高通量端粒酶抑制剂筛选模型融合表达载体的构建及转化

目的 构建含不同结构域的人端粒酶逆转录酶(hTERT)酵母三杂交系统融合蛋白表达载体并转化酵母.方法 采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中提取不同的hTERT cDNA片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3质粒,构建包含不同hTERT蛋白结构域的编码序列的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性和自激活检验.结果 经过测序验证,重组融合蛋白表达载体pYESTrp3-hTERT构建成功,转化酵母无毒性和自激活性.结论 成功构建能用于酵母三杂交系统的融合蛋白表达载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及hTERT和hTR间的相互作用.     

端粒酶活性调节机制与端粒酶抑制剂研究进展

TLM是真核细胞染色体的天然末端，含有许多简单非编码的串联重复DNA序列及多种蛋白质成分。它的生物学功能是防止染色体复制过程中的错误重组、端—端融合、抵御核酸酶、连接酶对DNA的损伤，维持基因组的稳定，调控细胞的寿命及其分化发育以及参与核膜附着等功能^［1.2］。1978年，Blackburn^［3］等首次克隆了四膜虫的TLM结构(C4T2)n，后相继在人和脊椎动物中均证实TLM重复单位为六聚体，且重复次数在每条染色体上不等。人的TLM约由15个kb反复串联的TTAGGG结构组成，并以50—200bp／次分裂进行性缩短，其双链DNA序列位于染色体3’端，突出约12—16个G核苷酸。突出的G可通过Ioogsteen型氢键连接形成C—C二聚体，亦可形成C—C*C三联体及更为常见的G4—DNA四联体结构。1986年，Cotlschling和Zakin等在纤毛属Oxytrich中发现了分子量分别为55KD和26KD的TLM结合蛋白，在酵母中为RAPI蛋白，人则为一个6万道尔顿的蛋白，它们均能抗高盐抽取和核酸酶的处理，依其特定的空间结构与TLMDNA结合，参与了冗川特定结构的形成、长度的调节和基因表达^［4.5］。Cooper等则用遗传筛选方法签定了裂殖酵母的TLM相关蛋白Tazlp，并发现Tazlp基因与Myb基因具有同源性。     

端粒、端粒酶、端粒酶抑制剂与消化系统肿瘤的研究进展

肿瘤是人类当前面临的最大顽症 ,它的形成是一个多阶段的过程。原癌基因的激活、抑癌基因的突变是肿瘤形成的重要分子基础。正常细胞在致癌因素作用下 ,转变为恶性细胞并不意味着一定能形成肿瘤 ,哺乳动物体内有一套精细的特性 -永存性 ,在肿瘤的发生中起着至关重要的作用。早在本世纪三、四十年代Ｍｕｌｌｅｒ和Ｍｃｃｌｉｎｔｏｃｋ就认识到染色体末端存在一种维持染色体完整和稳定的特殊结构—端粒(ｔｅｌｏｍｅｌｅ) ,能防止染色体ＤＡＮ降解 ,末端融合缺失和非正常重组[1] 。端粒酶 (ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ)是一种能延长端粒末端的核糖…     

端粒酶抑制剂与肿瘤治疗的研究进展

端粒、端粒酶与肿瘤发生的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一.有研究表明[1],端粒酶在85%～95%的恶性肿瘤组织中有阳性表达,而在正常体细胞则一般为阴性,因此端粒酶抑制剂的开发研究为恶性肿瘤的早期诊断、预后估计及基因治疗开辟一个新的途径.本文对目前端粒酶抑制剂的研究进展及其应用前景和可能面临的问题予以综述.     

