铁皮石斛DoSRK2E基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛蔗糖非酵解1型相关蛋白激酶2(Sn RK2)家族基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过RT-PCR、RACE克隆铁皮石斛Sn RK2(DoSRK2E)基因c DNA全长,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、结构域、跨膜结构、信号肽及亚细胞定位等;利用DNASTAR和MEGA进行多序列比对和系统发育关系重建分析;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式。结果获得铁皮石斛DoSRK2E基因(GenBank登录号API65110),cDNA全长1 795 bp,包含1个1 086 bp的完整开放阅读框,编码蛋白相对分子质量40 850,等电点4.80,无信号肽和跨膜域,包含1个蛋白激酶结构域、1个ATP结合位点和1个Ser/Thr蛋白激酶活化位点,预测定位在内质网膜上;DoSRK2E蛋白与植物SnRK2蛋白序列高度一致,系统发育位置位于SnRK2亚家族的分支III,与拟南芥At SnRK2.6的亲缘关系最近;DoSRK2E基因在铁皮石斛根中表达量最高,茎中次之,叶中最低。结论首次从珍稀濒危药用植物铁皮石斛中克隆得到SnRK2家族基因DoSRK2E,对其分子特性与组织表达模式进行了分析研究,为进一步揭示该基因在铁皮石斛逆境胁迫中的作用机制提供基础。     

铁皮石斛转录因子基因DoWRKY3的克隆与分子特性分析

目的克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛转录因子基因DoWRKY3,并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR和RACE技术获取基因全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用软件DNASTAR 6.0和MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助定量PCR检测基因表达模式。结果分离到DoWRKY3基因(GenBank注册号KT957549),cDNA全长2 065 bp,编码1条由509个氨基酸组成的多肽,相对分子质量55 580,等电点6.58;推定的DoWRKY3氨基酸序列具有植物WRKY蛋白家族保守的2个WRKY结构域(217~279、381~449)、2个WRKYGQK位点和2个C_2H_2型锌指结构元件(C-X_4-C-X_(22-23)-H-X_1-H);该蛋白预测无信号肽或跨膜域,定位在细胞核;DoWRKY3蛋白与多种植物WRKY蛋白一致性较高(46.3%~57.4%),与拟南芥At WRKY3、At WRKY4和丹参Sm WRKY54蛋白等亲缘关系近,聚在WRKY分子进化树的Group 1分支;DoWRKY3基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛根和叶中表达量较高,分别为茎中的2.32倍和1.69倍。结论 DoWRKY3基因全长的分子克隆与特征分析,为深入研究该基因在铁皮石斛生长发育、逆境生理以及次级代谢调控中的生物学功能奠定基础。     

铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A的克隆与表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用铁皮石斛F-box蛋白基因即S期激酶相关蛋白(S phase kinase-associated protein)基因DoSKP2A,并进行生物信息学和表达特征分析。方法采用RACE技术获基因全长;利用生物信息软件预测基因编码蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建;借助定量PCR检测基因表达模式。结果克隆到DoSKP2A(GenBank注册号KU160472),c DNA全长1 507 bp,开放阅读框(ORF)长1 101 bp,编码蛋白含366个氨基酸,相对分子质量39 590,等电点7.9。DoSKP2A蛋白不含跨膜域和信号肽,包含F-box核心结构域(26～88)、亮氨酸重复序列LRR(202～226)和多个保守基序;Do SKP2A与植物SKP2As蛋白一致性为64.6%～72.4%,所在分支隶属于SKP2As分子进化的单子叶植物分支,与小兰屿蝴蝶兰SKP2A亲缘关系近;DoSKP2A基因转录本在石斛3种器官中为组成型表达,根中相对表达量较高,为叶中的6.16倍,茎中次之,叶中表达量很低。结论获得一个全新的铁皮石斛F-box蛋白基因DoSKP2A全长、生物信息及其表达特征,为研究其在铁皮石斛生长发育、信号传导和抗逆境胁迫的分子机制提供基础。     

