α肿瘤坏死因子（TNFα）基因的分离鉴定及在人肝癌细胞中…

应用不连续密度梯度法分离获得人肝癌浸润性单个核细胞（ＴＩＭ），ＲＮＡ斑点杂交提示ＴＩＭ中有明显的ＴＮＦαｍＲＮＡ转录。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增反应分离得到一特异的７００ｂｐ左右的ＤＮＡ片段，ＤＮＡ序列分析证实这一ＤＮＡ片段中包含编码人ＴＮＦα成熟肽所需的全部ｃＤＮＡ序列。将这一人ＴＮＦαｃＤＮＡ克隆到真核细胞表达质粒ｐＳＶＫ３，获得真核细胞表达重组质粒ｐＳＶＫ３－ｔｎｆ，用磷酸钙沉淀法将ｐＳＶＫ３－ｔｎ     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３－磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳＰＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα     

携带HuIL—3基因的人肝癌特异性逆转录病毒转体的构建

构建携带人白细胞介素ｃＤＮＡ的人肝癌特异性闻生转录病毒载体。将ＨｕＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点，构建ＳＶ４０早期启动子驱动的载体ｐＭＮＳ－ＩＬ－３；从质粒ｐＧＥＭ，７Ｚｆ－ＡＦＰｅ中游离人甲胎蛋白增强子核心序列，先克隆 到ｐＭＮＳＭ的ＰＬ位点上，     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α─ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３─磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳｐＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα基因启动子和信号序列及ＵＡＳＰＧＫ片段，构建成含ＭＦα基因启动子和信号序列的表达分泌型载体ＹＥｐ５１０１及含ＭＦα启动子和信号序列与ＵＡＳＰＧＫ的强化表达分泌型载体ＹＥｐ５１０２。这两种载体可用于外源基因表达的比较研究，探讨ＵＡＳ对外源基因表达的调控作用。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

肝癌组织特异性小鼠IL─3、TNF逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达

从ｐＳＶ２３ＳＭＴＮＦ和ｐＳＰＭｏＩＬ─３质粒分别切下小鼠肿瘤坏死因子（ｍＴＮＦ）和小鼠白细胞介素３（ｍＩＬ─３）ｃＤＮＡ，并切除ｍＩＬ─３ｃＤＮＡ３＇端ＡＴＴＴＡＴＴＴＡ不稳定序列，以两种细胞因子ｃＤＮＡ作为目的基因，分别克隆到逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ多克隆位点，再于目的基因上游分别插入小鼠白蛋白启动子增强子序列（Ａｌｂｅ／ｐ），构建成功两种肝癌组织特异表达性细胞因子逆转录病毒载体，经磷酸钙共沉淀法导入包装细胞ｐＡ３１７中包装成重组病毒颗粒，并测转染率。经ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测定重组病毒Ｎｅｃ抗性感染率后，在８μｇ／ｍｌＰｏｌｙｂｒｅｎｅ存在下感染肿瘤细胞，经４００μｇ／ｍｌ活性Ｇ４１８选择后测转基因肿瘤细胞培养上清中表达相应细胞因子，证明ｍＩＬ─２、ｍＩＬ─３特异地在表达白蛋白的小鼠肝癌细胞中表达（Ｐ＜０．００１）。     

大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶I基因在非肝细胞中的表达

氨甲酰磷酸合成酶Ｉ（ＣＰＳＩ）ｃＤＮＡ全序列基因片段与ｐＳＶ２载体的重组及重组质粒ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ在７４０２人肝癌细胞、ＣＨＯ细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞中的表达结果表明，ｐＳＶ２－ＣＰＳｃｆ转染的以上３株细胞均可稳定、高效地表达ＣＰＳＩ。通过核Ｒｕｎ－ｏｆｆ转录活性的检测和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交证实，表达的ＣＰＳＩ转录产物结构完整。提示ＣＰＳＩ肝组织特异表达主要与转录改变有关。     

肝癌组织特异性小鼠IL—3,TNF逆转录病毒载体的构建及在肝癌细胞…

从ＰＳＶ２３ＳＭＴＮＦ和ＰＳＰＭＯＩＬ－３质粒分别切下小鼠肿瘤死因子和小鼠白细胞介素３（ｍＩＬ－３）ｃＤＮＡ，并切除ｍＩＬ－３ｃＤＮＡ３＇端ＡＴＴＴＡＴＴＴＡ不稳定序列，以两种细胞因子ｃＤＮＡ作为目的基因，分别克隆到逆转录病毒载体ＰＭＮＳＭ多克隆位，再于目的基因上游分别插入小白蛋白启动子增强子序列，构建成功能两种肝癌组织特异表达性细胞因子逆转录病毒载体，经磷酸钙共沉淀法导入包装细胞ＰＡ３１７中包     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

pBV—IL—6重组质粒构建及其在E.coli中的高效表达

目的 构建人ＩＬ－６重组质粒（ｒｈＩＬ－６），并使其在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达。方法 经计算机分析设计，人工合成３条寡核苷酸引物，通过定点诱变并优化起始区，应用ＰＣＲ扩增及重组ＤＮＡ技术，构建重组质粒ｐＢＶ－ＩＬ－６，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ宿主菌ＤＨ５α中诱导表达，对产物进行纯化和复性，ＭＴＴ法检测生物活性。结果 获得２种ｒｈＩＬ－６高效表达的Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α／ｐＢＶ－ＩＬ－６工程菌，一种表达２０     

