结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的表达及纯化

目的克隆结核分枝杆菌MPT63抗原蛋白的编码基因Rv1926c,并在大肠杆菌中表达纯化,获得结核分枝杆菌重组MPT63蛋白。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1926c基因编码序列,克隆入原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组MPT63抗原蛋白。结果测序表明重组质粒pET30aRv1926c具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白MPT63在大肠杆菌中以包涵体形式稳定表达。结论结核分枝杆菌MPT63重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌毒素蛋白 higB 的原核表达及分析

目的：克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a（＋）-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32 a（＋）质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达载体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。     

结核分枝杆菌Mtb81蛋白的表达及应用研究

目的克隆结核分枝杆菌Mtb81蛋白的编码基因Rv1837c,并在大肠杆菌中表达、纯化,获得重组蛋白Mtb81。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,PCR扩增Rv1837c基因序列,克隆入原核表达载体pET-28a,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达,纯化表达产物,获得重组Mtb81。ELISA检测重组Mtb81蛋白的敏感性和特异性。结果重组质粒pETRv1837c测序表明具有正确的编码序列,质粒构建成功,重组蛋白Mtb81在大肠杆菌中以包涵体和可溶性形式稳定表达。以Mtb81为抗原ELISA检测结核病患者血清抗体总敏感性为20.83%,特异性为95.83%。结论结核分枝杆菌Mtb81重组蛋白能在大肠杆菌工程菌种成功表达,为进一步的应用研究奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv0808基因的克隆、表达、纯化及抗原性研究

目的克隆、表达和纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)体内诱导基因Rv0808,并制备多克隆抗体,研究其编码蛋白的抗原性,了解诊断应用价值。方法高保真PCR扩增Rv0808基因,克隆入表达载体pET-30a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3),测序正确的克隆用IPTG诱导表达。用镍柱纯化重组蛋白,然后用纯化蛋白免疫新西兰白兔,制备和纯化多克隆抗体。将重组蛋白分别与多克隆抗体和结核病患者血清进行Western blot鉴定,并尝试用多克隆抗体进行免疫组化染色检测巨噬细胞中M.tb。结果成功构建了pET-30a(+):Rv0808重组表达载体。经过重组蛋白的可溶性表达及纯化后,SDS-PAGE结果显示在66kD处有一单一蛋白条带。将此蛋白免疫新西兰白兔后获得了效价为6400的多克隆抗体。重组蛋白与多克隆抗体可以发生免疫反应,但却不能检测出结核患者血清中的相应抗体。用此多克隆抗体也无法检测出巨噬细胞中的M.tb。结论结核分枝杆菌Rv0808编码蛋白具有良好的免疫反应性和免疫原性,但可能对于结核病的诊断价值较小。     

结核分枝杆菌优势蛋白PPE37重组载体的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ppe37基因的重组原核表达质粒,并将其转化到E.coli BL21中诱导表达。方法以结核分枝杆菌国际标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR法扩增ppe37基因,将其克隆至pEasyE2克隆载体中,构建pEasyE2-ppe37重组质粒。经双酶切后将ppe37基因片段亚克隆到pET30a载体中,构建重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE及WesternBlot对表达产物进行鉴定。结果 PCR法扩增出约1600bp的条带。重组质粒pEasyE2-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确,测序结果与GenBank中登录的PPE37蛋白基因序列一致。重组原核表达质粒pET30a-ppe37经PCR及双酶切鉴定构建正确。SDS-PAGE鉴定表达的组氨酸标签重组蛋白相对分子质量约为50KDa,Western blot验证重组蛋白可与抗组氨酸单抗发生特异性反应。结论成功构建结核分枝杆菌ppe37基因重组原核表达质粒pET30a-ppe37,并成功诱导表达,为PPE37蛋白作为结核病特异性诊断抗原的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌特异性分泌蛋白的原核表达、纯化和免疫原性分析

