灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬苯丙氨酸解氨酶(LmPAL1)基因全长序列,并进行生物信息学和表达模式分析。方法提取灰毡毛忍冬花总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术克隆LmPAL1基因的全长cDNA序列;运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用qRT-PCR测定灰毡毛忍冬茎、叶和不同花期花中该基因的相对表达量。结果克隆的LmPAL1基因开放阅读框(ORF)长度为2 145 bp,编码714个氨基酸,生物信息学分析预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,包含PAL shielding结构域(527～641 aa),并且含有PAL/HAL活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG(196～212aa),与其他LmPAL1具有较高的相似度;LmPAL1基因q RT-PCR结果显示,7个花期材料以金黄色开花期相对表达量较高;与茎、叶比,白色花蕾期花的相对表达量最高,叶的最低。结论成功克隆了LmPAL1基因,为进一步研究该基因的功能以及遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定基础,同时为探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据。     

不同品种灰毡毛忍冬ACS3基因克隆、表达及生物信息学分析

目的分别克隆灰毡毛忍冬野生型与湘蕾型ACS3基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法筛选灰毡毛忍冬转录组数据库中与ACS蛋白同源性较高的Unigene序列,设计引物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RACE技术对该Unigene进行全长克隆;用生物信息学软件分析蛋白的理化性质、结构域和同源性等特性;借助qRT-PCR检测1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS3)基因在不同品种、不同花期灰毡毛忍冬中表达模式。结果从灰毡毛忍冬野生品种及湘蕾品种中分别克隆得Lm-ACS3(GenBank:MH724196)及Lm-XL-ACS3(GenBank:MH724197),开放阅读框长度均为1452bp,编码483个氨基酸,包含保守的Aminotran_1_2结构域,与其他植物的ACC合酶具较高相似度;qRT-PCR结果显示,野生型ACS3基因不同花期间表达差异显著,从花期3开始呈整体明显上升趋势,湘蕾型中花期间表达差异相对较小。结论分别克隆得到灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型ACS3基因,该基因在2品种中具不同表达模式;推测ACS3基因或为导致灰毡毛忍冬不同品种间差异表型的可能功能基因之一,为进一步验证该基因在调控蕾期长短及花表型的生物学功能提供实验基础。     

灰毡毛忍冬CHI和CHS基因的克隆及功能研究北大核心CSCD

该研究基于灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种转录组数据,筛选到黄酮生物合成关键限速酶基因CHI和CHS的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过在线生物信息学分析软件和qRT-PCR分析编码蛋白特性和不同花期、不同部位下CHI、CHS基因的表达模式,HPLC测定木犀草苷含量并结合表达量做相关性分析。结果显示,灰毡毛忍冬2个品种中CHI、CHS基因,分别包含627、1170 bp的ORF区,且CHI蛋白和CHS蛋白均为稳定、带亲水性的非分泌型蛋白。qRT-PCR结果表明2个品种CHI、CHS基因在不同花发育阶段及茎、叶中均有差异表达,且在关键花期表达差异明显,结合HPLC数据,木犀草苷含量与基因相对表达量之间呈现负相关性。推测灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因参与调控黄酮化合物的累积,可进一步进行其功能研究。该研究首次克隆了灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因并进行表达分析,丰富了灰毡毛忍冬黄酮生物合成研究,为进一步探究灰毡毛忍冬中木犀草苷等黄酮类成分差异的分子机制以及良种选育提供研究基础。     

