SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性,建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法,为SARS的快速诊断提供依据。方法合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物,从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA,经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析,并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段,随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100%),而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNI109与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示,该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus,BCV)和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)同源性最高,在氨基酸水平上同源性高达75%。结论SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNI109的保守性极强,适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序

【目的】克隆青蒿鲨烯合酶基因,为基因工程改造青蒿打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析等方法。【结果】通过PCR扩增和RT-PCR扩增,分别获得3590bp及1257bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99％,氨基酸序列同源性为100％。【结论】成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA。     

SARS冠状病毒M基因的克隆及序列分析

目的克隆SARS冠状病毒(SARS-CoV)GD322株M基因,并进行序列分析。方法根据GenBank中公布的SARS冠状病毒Tor2株M基因序列,设计一对引物,用RT-PCR法从SARS-CoVGD322株基因组中扩增M基因片段。克隆至pET-32(a)载体,转化大肠杆菌BL-21后测序,利用DNAstar和ClustalX分析所测序列翻译的氨基酸与81株SARS-CoVM基因翻译的氨基酸序列的差异。结果该M基因与Tor2株M基因核苷酸同源性为99.86%;与已收集的81株SARS-CoVM基因所译氨基酸相比,和41株(占50.62%)M蛋白完全同源,37株(占45.68%)仅有一个氨基酸改变,同源性为99.55%,仅与3株(占3.70%)有2个氨基酸差异,同源性为99.10%。结论已获得具有代表性的SARS-CoVM基因重组质粒。     

SARS冠状病毒E蛋白的表达与纯化

目的研究SARS冠状病毒E蛋白对SARS诊断和预防的价值，利用原核表达系统克隆和表达E蛋白并纯化。方法采用RT—PCR从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码N蛋白的基因；经克隆和测序分析后，亚克隆至表达载体DGEX-4T-2，转化大肠杆菌BL21（DE3），PCR和双酶切鉴定；阳性菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE分析，进一步以SARS病人血清进行免疫印迹分析；大量诱导表达N蛋白，亲和层析予以纯化。结果RT—PCR扩增出E蛋白基因的特异片段，获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的SARS冠状病毒的E蛋白基因序列同源性为100％；E蛋白基因被亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，在BL21中获得表达，表达产物能被SARS病人血清识别。表达的E蛋白经亲和层析获得纯化。结论成功构建了SARS冠状病毒E蛋白的重组表达质粒，在大肠杆菌中表达的E蛋白的融合蛋白具免疫活性。     

SARS冠状病毒Orf3和Orf4的克隆和分析

目的:克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析.方法:通过RT-PCR,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析.结果:RT-PCR扩增出的特异产物与预期长度相符,序列分析表明,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在99%以上.结论:成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框,为表达及功能研究奠定了基础.     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain-like的克隆及生物学特性

目的克隆弓形虫RH株Calpain（依钙蛋白酶）-like基因，分析免疫生物学功能，筛选预防弓形虫感染的疫苗候选分子。方法利用人类、鼠类和其它寄生虫的Calpain基因同源性比较的保守区域合成混合引物，以弓形虫的RNA为模板，应用RT-PCR扩增弓形虫Calpain-like基因片段，扩增的片段通过TA克隆插入克隆载体pET32A，筛选阳性克隆进行双酶切鉴定和DNA序列分析，用克隆的基因片段制备特异性基因探针，经Northern blot技术证实弓形虫Calpain-like基因mRNA。结果RT-PCR扩增了316bp弓形虫Calpain-like基因，其DNA序列与日本血吸虫Calpain基因同一区域的同源性为70％，与计算机推测的弓形虫Calpain-like基因的同源性为100％。Northern blot显示了弓形虫Calpain-like基因mRNA的大小约6300bp。结论弓形虫RH株基因组中存在Calpain-like基因，Calpain-like基因在弓形虫RH株中高度表达。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARS冠状病毒基因组及其编码蛋白生物信息学分析

目的：理论分析严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒基因组及其编码蛋白的分子生物学特征，为进一步研究SARS冠状病毒蛋白质功能提供信息资料。方法：利用生物信息学序列对比分析软件、蛋白氨基酸序列分析软件及蛋白质结构预测软件对GenBank公布的SARS冠状病毒基因序列及其编码的蛋白氨基酸序列进行分析。结果：SARS冠状病毒在基因结构上具有冠状病毒属的特征，而又与其他已知的冠状病毒编码序列存在明显的不同，与其他冠状病毒相比没有明显的基因重组、大片段插入或缺失的现象。来源于不同SARS冠状病毒株的基因序列变异速度较快。出现基因序列在不同区段同源性差异的现象。S蛋白氨基酸序列不存在与其他物种相同的连续性抗原决定簇序列。结论：SARS冠状病毒与其他冠状病毒的变异程度基本相同。SARS冠状病毒可能是自然界已经存在或变异产生的新的病毒株。近期世界范围流行的SARS是同一来源的病原体引起的，认为S蛋白氨基酸序列是SARS冠状病毒的主要抗原。     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