铁皮石斛2个F家族ABC转运蛋白基因的克隆和表达研究

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白F家族基因并进行生物信息学分析。方法利用RACE从铁皮石斛叶片cDNA中分离ABC基因,并进行编码蛋白相对分子质量、等电点、结构域、信号肽、跨膜域及亚细胞定位等生物信息学分析;采用DNASTAR和MEGA6进行氨基酸多序列比对和分子进化分析;借助实时荧光定量PCR技术检测基因组织表达模式。结果从铁皮石斛中分离到2个F家族ABC转运蛋白基因DoABCF1和DoABCF2(Gen Bank注册号KU160474和KU160475),全长为2 104 bp和2 193 bp,各编码1条由600和659个氨基酸组成的肽链,相对分子质量67 030和74 140,等电点6.20和5.71;DoABCF1和DoABCF2蛋白均包含2个保守的ABC结构域(分别为74~314、385~600和65~323、392~607)和多个基元;2个蛋白不含信号肽或跨膜域,预测均定位在叶绿体。2个基因与植物F家族ABC转运蛋白基因相似性高达80%以上,与玉米和水稻等单子叶植物F家族ABC转运蛋白基因亲缘关系较近。DoABCF1和DoABCF2基因转录本在石斛3个器官中差异表达且均在叶中高度表达,茎和根中相对表达量差异不显著;以茎为校正样本,前者在根中相对表达量为茎中的1.74倍,后者在叶中表达量为茎中的3.44倍。结论成功获得DoABCF1和DoABCF2基因全长cDNA,二者在铁皮石斛叶中的高表达特征暗示其可能在铁皮石斛生长发育过程中起一定作用。     

铁皮石斛蛋白磷酸酶2A基因的分子克隆研究

目的克隆铁皮石斛蛋白磷酸酶(protein phosphatase)2A基因,进行生物信息及表达特征分析。方法运用RACE克隆基因,生物信息学软件进行核酸及蛋白质理化性质、保守结构域、亚细胞定位等分析;用DNAStar 7.0、MEGA 6.0分别进行蛋白序列比对和进化分析。借助定量PCR检测基因表达模式。结果 Do PP2A(Gen Bank注册号KT957552)c DNA 1 410 bp,与其他植物PP2A同源性为89%~94%。ORF编码一条由306个氨基酸组成的肽链,分子量35.19 k D,等电点4.79。推导蛋白含有金属依赖性磷酸酶保守结构域,蛋白不含信号肽或跨膜残基,定位于细胞质。Do PP2A与其他植物的PP2A相比具有高度的保守性,聚在PP2A分子进化树的A组。基因转录本在石斛根和茎中分别为叶中的4.41倍和1.45倍。结论 Do PP2A分子克隆及特征为研究其在铁皮石斛生长发育中的分子功能提供基础。     

铁皮石斛蔗糖转运蛋白基因的分离和表达分析

目的分离珍稀濒危药用植物铁皮石斛蔗糖转运蛋白(sucrose transporter,SUT)基因(DoSUT1)并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR和RACE技术获基因全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时定量PCR检测基因表达模式。结果分离到DoSUT1(GenBank注册号KF876842),cDNA全长1920bp,编码一条由538个氨基酸组成的多肽,相对分子质量57 400,等电点9.61;DoSUT1蛋白含12个跨膜域,具有高等植物蔗糖/H~+共转运家族和协助扩散超家族的保守结构域(60-524、63-531);DoSUT1与多种植物SUT基因编码蛋白有较高的一致性,与玉米、大麦等单子叶植物SUT亚家族中的SUT4聚类在一起;DoSUT1基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛叶和茎中表达量较高,分别为根中的2.783和2.150倍。结论 DoSUT1基因的分子特征为进一步研究其在铁皮石斛糖代谢调控中的作用奠定基础。     