灰毡毛忍冬LmC3H1基因的克隆及表达模式与绿原酸含量相关性分析

目的:以灰毡毛忍冬为材料,克隆对-香豆酸3-羟化酶(LmC3H1)基因,进行生物信息学和表达模式分析,结合绿原酸含量,研究推测灰毡毛忍冬LmC3H1基因的功能。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术克隆LmC3H1基因的全长c DNA序列,对该序列进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和HPLC分别测定灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花中LmC3H1的相对表达量及绿原酸含量。结果:克隆得LmC3H1(Gen Bank:MN177695)基因,开放阅读框(ORF)长度为1 533 bp,编码510个氨基酸,推测其分子式为C_(2618)H_(4134)N_(718)O_(727)S_(22),相对分子质量为58 005.32,等电点8.92,为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,具有跨膜区域LLLIPAVLFLISLVYPLI,含有细胞色素P450的保守结构域CYTOCHROME_P450(422-433 aa);Real-time PCR结果显示,LmC3H1在灰毡毛忍冬茎、叶及不同花期花有不同程度的表达,其中在花发育阶段,白色花蕾期相对表达量最高,花蕾初期及白色开花期次之;白色花蕾期花与茎、叶比,花的相对表达量最高,叶的最低;HPLC结果显示,从绿白色花蕾期到金黄色开花期绿原酸含量呈上升趋势,金黄色开花期含量最高,不同器官中,花中绿原酸最高,茎最低。结论:克隆得到灰毡毛忍冬LmC3H1基因,推测LmC3H1可能参与灰毡毛忍冬花绿原酸的生物合成。该研究为进一步研究该基因的功能及探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据,同时为遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定了基础。     

灰毡毛忍冬内参基因筛选和Mads-box家族基因AGL15的时空表达分析

目的筛选灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides基因表达分析的内参基因,研究其Mads-box基因家族AGL15基因(Lm AGL15)的时空表达特性。方法克隆灰毡毛忍冬内参基因18 S r RNA、Ubiquilin、Actin和Efl-β的基因片段,评价了4个基因在不同部位叶、茎和花蕾,以及4个基因在灰毡毛忍冬生长不同时期的稳定性,筛选内参基因,分析Lm AGL15基因的时空表达特性。结果 18 S r RNA表达最稳定,适宜作为内参基因,叶片、茎的Lm AGL15基因相对表达量较低,花蕾相对表达量较高。花蕾不同发育时期,Lm AGL15的相对表达量呈现逐渐降低的变化,20 d后Lm AGL15的相对表达量最低,然后依次是花蕾初期(15 d)、青绿色花蕾期(10 d)、绿白色花蕾期(5 d)。结论 18 S r RNA是适宜的内参基因。叶片、茎和花蕾中,Lm AGL15的相对表达量差异明显。花蕾发育不同时期,Lm AGL15的相对表达量呈逐渐降低的变化,与花蕾开放变化规律相似。     

灰毡毛忍冬MYB转录因子家族成员的挖掘及鉴定

MYB转录因子作为最大的转录因子家族之一,在调控花发育过程中起到重要作用。该文首次从灰毡毛忍冬转录组数据中鉴定出3条1R-MYB,47条R2R3-MYB,2条3R-MYB和1条4R-MYB转录因子,对其理化性质、保守结构域、家族进化关系及蛋白结构、功能信息及表达进行分析。结果表明,不同品种灰毡毛忍冬中53个MYB转录因子家族成员基因在保守基序、蛋白理化性质及结构、功能等各有不同,表明其在进化中具有保守性和多样性。表达分析表明LmMYB在品种间(野生型、湘蕾型)及器官间(花、叶)均存在转录水平上的显著差异,且部分基因特殊表达。在53条LmMYB中有43条在花、叶中均有表达,其中9个LmMYB成员在2个品种灰毡毛忍冬中在转录水平上存在显著差异,且在野生品种中上调表达。结合家族进化分析和表达分析推测LmMYB蛋白主要在生长发育、逆境胁迫、类黄酮次生代谢等方面发挥重要转录因子调控功能。该研究结果为后续研究灰毡毛忍冬MYB转录因子家族具体功能机制提供了理论基础和参考依据。     