RNA干扰技术在端粒酶抑制剂中的应用

RNA干扰是一种由双链RNA介导的基因沉默现象,它能特异地沉默内源或外源性靶基因。端粒的生物学功能主要是保护染色体末端,避免核酸酶对染色体末端的降解。端粒酶是由端粒酶反转录酶和端粒酶RNA模板组成的具有特殊反转录活性的核糖核蛋白复合物。通过RNA干扰技术抑制端粒酶阳性细胞中的端粒酶活性可导致细胞凋亡或衰老。     

研究显示端粒酶抑制剂Imetelstat或可治疗骨髓纤维化

Imete｜stat是一种端粒酶抑制剂,是美国Geron公司正在研究的一种新药（investigational new agent）。初步研究结果显示,Imetelstat对治疗骨髓纤维化（myelofibrosis）有一定的效果。这一研究结果于2013年12月9日在美国血液病学学会（ASH）第55届年会上公布。     

瘤内注射端粒酶抑制剂AZT对大鼠种植性肝癌的影响

目的:观察瘤内注射端粒酶抑制剂AZT对大鼠种植性肝癌的影响,探讨端粒酶抑制剂治疗恶性肿瘤的可能性.方法:将SD雄性成年大鼠采用B超引导下癌细胞悬液注入法制作大鼠种植性肝癌模型,并用Wistar雄性大鼠传代.选取肝肿瘤大小接近的肝癌模型大鼠随机分为2组,AZT治疗组大鼠(n=21)行直视下瘤内注射AZT,对照组大鼠(n=21)瘤内注射生理盐水,分别测量肿瘤体积、采用TRAP-ELISA法测定肿瘤组织端粒酶活性、MG-P-MY组合染色观察细胞凋亡并计算细胞凋亡率.结果:处理后第6天AZT组肿瘤组织端粒酶活性明显低于对照组(分别为0.426±0.162、0.767±0.102,二者比较P<0.05),而肿瘤细胞调亡率AZT组明显升高[AZT组(12.439±0.802)%,对照组(3.903±0.182)%, P<0.05],体积比较AZT组明显小于对照组[分别为(449.870±28.107) mm3、(759.885±22.154) mm3, P<0.05].结论:AZT能有效降低荷瘤大鼠肿瘤组织的端粒酶活性、诱导细胞凋亡、减缓肿瘤生长,端粒酶抑制剂治疗恶性肿瘤是一种可能应用于临床的方法.     

反义寡核苷酸和小分子干扰RNA作为端粒酶抑制剂的研究进展

端粒酶是真核生物染色体末端的核蛋白结构,能够指导合成重复的端粒序列TTAGGG,而细胞的复制与端粒长度的维持有关。已有大量关于端粒酶的研究,很多临床前试验已将抑制端粒酶活性作为治疗恶性肿瘤的一个新的治疗方案。本文综述了反义寡核苷酸(ASODN)和小分子干扰RNA(siRNA)作为端粒酶抑制剂的研究进展,并进一步讨论了携载ASODN及siRNA基因载体的应用及其优缺点。     

人端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体的构建及初步鉴定

端粒是真核细胞染色体末端的一个特殊结构 ,由一段具有特定重复序列的ＤＮＡ和端粒结合蛋白组成 ,是维持染色体结构稳定的重要因素。正常细胞随着细胞分裂活动的进行 ,端粒ＤＮＡ逐渐缩短 ,当缩短到一定程度时 ,染色体结构被破坏 ,细胞进入衰老期并以死亡而告终。但肿瘤细胞似乎丧失了这种能力 ,表现出永生化而无限制增殖的特性。尽管端粒研究为肿瘤、衰老难题提供了一个重要的研究方向 ,但有关端粒蛋白组分的结构及其调控机制仍不十分清楚。因此 ,寻找新的、关键性的端粒、端粒酶调控分子是非常重要的[1] 。本课题拟以已发现的端粒相关蛋白…     

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂高通量筛选模型的建立

目的:建立表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂的高通量筛选模型。方法:通过基因工程技术表达EGFR-RTK,ELISA法验证其生物学活性;应用表面等离子共振原理筛选与激酶具有结合活性的化合物,ELISA法检测其生物学活性。结果:在原核表达系统中成功表达具有生物学活性的EGFR-RTK蛋白。将蛋白偶联至生物芯片,阳性化合物EI 188与EGFR酪氨酸激酶结合的Kd值为5.00×10-7mol.L-1,IC50为12.37μmol.L-1,与预期结果一致。应用该模型筛选31个待测化合物,发现了6个具有结合活性和酶抑制活性的EGFR-RTK抑制剂。结论:成功建立了基于表面等离子共振原理和ELISA法的高通量EGFR-RTK抑制剂的筛选模型,为发现新型酪氨酸激酶抑制剂奠定了基础。     