目的 构建结核分枝杆菌rv1837c、rv3803c基因原核表达重组质粒,进行表达、纯化,并分析其免疫原性.方法 PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv rv1837c、rv3803c基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后,再亚克隆入pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体.然后转化入表达宿主大肠杆菌B121(DE3),经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导;分别与组氨酸标签单克隆抗体及结核患者血清进行Western blot,鉴定Rv1837c、Rv3803c重组蛋白.经镍离子螫和氮川乙酸-组氨酸标签亲和树脂纯化,将纯化的重组蛋白分别免疫家兔,取兔血清与纯化蛋白通过Western blot方法,检测家兔血清中的抗体.结果 pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c重组体表达相对分子质量为92000及38 000的重组蛋白,表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中,表达量分别占全菌蛋白质的30%及50%.获得纯度为90%的重组蛋白.纯化蛋白通过Western blot鉴定证实为目的 蛋白,有较强的免疫原性.结论 成功构建原核表达重组质粒pET30a(+):rv1837c、pET30a(+):rv3803c,并获得Rv1837c及Rv3803c重组蛋白,为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

结核分枝杆菌突变gyrase A基因原核表达载体的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ser95Thr突变DNA促旋酶A(DNA gyrase A)基因原核表达载体并鉴定,为进一步研究奠定基础。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用重叠延伸剪切技术,分别通过3次PCR扩增Ser95Thr突变gyrase A基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pET-32 a(+),获得重组表达质粒pET-mgyr。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出Ser95Thr突变gyrase A基因,经过酶切、PCR和测序鉴定,表明突变gyrase A基因正确地插入原核表达载体pET-32 a(+)。结论成功构建了原核表达载体pET-mgyr,为Ser95Thr突变gyrase A基因的功能研究奠定了基础。     

重组结核分枝杆菌 MPT64的克隆与表达

目的：克隆和表达结核分枝杆菌抗原 MPT64,并分析其免疫活性。方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增 mpt64基因,克隆至 T 载体 pMD18-T,转化入 E.coli DH5α,菌落 PCR 鉴定阳性克隆并测序分析。将测序正确的 pMD18-T-mpt64的 mpt64基因亚克隆至表达载体 pET-28a,构建重组质粒 pET-28a-mpt64,转化 E.coli BL21中,PCR 和双酶切鉴定阳性重组子,IPTG 诱导 MPT64表达,亲和层析纯化,western-blot 分析其免疫活性。结果：成功构建 pET28a-mpt64重组表达质粒,表达、纯化获得分子量约为26kDa 的 MPT64,并能被结核病人血清识别。结论：克隆表达获得具有免疫活性的重组结核分枝杆菌 MPT64蛋白。     

重组结核分枝杆菌ESAT-6的克隆与表达

目的:克隆和表达结核分枝杆菌ESAT-6。方法:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序。将esat-6基因亚克隆至pET-28a,构建pET-esat-6重组质粒,转化入大肠杆菌BL21感受态,PCR和双酶切鉴定阳性克隆,经IPTG诱导表达,用His-bindTM亲和层析柱纯化ESAT-6,SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果:PCR扩增出esat-6基因的特异片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,并在BL21获得表达,纯化的ESAT-6能被结核病人血清所识别。结论:成功克隆和表达获得重组蛋白ESAT-6。     

结核分枝杆菌H37Rv株Rv1494和Rv1495 假想蛋白基因的克隆表达

目的 为探索参与调控结核分枝杆菌(MTB)持续性感染的相关分子,对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆、表达及Western blotting鉴定.方法 采用Bioedit、Dnaman软件及Pfam数据库对MTB H37Rv株Rv1494、Rv1495基因编码蛋白质的氨基酸组分、蛋白模块以及其与大肠杆菌E.coli的mazEF蛋白家族的同源性进行分析.以H37Rv株基因组为模板,分别对Rv1494、Rv1495基因进行克隆,构建pET32a( )原核表达质粒,转化BL21宿主菌.重组蛋白经SDS-PAGE电泳分离纯化和Western blotting鉴定.结果 生物信息学分析提示,Rv1494基因、Rv1495基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌E.coli染色体编码的mazEF家族中的抗毒素和毒素具有一定程度的同源性,分别为26%和29.75%;经测序表明原核表达重组质粒构建成功.负载重组质粒的BL21菌经IPTG诱导后可表达出分子大小与预期值相一致的融合蛋白,表达量均可达到菌体总蛋白的60%.重组蛋白经Western blotting检测出特异性阳性信号.结论 首次对MTB H37Rv株编码Rv1494、Rv1495假想蛋白基因进行克隆表达,为进一步探讨该基因在参与调控MTB持续性感染过程中的功能奠定基础.     

