突变特异性PCR与乙型肝炎病毒变异研究

乙型肝炎病毒(HBV)基因突变与临床关系的研究是当前国内外关注的热点,发现新的变异株并调查已知变异株的流行病学特点对于乙型肝炎的防治具有重要的临床意义。本文简要介绍了HBV变异研究的方法学,并着重讨论了突变特异性PCR(mutation specific PCR,msPCR)方法的原理、特点以及如何提高其特异性、敏感性保证结果可靠性的措施。     

乙型肝炎病毒变异株生物学特性及其临床意义

遗传变异是生物进化的基础 ,变异是生物基因突变与环境选择的结果。病毒作为必须在活细胞内复制的微生物 ,病毒的变异是病毒与宿主相互作用的结果。病毒变异株可改变致病性、逃逸自然感染或疫苗诱生的免疫 ,导致持续感染、改变病毒感染的种属或组织嗜性以及产生耐药性等。研究病毒变异株的生物学特性对于深入了解发病机制 ,发展和完善预防、诊断、治疗病毒感染的策略和方法有重要意义。一、乙型肝炎病毒基因组及其变异特点乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)属嗜肝ＤＮＡ病毒科 ,其基因组结构致密 ,长约 3 .2ｋｂ ,为部分单链的双股环状ＤＮＡ ,其负链Ｄ…     

乙型肝炎病毒S基因变异株感染临床特征

乙型肝炎病毒(ＨＢＶ)母婴传播在我国是感染ＨＢＶ的主要途径。围产期或幼龄期感染后90%以上将发展成ＨＢＶ慢性携带者。接种乙型肝炎(乙肝)疫苗可有效阻断ＨＢＶ母婴传播,但对于ＨＢＶ慢性携带者母亲的婴儿尽管接受主动免疫或被动-主动联合免疫,仍有5%～15%免疫失败。1990年Ｃａｒｍａｎ等[1]首先报道疫苗诱导的ＨＢＶ变异株,ＨＢＶＳ区“ａ”决定簇145位甘氨酸被精氨酸取代而使变异株不能被抗ＨＢｓ中和[1]。以后发现其他与乙肝疫苗免疫失败有关的“ａ”决定簇变异,位于144、129、126等氨基酸残基[24]。我们分析了106例免疫失败儿童中Ｓ区…     

乙型肝炎病毒C基因启动子双突变的检测意义

目的：分析乙型肝炎病毒（HIBV）C基因启动子（BCP）双突变与乙型肝炎临床表现及HBeAg表型的关系。方法：针对BCP双突变的特点，设计一条通用捕捉探针，一条野生型和一条双突变显色探针，待测标本DNA经聚合酶链反应（PCR）扩增后分别与野生型和双突变显色探针杂交，然后用酶联免疫吸附试验（ELISA）显示杂交结果，判定BCP突变与否。结果：147例经证实为HBV DNA阳性的急慢性肝炎患者中共有51例双突变，其中42例为单纯双突变，9例为混合突变（双突变和野生型皆为阳性），117例慢性中，重型肝炎中共有36例BCP双突变，8例混合突变，78例HBeAg阳性患者中，有25例BCP双突变，其中7例为混合突变，65例HBeAg阴性患者中，有26例BCP双突变，结论：慢性肝炎BCP双突变高于高性肝炎；BCP双突变对HBeAg的表达有一定影响。PCR微板核酸杂交ELISA技术是一种简便，特异的基因突变检测的新方法。     

对阿德福韦原发耐药的乙型肝炎病毒变异株

[英]/Schildgen O…//N Engl J Med,2006,354(17):1807～1812.Schildgen等最近报道3例对阿德福韦原发性耐药的HBV感染病例。例1为52岁男性,有乙型肝炎病史5年以上,曾经用过聚乙二醇干扰素治疗失败后换用拉米夫定治疗,用药初HBV DNA水平降至<200copies/mL,3个月后出现rt M204I耐药株,HBV DNA水平再度升高至2.5×107copies/mL。停用拉米夫定,变异株回复为野生型。后改用替诺福韦(Tenofovir)每日300mg治疗9个月,用药前3个月内HBVDNA水平降至740copies/ml,在此后6个月内继续维持类似低水平。阿德福韦批准上市后便换用阿德福韦治疗…     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎中变异病毒株的动态变化

目的:建立定量检测及监测乙肝病毒DNA的rtM204I/V(YMDD)及rtL180M变异的方法.方法:以克隆、测序鉴定及构建乙肝病毒DNA YMDD及变异(YIDD和YVDD)质粒作为标准,4例接受拉米夫定治疗(100 mg/d,疗程48 wk以上)的慢性乙型肝炎患者血清标本为对象,用焦磷酸测序的方法检测变异位点核苷酸的频率,并计算变异株的含量比例,通过检测不同变异株类型的标准质粒,确定测序峰图的背景信号.结果:通过检测标准质粒后,确定背景信号为5%,变异位点调整后的核苷酸频率转化为变异病毒株的比例后,4例患者治疗前均检测出变异的病毒株(4.5%-33%),并且随治疗时间延长呈增多的趋势.病毒载量及ALT分析提示基因型耐药发生后,将发生病毒学反跳及临床耐药.结论:焦磷酸测序可以定量检测及动态监测变异病毒株的含量.拉米夫定耐药突变株在拉米夫定治疗前已存在,并随治疗时间的增加而增长,出现病毒学反弹及临床耐药.     