C－myc基因外显子1导入并稳定高效表达的细胞株的建立

将ｃ－ｍｙｃ外显子１的ＤＮＡ片段，插入带有ｎｅｏ基因的真核细胞表达载体ｐＲＣ／ＣＭＶ，运用电穿孔基因导入法将此构建好的重组质粒导入Ｈｅｌａ细胞。在抗Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ的Ｈｅｌ３细胞抽提物中经免疫印迹技术检测，发现一条分子量约为３２ＫＤ的蛋白带，从而实现了ｃ－ｍｙｃ外显子１在真核细胞中高效、稳定地表达，为进一步研究ｃ－ｍｙｃ外显子１的生理功能打下基础。     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６～４５４ｂｐ一段长５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得的ｕＰＡＲｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细胞株９５Ｄ，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ证实转染细胞克隆有ｕＰＡＲ反义ＲＮＡ的表达。结论重组质粒ｐＵＲＡＳ能在肺癌细胞株９５Ｄ中表达尿激酶受体反义ＲＮＡ，尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ表达质粒的构建获得成功。     

人γ干扰素基因真核表达载体pZip—γ干扰素的构建

为构建逆转录病毒载介导的人γ干扰素（ＩＮＦ－γ基因真核细胞表达载体，将质粒ｐＧＥＭ－１－ＩＦＮ－γ用ＢａｍＨＩ酶切，分离回收入ＩＦＮ－γｃＤＮＡ片段，再定向克隆入逆转录病毒载体ｐＺｉｐ、Ｎｅｏ、ＳＶ（Ｘ）１。经酶切鉴定证实该片段已被正确克隆入ｐＺｉｐ．Ｎｅｏ．ＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ酶切位点，构建成ＩＦＮ－γ基因真核表达载体ｐＺｉｐ－ＩＦＮ－γ。ｐＺｉｐ－ＩＤＮ－γ的构建成功。为开展ＩＦＮ－γ基因     

大鼠肝氨甲酰酸合成酶IcDNA片段在肝癌及非肝细胞中表达体…

观察０．５８７和０．７１２ｋｂＣＰＳＩｃＤＮＡ片段分别与ＰＳＶ２载体的重组质粒ｐＳＶ２－ＣＰＳ５０５和ｐＳＶ２－ＣＰＳ５０７在人肝癌和非肝细胞中的表达情况。结果证实，两种重组的表达质粒转染的７４０２人癌细胞和ＮＩＨ／３Ｔ３细胞能有效地表达ＣＰＳＩ，ＣＰＳＩ基因的非翻译区顺序与其高度组织特异性无关。这些体系的建立为体外生产ＣＰＳＩ抗原和天然ＣＰＳＩ蛋白提供了细胞模型和实验依据，对深入了解ＣＰＳＩ的表     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

携带HSV—tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体。切除逆转录病毒病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ＰＭＮＭ；从真核表达载体ＰＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ＰＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮＰ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ＰＧＥＭ，７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ＰＭＮＰ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建     

携带HSV－tk基因的人肝癌特异性逆转录病毒载体的构建

构建携带单纯疱疹病毒ｔｋ基因（ＨＳＶ－ｔｋ）的人肝癌特异性逆转录病毒载体。方法和结果：切除逆转录病毒载体ｐＭＮＳＭ内部的ＳＶ４０启动子使之成为ｐＭＮＭ；从真核表达载体ｐＢＰＧＫ－ｔｋ质粒中游离带有磷酸甘油酸激酶基因（ｐｇｋ）启动子调控的ＨＳＶ－ｔｋ片段，克隆到ｐＭＮＭ的ＰＬ位点上，构建成普通型ＰＭＮｐ－ｔｋ逆转录病毒载体；从ｐＧＥＭ．７Ｚ－ＡＦＰｅ质粒中游离人甲胎蛋白基因增强子核心序列，克隆到ｐＭＮｐ－ｔｋ的ｐｇｋ启动子上游，构建成人肝癌特异型ｐＭＮＡＰ－ｔｋ逆转录病毒载体。结论：该载体对肝癌特异性前药转换基因治疗有重要意义。     

Tropic 1808基因在大肠杆菌中的表达

目的;在大肠杆菌宿主系统中表达Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基因编码的蛋白。方法：用ＰＣＲ方法从质粒中扩增出Ｔｒｏｐｉｃ１８０８ｃＤＮＡ开放阅读框架片段,并重组人表达载体ｐＥＴ－２１ａ中,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,用ＩＰＴＧ诱导Ｔｒｏｐｉｃ１８０８融合蛋白的表达,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,表达蛋白条带转至ＰＶＤＦ膜进行氨基酸序列分析,结果：构建了ｐＥＴ－２１ａ－１８０８重组质粒,外源性Ｔｒｏｐｉｃ１８０８基     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞…

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的Ｉ     

人分泌型白细胞介素2受体α链基因的克隆及其在真核细胞中的表达

删除人白细胞介素－２受体α链ｃＤＮＡ中编码胞质内１３个氨基酸及跨膜区１９个氨基酸残基的ＤＮＡ片段后，接上人工合成的终止寡核苷酸片段，改建后的ｃＤＮＡ与真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ重组成质粒ｐＣＭＶ／ｒｓＩＬ２Ｒ。用电打孔及磷酸钙法将此质粒转染ＣＨＯ细胞，经Ｇ４１８筛出表达Ｎｅｏ基因的克隆２０株，通过ｍＲＮＡ狭缝杂交及ＥＬＩＳＡ检测，有５株能稳定表达分泌型α链ｍＲＮＡ及蛋白，其中４株细胞培养上清中的ＩＬ２Ｒα链的含量达１４００Ｕ／ｍｌ以上。