铁皮石斛类受体激酶DoRLK的基因克隆和分子特征

目的 克隆铁皮石斛Dendrobium officinale类受体激酶（receptor-like kinase,RLK）基因,命名为DoRLK（GenBank注册号ANC68272.1）。方法 采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和RACE技术获取基因全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和亚细胞定位等分子特性;用软件DNASTAR 6.0和MEGA 7.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助定量PCR检测基因表达模式。结果 DoRLK基因cDNA全长1 715 bp,编码1条由423个氨基酸组成的多肽,相对分子质量47 800.88,等电点为9.47。DoRLK蛋白包含RLK蛋白家族的1个蛋白激酶结构域（85~370）和一个跨膜基序（250~270）。DoRLK基因与多种植物RLK基因相似性很高（43.62%~63.35%）,与小兰屿蝴蝶兰、海枣、芦笋等植物亲缘关系较近。DoRLK基因具有组织表达特异性,其转录本在石斛根中表达量较高,分别为叶和茎中的2.22、2.75倍。结论 DoRLK基因的分子鉴定为进一步揭示RLK在铁皮石斛与环境互作中的功能奠定基础。     

铁皮石斛丙酮酸激酶基因的克隆与表达分析

目的 克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛丙酮酸激酶（pyruvate kinase,PK）基因（DoPK）,并进行生物信息学分析以及检测基因在不同器官中的表达情况。方法 采用RACE技术获得基因的全长cDNA;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助r实时荧光 (real-time quantitative) PCR (RT-qPCR)分析基因在不同器官中的表达情况。结果 克隆获得DoPK（GenBank注册号KC178572）的cDNA全长1 895 bp,编码一条由511个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为55 040,等电点7.00;DoPK基因与江南卷柏、拟南芥、马铃薯和葡萄等植物的PK基因有71%、86%、89%和91%的相似性;DoPK蛋白包含保守的丙酮酸激酶结构域（21～497）和活性位点（235～247）;DoPK属于胞质型的CYTOSOLIC-1亚类,与单子叶植物亲缘关系较近;DoPK基因为组成型表达,其转录本在石斛茎中的相对表达量较高,为叶中的2.29倍,根中次之,为叶中的1.28倍。结论 克隆了胞质型的铁皮石斛DoPK基因的全长cDNA序列,为进一步研究其在铁皮石斛生长发育中的作用奠定基础。     

铁皮石斛赤霉素3-氧化酶基因的克隆及表达分析

目的克隆珍稀濒危药用植物铁皮石斛Dendrobium officinale赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases,GA3ox)基因(Do GA3ox),并进行生物信息学和表达分析。方法采用RACE和RT-PCR技术获得Do GA3ox基因c DNA全长;利用生物信息学软件预测其编码蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特性;用DNASTAR 7.0和MEGA 6.0软件分别对其进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测基因表达模式。结果克隆到Do GA3ox基因(Gen Bank注册号KT597694),c DNA全长1 318 bp,编码一条由353个氨基酸组成的多肽,相对分子质量为39 052.5,等电点6.21;Do GA3ox蛋白不含跨膜域和信号肽,具有GA3ox的保守结构域DIOX_N(40~130)和2OG-Fe II_Oxy(197~299);Do GA3ox与大葱、油棕、海枣、野茶树及蓝猪耳GA3ox蛋白一致性分别为55%、56%、54%、51%、50%,与单子叶植物大葱、油棕和海枣的亲缘关系较近。q RT-PCR实验结果显示Do GA3ox基因在铁皮石斛种子共生(非共生)萌发1~3级时,其相对表达量呈现出先升高后降低再升高的趋势,分别为未萌发种子的13.44(5.21)、7.28(2.32)和9.40(6.21)倍,由此可知,该基因在共生萌发种子中的表达量高于非共生萌发种子。结论首次克隆得到1个Do GA3ox基因的全长c DNA,其转录本在共生和非共生不同萌发级别种子中的表达特性说明该基因在铁皮石斛种子萌发中起着重要调控作用。     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