稳定表达乙型肝炎病毒X基因肝细胞株的构建

目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒x基因（HBVx）的正常人肝细胞株。方法用PCR法扩增含EcoRI和HindⅢ酶切位点的x基因序列,构建HBVx基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBVx,转化大肠杆菌DHSct,筛选阳性克隆并对其进行双酶切和测序鉴定;用脂质体转染法将HBVx基因导入Chang细胞系,G418筛选,RT-PCR和Westernblot鉴定。结果x基因亚克隆入pcDNA3．1（＋）,含有完整的x基因片段,转染后Chang细胞有HBVxmRNA表达,Chang／HBVx有HBVx蛋白的表达。结论构建了稳定表达HBVx基因的肝细胞株Chang／HBVx。     

慢性乙型肝炎患者HBV DNA前C区突变株的分析

ＨＢＶＤＮＡ基因经聚合酶链反应 (ＰＣＲ )、分子克隆及序列分析等检测手段可发现其突变 ,以前核心区尤为显著。我院与复旦大学医学院附属中山医院 ,复旦大学遗传学研究所于 1999年 3月对 1996年 6月～ 1997年 10月收集的 5 9例慢性乙型肝炎的标本作前Ｃ区基因分析研究 ,现报告如下。材料与方法一、病例选择1996年 6月～ 1997年 10月我院住院及门诊随访的慢性乙型肝炎患者 5 9例 ,男 46例 ,女 13例 ,年龄 7～ 70岁 (2 5～ 5 0岁占 86 % ) ,其中肝炎后肝硬化 18例。诊断按 1995年 5月北京第五次全国传染病与寄生虫病学术会议修订的标准。二…     

乙型肝炎病毒C基因变异株的体外构建及其生物学意义

目的了解我国乙型肝炎病毒(HBV)C区变异的生物学意义.方法采用酶切位点消除法定点突变构建HBV C基因变异株(V60、G87、L97)真核细胞表达载体;转染HepG2细胞用ELISA法检测各毒株宿主细胞上清液中HBeAg.结果与野生毒株相比,构建的变异株前C/C区碱基除目的突变点外,其他碱基均同源.在重组质粒转染的宿主细胞中检测到目的DNA片段.L97变异株宿主细胞上清液HBeAg的A值在不同时间点均高于野生株和其他变异株(P＜0.001);G87宿主细胞上清液中HBeAg的A值均为阴性,但浓缩10倍后阳性;V60宿主细胞上清液中HBeAg的A值与野生株差异无显著性.结论HBV前C/C区V60、G87和L97变异株可有不同的HBeAg分泌.     

乙型肝炎病毒发生rtA181T突变的临床特点与意义分析

目的 乙型肝炎病毒逆转录酶(RT)区rtA181T突变与耐药相关,并可导致sW172终止突变,本研究旨在通过大样本测序与分析,明确rtA181T突变的发生特点与临床意义. 方法 研究对象为3 013例在解放军三○二医院就诊的慢性乙型肝炎患者,采集血清提取DNA,用PCR直接测序法检测耐药相关突变和病毒基因分型.构建rtA181T/sW172*突变与野生株重组质粒分别转染HepG2细胞,比较培养上清液中HBsAg水平.HBsAg、HBV DNA水平的组间比较采用Wilcoxon秩和检验,HBV基因型构成比较采用x2检验.结果 rtA181T的检出率为5.5％ (165/3013),检出患者中大多数有拉米夫定和(或)阿德福韦酯用药史.突变类型上,40.0％ (66/165)为rtA181T单点突变,46.1％ (79/165)伴随阿德福韦酯耐药突变rtA181V/N236T,12.1％ (20/165)伴随拉米夫定耐药突变rtM204V/rtM204I,1.8％(3/165)伴随多重耐药突变;总体上73.9％ (122/165)在rt181位点可同时检出野生序列峰型.发生和未发生rtA181T突变的C/B基因型分别是92.1％/7.9％和82.1％/17.9％(P＜0.01).对S蛋白影响上,98.2％ (162/165)引起sW172终止突变,1.8％(3/165)引起sW172L或sW 172S突变.体外实验中rtA181T/sW172*突变株的HBsAg分泌受到抑制,但临床分析结果显示,检出rtA181T与未检出该突变的患者间血清HBV DNA和HBsAg水平差异无统计学意义(P＞ 0.05). 结论 rtA181T突变与阿德福韦酯和拉米夫定用药史密切相关,可引起sW172终止突变抑制HBsAg分泌,但在患者中rt181突变株常与rt181非突变株共存,临床大样本分析结果表明单独出现该突变未对HBsAg和HBV DNA水平有明显影响.     