蜘蛛香GES基因的克隆与生物信息学及基因表达分析

目的克隆蜘蛛香香叶基合酶(Geraniol synthase,GES)基因,并对其进行生物信息学和基因表达量分析。方法在已测得蜘蛛香转录组数据的基础上,设计全长特异引物,克隆出GES基因全长,运用生物信息学进行基因序列同源性分析,并对编码蛋白进行各种理化性质分析。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测该基因在蜘蛛香不同部位的相对表达量,并利用茉莉酸甲酯(MeJA)处理种植的蜘蛛香植株后,分时间取成熟叶片进行诱导表达分析。结果从蜘蛛香中克隆得到了长度为1779bp的GES基因(VjGES)完整开放阅读框(ORF)的cDNA序列,编码592个氨基酸,与同一科属的缬草相似性最高达99%。VjGES编码的蛋白相对分子质量是67.23 kDa,理论等电点为5.15,此蛋白不存在跨膜区域。qRT-PCR检测结果表明,VjGES基因在根茎中表达量最高,其次是在成熟叶中表达量较高,在新生叶中表达量最低;VjGES对MeJA的诱导比较敏感,MeJA诱导后处理48h后基因的表达水平达到最高。结论成功从蜘蛛香植株中克隆到可能参与环烯醚萜生物合成途径中的关键酶GES基因。     

山银花（灰毡毛忍冬）适宜采收期研究

为了确定山银花（灰毡毛忍冬）的适宜采收期,测定不同发育时期的花蕾外观形态、产量和质量,比较一日内不同时段采摘花蕾的质量。结果表明,开花型和花蕾型灰毡毛忍冬不同发育阶段的花蕾外观形态具有较大的差异;随着花蕾发育,产量逐渐增加;开花型灰毡毛忍冬花蕾开放后（银花期、金花期）绿原酸含量极显著降低,开花前（幼蕾期、青色期、大白期）质量无显著差异;花蕾型灰毡毛忍冬黄白期灰毡毛忍冬皂苷乙显著降低,幼蕾期和青白期质量无显著差异。一日内不同时段采摘的灰毡毛忍冬绿原酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸含量有显著差异。开花型灰毡毛忍冬的适宜采收期为大白期,采摘时段为10：00以前和18：00以后,花蕾型灰毡毛忍冬的适宜采收期为青白期,采摘时段为8：00以前和18：00以后。     

蜘蛛香香叶醇-10-羟化酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆蜘蛛香香叶醇-10-羟化酶(geraniol-10-hydroxylase,G10H)基因,并对其进行生物信息学和基因表达量分析。方法:在已测得蜘蛛香转录组数据的基础上,设计全长特异引物,克隆出G10H基因全长,运用生物信息学进行基因序列同源性分析,并对编码蛋白进行各种理化性质分析。运用实时荧光定量PCR检测该基因在蜘蛛香不同部位的相对表达量,并利用茉莉酸甲酯处理蜘蛛香植株后,分时间取成熟叶片进行诱导表达分析。结果:从蜘蛛香中克隆得到了长度为1 500 bp的G10H基因(VjG10H)完整开放阅读框的cDNA序列,编码499个氨基酸。VjG10H编码的蛋白相对分子质量是55.92 kDa,理论等电点为7.61。实时荧光定量PCR检测结果表明,VjG10H基因在成熟叶中表达量最高,其次是根茎中,在新生叶中表达量最低;VjG10H对茉莉酸甲酯的诱导表现出敏感,茉莉酸甲酯诱导处理48 h后基因的表达水平达到最高。结论:成功从蜘蛛香植株中克隆得到可能参与环烯醚萜生物合成途径中的关键酶G10H基因。     

