation of nuclei with 111indium-labeled bleomycin shows an equal binding capacity of liver and hepatoma nuclei for bleomycin. Bleomycin also stimulates incorporation of [3H]TTP in a system using chromatin or calf thymus DNA as primer. Host liver or hepatoma chromatin incubated with a DNA polymerase extracted from normal rat liver nuclei is stimulated approximately to the same extent by bleomycin. When DNA polymerase extracts from host liver and hepatoma nuclei are assayed with calf thymus DNA as primer, bleomycin has a greater stimulatory effect on [3H]TTP incorporation with host liver DNA polymerase than with hepatoma DNA polymerase in the system. We suggest that a defect in the repair system in hepatoma nuclei is responsible for the relatively lower response to bleomycin.     

DNA倍体分析技术在宫颈癌早期筛查中的临床应用价值

  目的  与传统细胞学诊断方法相比较, 探讨细胞DNA倍体分析技术在宫颈癌早期筛查中的临床应用价值。  方法  以2010年4月至2011年5月就诊于天津市人民医院妇科的4 109例患者为研究对象, 其中2 189例采用联合应用液基超薄细胞制片技术及DNA倍体分析技术捡测, 1920例行传统宫颈细胞学检测。阳性者行宫颈活检检测, 并对两组结果进行比较分析。  结果  传统宫颈细胞学组共检出阳性病例50例(2.61%), 均行阴道镜活检, 检出阳性病例6例(12.0%); DNA倍体分析联合液基细胞学组共检出阳性病例201例(9.18%), 其中183例行阴道镜活检, 检出阳性病例125例(68.3%), 两组比较有显著性差异(P < 0.05)。对同时两种检出方法的135例病例进行比较, 传统细胞学技术筛查出阳性病例50倒, 阴性病例85例; DNA倍体分析联合液基细胞学筛检出阳性病例74例, 阴性病例61例。两种筛查方法检出率比较有显著性差异(P < 0.05)。以宫颈活检组织学诊断CINⅡ及以上级别病变作为评价标准, 液基细胞学检测灵敏度为32.3%, 特异度为97.3%;DNA倍体分析技术灵敏度、特异度分别为62.4%和82.6%, 两者灵敏度与特异度比较均有显著性差异(P < 0.05)。  结论  联合应用液基超薄细胞制片及DNA倍体分析技术对宫颈癌及癌前病变的检出率显著高于传统宫颈细胞学检测。