端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞特异表达载体的构建和鉴定

目的 利用端粒酶逆转录酶基因启动子,构建能在人肿瘤细胞中特异表达目的基因的表达载体。方法 通过PCR方法从pEGFP-N1质粒中扩增出绿色荧光蛋白基因并克隆到逆转录病毒载体pLNCX的多克隆位点上,命名为pLNCX-EGFP。设计含有特定酶切位点的引物,从人基因组中扩增出端粒酶逆转录酶基因启动子序列,将该序列片段定向克隆到已用限制性内切酶切除巨细胞病毒启动子的pLNCX-EGFP载体上,构建成端粒酶逆转录酶基因启动子调控的含有绿色荧光蛋白报告基因的表达载体pLNT-EGFP。将该表达载体pLNT-EGFP瞬时转染高表达端粒酶活性的HLF细胞株和不表达端粒酶活性的WI38细胞株,以检测端粒酶逆转录酶基因启动子的转录活性。结果 表达载体pLNT-EGFP经酶切、测序分析证实与设计的完全一致。细胞瞬时转染结果表明,pLNT-EGFP能特异地在端粒酶阳性细胞中高效表达绿色荧光蛋白报告基因,而在端粒酶阴性细胞中不表达报告基因。结论 成功构建了由端粒酶逆转录酶基因启动子调控的肿瘤细胞靶向表达载体。     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

目的 应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3 - 4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型.方法 将质粒pMAL-c2/NS3 - 4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3 - 4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性.结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量.在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%.蛋白酶的Km值为4.74 μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L.结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选.     

应用显微切割TRAP法对食管癌端粒酶活性进行分析

目的 探讨端粒酶活性在食管粘膜上皮不典型增生、食管鳞癌中的变化,同时研究端粒酶活性与癌分化、浸润、转移的关系。方法 应用显微切割－TRAP－银染法对45例食管鳞癌组织、癌旁非典型增生上皮及切缘的正常粘膜上皮进行定点端粒酶活性的检测。结果 食管正常粘膜上皮的端粒酶性阳性率为5％（2／40）,非典型增生上皮为79.3%（23／29）,癌组织为82.2%（37／45）。非典型增生上皮的端粒酶活性明显高于正常上皮,差异有显著意义（P＜0.01）。同一癌组织中不同分化程度、不同浸润深度癌巢的端粒酶性差异无显著意义（P＞0.05）。有淋巴结转移者癌组织端粒酶活性明显高于无淋巴结转移者,差异有显著意义（P＜0.05）。结论 食管鳞癌及癌旁不典型增生组织端粒酶活性明显增高,癌组织中端粒酶活性与分化程度无关,而与淋巴结转移有关。     

用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂高通量筛选的均相时间分辨荧光免疫方法的建立

目的 建立一种均相时间分辨荧光免疫分析方法用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选.方法 根据铕联穴状化合物(EuK)和异藻蓝蛋白(XL-665)两个荧光化合物在激发后的能量共振转移所发出的特异性荧光,采用多功能酶标仪在波长为612 nm和670 nm处测定荧光信号的变化;以血管内皮生长因子2(VEGFR-2)为蛋白酪氨酸激酶,检测蛋白酪氨酸激酶抑制剂Sunitinib的抑制活性.结果 建立了一种用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂体外高通量筛选的均相时间分辨荧光免疫分析方法.在反应体系中,蛋白酪氨酸激酶VEGFR-2、三磷酸腺苷(ATP)和多肽底物浓度分别为5ng/μ1、100 μmol/L和1 μmol/L.在上述条件下,检测到Sunitinib 对 VEGFR-2酪氨酸激酶抑制活性的IC_(50)为86.7nmol/L,与文献报道的结果近似.结论 本实验所建立的均相时间分辨荧光免疫分析方法操作简便,重复性好,可用于蛋白酪氨酸激酶抑制剂的体外高通量筛选.