结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达

目的: 研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长. 方法: 培养结核分枝杆菌,提取其基因组,PCR扩增出Rv2450c基因,克隆入pSP73载体,测序分析. 将该目的基因亚克隆入pGEX-4T-2表达载体,测序证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),30℃用IPTG诱导5 h然后进行SDS-PAGE分析. 结果: 测序结果证实获得了Rv2450c基因,其序列与GenBank中报道完全一致. SDS-PAGE分析表明,Rv2450c基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了重组蛋白,表达的蛋白量约占菌体蛋白的22.9%. 结论: 成功克隆了结核分枝杆菌Rv2450c基因,并在大肠杆菌中获得了高效表达.     

结核分枝杆菌RD1区PPE68/GST融合蛋白表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌PPE68/GST融合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导表达. 方法: 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并转化E.coli JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.采用GST蛋白纯化试剂盒进行重组融合蛋白纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定重组表达产物. 结果:成功构建原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873并表达出约Mr 63 000大小的PPE68/GST融合蛋白,占总菌体的40%. Western Blot检测该融合蛋白能和结核患者多价抗血清发生反应. 结论:成功地构建了原核表达质粒pGEX-4T-1-Rv3873,并在大肠杆菌得到表达.     

Rv1272和Rv1273与结核分枝杆菌耐药相关性研究

目的研究结核分枝杆菌Rv1272和Rv1273基因编码蛋白与药物外排的关系。方法利用生物信息学方法分析Rv1272和Rv1273基因及其编码蛋白的结构,采用PCR技术扩增该两个基因,并与pMF406质粒连接构建重组质粒,测序正确后,电穿孔法将重组质粒转化耻垢分枝杆菌m c2155。采用W estern b lotting对两个目的蛋白进行亚细胞定位;试管法测定重组菌株对常用的9种抗菌药物的最低抑菌浓度(M IC),以转化pMF406空质粒的耻垢分枝杆菌作为对照菌株。结果经测序验证重组质粒构建成功,W estern b lotting结果显示Rv1272和Rv1273为膜蛋白。试管法测定结果显示:含有目的基因的重组菌株对9种抗菌药物的M IC与对照菌株比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Rv1272和Rv1273蛋白为膜蛋白,未发现其与结核菌耐药之间的直接关系。     

结核分枝杆菌RD区ESPJ和ESPK蛋白在诱导巨噬细胞极化中的作用

目的：探究结核分枝杆菌RD区ESPJ和ESPK蛋白在巨噬细胞极化中的作用。方法：将结核分枝杆菌RD区Rv3878和Rv3879c基因分别构建至原核表达载体,体外诱导表达并纯化重组蛋白GST-ESPJ和HIS-ESPK,用重组蛋白刺激巨噬细胞,Western Blot和ELISA法检测重组蛋白对巨噬细胞极化的影响;构建重组菌BCG-Rv3878和BCG-Rv3879c,用重组菌感染巨噬细胞,RT-qPCR、Western Blot和ELISA法检测重组BCG对巨噬细胞极化的影响,并采用菌落计数法检测重组BCG在巨噬细胞内的存活。结果：重组ESPJ和ESPK蛋白刺激巨噬细胞均可诱导其向M2型极化,转录因子c-Maf表达增加;成功构建重组菌BCG-Rv3878和BCG-Rv3879c,重组BCG感染巨噬细胞也能诱导M2型巨噬细胞极化,巨噬细胞内c-Maf转录因子表达明显升高;菌落计数结果显示重组BCG胞内存活增加。结论：结核分枝杆菌ESPJ和ESPK蛋白可诱导M2型巨噬细胞极化并促进细菌的胞内存活,这可能与结核分枝杆菌的免疫逃逸和潜伏感染有关,转录因子c-Maf在其中可能起到至关重要的作用。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价