人幽门螺杆菌尿素酶B编码基因的克隆及序列分析

目的 获取含人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B编码基因并构建其原核表达的重组栽体，进行核甘酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增尿素酶B编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经SacI、Xhol双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp尿素酶B编码基因，与GenBank公布的序列相比较，有l.8％的bp发生变异，0．35％的氨基酸残基改变，但同源性高达98％。结论 成功地克隆了Hp尿素酶B编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

Establishment of a fluorescent polymerase chain reaction method for the detection of the SARS-associated coronavirus and its clinical application

Objective To establish a fluorescent polymerase chain reaction (F-PCR) method for detecting the coronavirus related to severe acute respiratory syndrome (SARS) and to evaluate its value for clinical application.Methods The primers and the fluorescence-labeled probe were designed and synthesized according to the published sequence of the SARS-associated coronavirus genes.A F-PCR diagnosis kit for detecting the coronavirus was developed, and 115 clinical nasopharyngeal gargling liquid samples were tested.Results The sequence of PCR amplified products completely matched the related sequence of the SARS-associated coronavirus genome. Forty-nine out of 67 samples from identified SARS patients and 8 of 18 samples from persons having close contact with SARS patients showed positive results.All 30 samples from healthy controls were negative.Conclusion The F-PCR method established may be a rapid, accurate and efficient way for screening and for the early diagnosis of SARS patients.     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的 探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法 对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA，用巢式PCR外侧下游引物进行反转录，以反转录产物为模板，进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMDl8-T载体后进行测序鉴定。结果 被检样品扩增出特异片段，经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论 反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列，证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus genotype and its characterization

Objective To study the severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus genotype and its characteristics.Methods A SARS-associated coronavirus isolate named ZJ01 was obtained from throat swab samples taken from a patient in Hangzhou, Zhejing province. The complete genome sequence of ZJ01 consisted of 29 715 bp ( GenBank accession : AY297028, version : gi : 30910859). Seventeen SARS-associated coronavirus genome sequences in GenBank were compared to analyze the common sequence variations and the probability of co-occurrence of multiple polymorphisms or mutations.Phylogenetic analysis of those sequences was done.Results By bioinformatics processing and analysis, the 5 loci nucleotides at Z J01 genome were found being T, T, G, T and T, respectively. Compared with other SARS-associated coronavirus genomes in the GenBank database, an A/G mutation was detected besides the other 4 mutation loci( C: G: C: C/T: T: T: T) involved in this genetic signature. Therefore a new definition was put forward according to the 5 mutation loci. SARS-associated coronavirus strains would be grouped into two genotypes (C:G:A: C: C/T: T: G: T: T), and abbreviated as SARS coronavirus C genotype and T genotype. On the basis of this new definition, the ZJ01 isolate belongs to SARS-associated coronavirus T genotype, first discovered and reported in mainland China. Phylogenetic analysis of the spike protein gene fragments of these SARS-associated coronavirus strains showed that the GZ01 isolate was phylogenetically distinct from other isolates, and compared with groups F1and F2 of the T genotype, the isolates of BJ01and CUHK-Wl were more closely related to the GZ01 isolate. It was interesting to find that two(A/G and C/T) of the five mutation loci occurred in the spike protein gene, which caused changes of Asp to Gly and Thr to lie in the protein, respectively.Conclusion Attention should be paid to whether these genotype and mutation patterns are related to the virus‘ s biological activities,epidemic characteristics and host clinical svmotoms.     

SARS病毒基因检测结果与患者病情、病程和体液免疫的关系研究

目的:研究严重急性呼吸综合征患者的病情、病程和特异性抗体产生对SARS病毒基因阳性检出率的影响。方法:采用巢式反转录PCR检测健康人,发烧非SARS患者,不同时期和不同病情SARS患者以及存不存在特异性抗体的SARS患者痰标本中的SARS病毒核酸即RNA。结果:巢式RT—PCR检测SARS患者痰标本中的SARS病毒RNA的敏感度为60.0％。6 d～10 d组阳性检出率最高,为100％,高于11 d～25 d组,而11 d～25 d组的阳性检出率又高于>25 d组(P<0.01);病情轻组比病情重组的阳性检出率高(P<0.05);抗体阴性组比抗体阳性组检出率高(P<0.05)。结论:SARS病毒基因检测阳性率在轻病情组比重病情组高,住院时间短组比住院时间长组高,血清特异性抗体阴性组比阳性组高。     

SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的 原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法 用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E．coli BL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果 实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论 用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。