Abstract：

Objective To establish an in vitro homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay method for high throughput screening of protein tyrosine kinase (PTK) inhibitors. Methods Specific fluorescence signals at 670 and 612 nm were measured by multifunctional microplate reader when the fluorescence was emitted through a resonance energy transfer between fluorescent materials (EuK and XL-665). The inhibitory activity of Sunitinib, a standard PTK inhibitor, on vascular endothelia growth factor receptor 2 (VEGFR-2) kinase activity was investigated. Results A homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay was established for high throughput screening of PTK inhibitor. In this system, the concentrations of VEGFR-2, adenosine triphosphate (ATP) and poly-peptide substrate were 5 ng/μ1, 100 μmol/L and 1 μmol/L,respectively. Sunitinib inhibited VEGFR-2 kinase activity with an IC_(50) value of 86.7 nmol/L, which was close to the values tested using other methods. Conclusion The homogeneous time-resolved fluorescence immunoassay we established can be easily used for high throughput screening of PTK inhibitors.     

单胺氧化酶抑制药物体外筛选模型的建立

目的：构建一种能用于治疗神经退行性变疾病单胺氧化酶（monoamine oxidase,MAO）抑制药物的体外筛选模型。方法：采用紫外分光光度方法,以苄胺或5-羟色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）分别作为MAO-B或MAO-A的反应底物,测定其活性,并对MAO浓度、底物浓度、缓冲液浓度、pH值、反应时间和温度等进行优化。结果：研究确定的模型反应体系条件为：在温度37 ℃、酶预孵育时间20 min和反应时间60 min下,测定MAO-B活性最佳条件为100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.6）,MAO和底物苄胺的终浓度分别为0.15 mg/ml和2.00 mmol/L;测定MAO-A活性最佳条件为100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 7.4）,MAO和底物5-HT的终浓度分别为0.40 mg/ml和5.00 mmol/L。结论：建立了一种MAO抑制药物体外筛选的模型,该模型具有成本低、操作简便等特点,适合于大规模筛选MAO-B和MAO-A的抑制药物。     

人端粒酶逆转录酶和人白细胞介素18融合基因真核表达载体的构建和功能研究

目的：以基因重组技术在真核细胞中表达人白细胞介素18（hIL-18）和人端粒酶逆转录酶（hTERT）融合基因，并观察其生物学功能。方法：健康人单核细胞经RT～PCR扩增hIL-18后、T—A克隆。亚克隆至经NheⅠ、HindⅢ酶切的PCDNA3．1（＋）／hTERT中，限制性内切酶验证后，挑选出含有目标基因的正确克隆。经限制性内切酶和DNA测序分析两个基因是否已经正确连接到真核表达载体中。将hTERT／hIL-18融合基因质粒脂质体介导转染3T3细胞中表达，经Western—blot验证目的基因表达产物，同时对转染细胞作免疫荧光染色。以ELISA检测转染细胞刺激KG-1细胞分泌了干扰素的能力，以流式细胞仪检测转染细胞抗MTX诱导凋亡的能力。结果：hTERT／hIL-18融合基因的真核表达载体PCDNA3．1（＋）构建成功，经限制性内切酶验证和DNA测序及同源性对比分析，该基因片段与NCBI基因库hIL-18和hTERT基因CDS序列同源性均达到99．9％；而细胞转染后经Western—blot验证，hTERT／hIL-18融合蛋白的分子量约127kMr，与预期一致，荧光显微镜观察显示融合蛋白在细胞中弥散表达。此融合蛋白能刺激KG-1细胞分泌γ-干扰素，并具有抗MTX诱导凋亡的生物学功能。结论：本实验构建的PCDNA3．1（＋）／hTERT—hIL-18质粒能够在真核细胞中表达，并具有生物学功能，为进一步转染树突状细胞，研制肿瘤的治疗性疫苗提供基础。