  目的  评价结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c的细胞表位融合蛋白的免疫原性,为研制新型多阶段结核疫苗提供可靠的靶抗原。  方法  将Rv2660c、Rv2460c、Rv3875和Rv3804c基因中的细胞表位串联构成融合抗原基因(命名为msv),克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1中,诱导表达后采用亲和层析纯化表达产物,经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用纯化的融合抗原蛋白免疫小鼠,ELISA法检测免疫小鼠的特异性抗体滴度;分离免疫小鼠的脾淋巴细胞,采用淋巴细胞增殖法检测其免疫原性。  结果  成功构建了能表达融合抗原基因msv的原核表达质粒;SDS-PAGE和Western blot结果表明,表达产物亲和层析纯化后,获得相对分子质量为41.3×103的目的蛋白;ELISA检测免疫小鼠血清抗体滴度,结果表明特异性抗体效价约为1:81 920;淋巴细胞增殖实验结果表明,抗原致敏的淋巴细胞经融合蛋白msv刺激后明显增殖。  结论  成功表达并纯化出融合蛋白msv,该融合蛋白可诱导小鼠特异性抗体表达和刺激细胞免疫应答,可作为结核疫苗的抗原组分。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合基因的克隆表达及生物信息学分析

目的构建结核分枝杆菌Ag85B、TB10.4及Ag85B-TB10.4融合表达载体,并进行抗原的生物信息学分析,为候选疫苗筛选奠定基础。方法从结核分枝杆菌H37Rv菌株中分别扩增出Ag85B基因,TB10.4基因,Ag85B-TB10.4;将Ag85B克隆入pET-28a(+)表达载体中,将TB10.4和Ag85B-TB10.4分别克隆入pET-SUMO表达载体中。上述重组质粒转化入大肠埃希杆菌BL21菌中(DE3),经IPTG诱导表达,并对其进行生物信息学分析。结果 (1)成功将结核分枝杆菌Ag85B和TB10.4,Ag85B-TB10.4基因分别克隆入pET28a(+)和pET-SUMO表达载体中,经IPTG诱导蛋白表达后,对经超声裂解的菌液上清进行SDSPAGE电泳,表明获得了与预期蛋白大小一致的表达产物,重组融合蛋白pET-SUMO-Ag85B-TB10.4蛋白分子质量约为54kDa。(2)生物信息学分析显示Ag85B-TB10.4融合蛋白具有多个潜在抗原位点。结论成功构建了重组质粒pET-28a-Ag85B,pET-SUMO-TB10.4和pET-SUMO-Ag85B-TB10.4,并获得了Ag85B,TB10.4和Ag85B-TB10.4的可溶性原核表达产物;生物信息学分析在Ag85B与TB10.4蛋白加入一段蛋白linker后蛋白的亲水性增强,抗原决定簇面积增大,为后续的功能实验研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌热休克蛋白60编码基因的克隆与原核表达

目的 克隆结核分枝杆菌热休克蛋白60(Hsp60)编码基因, 并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从结核杆菌H37Rv株中扩增hsp60基因,并将其与pZero-T载体连接,进行DNA测序.将得到的hsp60基因亚克隆到表达载体pProEXHTb中,构建重组原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌BL21中诱导表达.结果 成功地克隆了结核分枝杆菌hsp60基因.DNA测序证实,与GenBank公布的序列一致.含pProEXHTb-TBhsp60基因表达质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后,能够高效表达相对分子质量(KD)约为60KD的融合蛋白.结论 获得了结核分枝杆菌hsp60基因,成功地构建了原核表达质粒pProEXHTb-TBhsp60,并在大肠杆菌得到表达,为研究其免疫学特性奠定了基础.     

结核分枝杆菌 Rv0757基因的原核表达及其编码蛋白对巨噬细胞功能的影响

目的构建结核杆菌Rv0757基因原核表达重组质粒pET28a-Rv0757,并研究表达的目标蛋白对小鼠骨髓巨噬细胞株ANA-1细胞的作用。方法将扩增出的Rv0757基因重组到原核表达质粒pET28a(+),并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定诱导表达的目的蛋白。纯化目标蛋白后将目标蛋白PhoP作用于小鼠ANA-1细胞,检测活细胞数、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、一氧化氮(NO)和细胞凋亡指标。结果成功构建出pET28a-Rv0757原核表达质粒,诱导表达的目标蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,其相对分子质量约为32×103。目的蛋白作用于小鼠ANA-1细胞后对活细胞数和细胞上清LDH活力无明显影响,但可以明显抑制细胞释放NO和细胞凋亡。结论本研究成功构建了原核表达载体pET28a-Rv0757,并成功表达出目标蛋白,该蛋白对小鼠ANA-1细胞没有毒性损伤,但可以抑制细胞释放NO和细胞的凋亡。