铁皮石斛镁离子转运蛋白基因的克隆及表达分析

目的 克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛镁离子转运蛋白(magnesium transporter,MGT)基因(DoMGT1)并进行生物信息学和表达分析.方法 采用RT-PCR和RACE技术,获得基因cDNA全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域及亚细胞定位等分子特征;用DNASTAR 6.0和MEGA 4.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;借助实时定量PCR(qPCR)检测基因表达模式.结果 克隆到DoMGT1(GenBank注册号KJ995532),cDNA全长1 625 bp,编码一条由425个氨基酸组成的肽链,相对分子质量47 400,等电点4.79;DoMGT1蛋白含有CorA家族镁离子转运蛋白保守结构域(313～420)和镁离子转运蛋白MRS2/LPE10保守域(27～420);DoMGT1与多种植物MGTs基因一致性为46%～63%,编码蛋白与水稻OsMGTD、OsMGTE、OsMGTF等聚在一起,与AtMGT4共同构成植物MGTs基因的一大类群;DoMGT1基因转录本在石斛根、茎、叶器官中为组成型表达,叶中相对表达量较高,为根中的3.46倍;茎次之,为根的1.54倍.结论 成功克隆到一个镁离子转运蛋白基因DoMGT1,其转录本在叶中高的表达特征暗示该基因可能在铁皮石斛叶的生长发育中发挥重要作用.     

铁皮石斛HDS基因的克隆与初步表达分析

目的从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆4-羟基-3-甲基-2-E-丁烯基-1-焦磷酸合成酶(4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase,HDS)基因,在大肠杆菌中诱导融合蛋白,并探究该基因在铁皮石斛不同组织中的表达规律。方法采用RT-PCR和RACE等方法获取铁皮石斛HDS(Do HDS)的c DNA全长,利用相关软件和在线网站进行生物信息学分析,使用Real-Time PCR分析Do HDS在不同组织的表达特征,构建原核表达载体p ET-28a(+)-Do HDS,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果成功获得Do HDS的c DNA全长序列,Gen Bank登录号为KJ161312,全长2 666 bp,ORF为2 238 bp,编码745个氨基酸。Do HDS在各组织中均有表达,在茎中表达量最高,为原球茎的5倍;SDS-PAGE结果显示诱导产物为1个相对分子质量(82 700)与理论值相符的融合蛋白。结论克隆了Do HDS的c DNA全长序列,探究其在不同组织中的表达模式,建立了原核表达体系,为后续研究Do HDS的功能提供了一定的理论基础。     

山茱萸CoDXR基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸关键酶基因1-脱氧-D-核酮糖5-磷酸还原酶(CoDXR)的全长cDNA序列,为山茱萸的进一步研究提供依据。方法以本实验室获得的山茱萸转录组数据中的转录本序列c147202_g1为模板,通过Primer Premier 5.0设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆CoDXR基因的全长cDNA序列,并通过相关的生物信息学软件对其进行相关的生物信息学分析和功能预测。结果 CoDXR基因长度为1 505 bp,ORF长度是729 bp,编码242个氨基酸。而通过SignalP4.0Server和HMMTOP对CoDXR蛋白预测分析结果可知,该蛋白不具有信号肽和跨膜区,为疏水性蛋白。系统进化树分析结果表明CoDXR蛋白与野茶树(Camelliasinensis)的DXR蛋白序列相似性最高。结论在山茱萸果实和叶片转录组测序的基础上成功克隆了山茱萸萜类合成途径中的关键酶基因CoDXR,对其进行相关的生物信息学分析,为深入研究CoDXR基因在山茱萸萜类合成途径中的功能奠定了基础。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

山茱萸萜类合成途径关键酶HMGR1基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸Cornus officinalis HMGR1的cDNA序列并进行生物信息学分析。方法以山茱萸转录组数据中unigenec100572_g1序列为参考,在其开放阅读框两端设计特异引物,经实时荧光定量PCR(RT-PCR)扩增、连接pTOPO-T载体克隆并测序,获得CoHMGR1基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行相关分析。结果 CoHMGR1基因长2 116 bp,含长度为1 338 bp的完整开放阅读框(ORF),编码445个氨基酸,为疏水性蛋白。多序列比对和亲缘关系分析显示,CoHMGR1基因编码的氨基酸序列与喜树的序列相似性较高,达79.56%。结论首次对山茱萸叶片和果实进行比较转录组测序的基础上,成功克隆并分析了CoHMGR1基因,为进一步研究CoHMGR1蛋白的功能及山茱萸萜类合成途径的分子机制奠定基础。