膦甲酸钠治疗乙型肝炎病毒YMDD变异株感染疗效观察

膦甲酸钠具有良好的抑制乙型肝炎病毒的作用[1,2],它直接作用于核酸聚合酶的焦磷酸结合部位.与核苷类药不同,它不涉及细胞或病毒的胸腺嘧啶激酶,因而对无环鸟苷等耐药株仍有抑制作用[3,4].     

一株新疆维吾尔族D型乙型肝炎病毒的全基因克隆分析

目的 进行一株新疆维吾尔族D型HBV的全基因克隆.方法应用PCR扩增HBV全基因,进行全基因克隆,挑取阳性克隆进行序列测定,使用BioEdit和美国国立生物技术信息中心(NCBI)-BLAST工具进行生物信息学分析.结果获得1例新疆维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列,其基因组全长为3174 bp,与目前D基因型参照序列比较,同源性为92%～98%,与1株来自中国的DC重组基因型(AY862865)比较,同源性为91%.进一步分析发现,该新疆病毒株与目前D基因型基因库参照序列比较,有9个碱基缺失,位于核苷酸第1760～1768位(ATTAAAGGT),即可能发生了缺失突变.氨基酸分析发现,其血清型为ayw2型.重组位点分析发现,该新疆病毒株未与其他基因型重组.该新疆株与2株来自土耳其的HBV株(AY796032和AY721605)遗传距离最近.结论成功克隆了一例维吾尔族慢性HBV感染者D型HBV病毒株的全基因序列,新疆维吾尔族D基因型HBV病毒株有其自身特点.     

23株HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因组分析

目的研究HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者HBV变异特点。方法PCR扩增并克隆HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV全基因组DNA,测序并进行基因结构分析。结果获得23株HBV全基因组DNA,它们均属于c或B基因型。与中国HBVB、C基因型参照序列相比,HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者来源的HBV在表面抗原、P蛋白、X蛋白的反式激活区及增强子II／核心启动子区发生了一些有意义的共有变异。结论HBV变异可能与HBeAg阳性慢性乙型肝炎的发生、发展有关。     

慢性乙肝患者病毒前C区突变株感染的检测与意义

本文采用３‘端特异性ＰＣＲ技术对３６例慢性乙型肝炎患者进行了ＨＢＶ前Ｃ区１８９６位点突变检测。结果发现４例ＨＢＶ突变性感染，３例为混合感染，１例为单纯突变株感染。作者对使用３’端特异性ＰＣＲ对ＨＢＶ突变株检测的作用及ＨＢＶ突变株在乙肝病情发生，发展中的作用进行了探讨。     

乙型肝炎病毒变异

乙型肝炎病毒变异石家庄二六○医院田琦琦广州南方医院骆抗先乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染可引起从无症状携带、慢性肝炎到急性自限性肝炎或暴发性肝炎等各种临床表现，尤其是慢性活动性肝炎与肝硬化甚至肝细胞癌的发展密切相关。然而是什么因素决定了ＨＢＶ感染的不同临床...     

乙型肝炎病毒cccDNA

目前慢性乙型肝炎已成为危害人类健康的主要疾病.分子生物学的研究表明,乙型肝炎病毒(HBV)的共价环状闭合DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)在病毒持续感染、抗病毒治疗后病毒的再度活跃复制以及药物耐受方面起关键作用.     

乙型肝炎病毒的传播

乙型病毒性肝炎(hepatitisbvirus,HBV),简称乙肝,在甲、乙、丙、丁、戊型肝炎中最为严重的一种.他一直是我国“八五”、“九五”、“十五”重点医疗科研攻关项目.众所周知,乙肝危害已成为一种严重的世界性疾病,全球大约有20多亿人感染过HBV,其中约有4亿人为慢性感染.WHO已将HBV感染列为世界第九死亡原因,每年全世界死亡人数约30万.我国是HBV感染高发区,有50-70%的人感染过HBV,约有1.7亿人(占全国人口的十分之一还要多)是HBsAg携带者.我国现患乙肝者约3000万,其中60%以上为慢性乙肝患者.可见乙肝患病者之多,对人类危害之大.为了让人们了解乙肝,本文从HBV的感染,发病、转归(慢性乙肝,肝硬化、肝癌)和药物治疗进行系统的介绍和讨论.     

乙型肝炎病毒变异与乙型肝炎的临床研究

乙型肝炎病毒变异与乙型肝炎的临床研究侯金林，骆抗先世界卫生组织估计，全世界二亿以上的慢性ＨＢＶ携带者中，近２／３在中国。这些患者２５％病情严重，可最终死于肝硬化和肝癌。在中国每年有１００万左右的新发病例［１］。近年来随着筛选供血员措施和乙型肝炎（乙肝...