红花查尔酮合成酶基因的克隆、生物信息学分析及表达

目的克隆红花查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,CHS),运用生物信息学分析CHS,比较花期中每天CHS的表达,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。方法从新鲜红花花冠中提取RNA,反转录为cDNA,设计特异性引物,克隆获得CHS。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA5.1构建CHS与相关物种CHS的系统进化树,利用real-time PCR分析花期中每天红花CHS的表达量,并进行分析和比较。结果克隆获得的红花CHS,序列全长为1 149 bp,具有1 041 bp的完整开放阅读框,编码346个氨基酸。将该蛋白通过NCBI上的Blastp比对发现,该蛋白属于CHS家族,比对结果显示红花CHS与100余种NCBI上登录的植物有相似性,其中与水飞蓟、翠菊、菊花、红凤菜的相似性分别达95%、95%、94%、94%。将相似性在90%以上的物种用MEGA5.1构建进化树,结果显示红花CHS与水飞蓟CHS亲缘关系最近。通过ProtParam预测红花CHS蛋白分子式为C1678H2693N451O493S20,相对分子质量为37 700,等电点为6.10,负电荷的氨基酸残基数(Asp+Glu)为42,正电荷的氨基酸残基数(Arg+Lys)为38。基因表达分析结果表明红花CHS在花期第3天的相对表达量最高,远远高于花期其余时间。结论成功克隆、分析并表达了红花CHS,为红花有效成分合成及调控机制研究提供基础。     

红白忍冬SABATH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析

目的: 克隆红白忍冬SABATH甲基转移酶基因(rLjSABATHMT),比较忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶同源基因表达量和基因内含子序列的差异,为金银花的活性成分形成及调控机制研究提供基础。方法: 根据cDNA文库提供的基因片段设计特异性引物,从红白忍冬中克隆获得rLjSABATHMT基因cDNA序列及基因组序列。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA 5.0构建SABATH甲基转移酶系统进化树,利用RT-PCR分析SABATHMT同源基因在忍冬与红白忍冬的不同器官、不同花期的表达量,对忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列进行分析和比较。结果: 克隆获得的rLjSABATHMT基因cDNA序列全长为1 251 bp,具有完整编码框,编码365个氨基酸。该基因蛋白序列具有保守的SABATHMT结构域,系统进化树结果表明它可能是水杨酸/安息酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明SABATHMT同源基因主要在花中表达。忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列具有丰富的多态性,且有2个SNP为红白忍冬的特有基因型;内含子区motif元件中碱基变异在2个同源基因间具有显著差异。结论: SABATHMT同源基因内含子区变异可能导致了忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶表达差异,为金银花活性成分调控机制研究提供了重要研究基础。     

刺五加环阿屯醇合酶基因的克隆及其表达分析

目的克隆刺五加的环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析。方法采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends,RACE)技术克隆刺五加CAS基因的全长cDNA序列。运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能,并通过RT-PCR法检测CAS在不同生长发育时期和不同器官中的表达情况。结果刺五加CAS基因的cDNA全长为2 758 bp,开放阅读框长2 277 bp,编码758个氨基酸的蛋白,包含三萜合成酶的标志性序列。CAS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中。RT-PCR的结果显示,刺五加CAS基因在各时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P<0.05)。其中果实基本成熟期的表达量最高,是最低量萌芽期的1.56倍,各器官中,叶片的表达量最高,是最低量叶柄的1.37倍。结论首次分离并报道了刺五加的CAS cDNA克隆,并证实其在不同生长发育时期和不同器官中的表达量不同,为进一步研究CAS对刺五加皂苷量的影响和表达调控奠定基础。     

基于代谢组学及转录组学研究灰毡毛忍冬不同品种黄酮类成分差异积累的转录调控机制

为探究湘蕾型和野生型灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的分子调控机制,该研究以灰毡毛忍冬2个品种花、茎和叶为材料,采用超高效液相色谱-质谱联用(UPLC-MS)技术和高通量转录组测序(RNA-seq)技术进行代谢组学和转录组学联合分析,筛选黄酮类差异代谢物、关键差异表达基因及相应转录因子,并随机挑选其中14条差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果表明,代谢组学分析共筛选出黄酮类化合物生物合成相关途径差异代谢物17个,包括柚皮苷查尔酮、芹菜素、槲皮苷等;转录组学分析共筛选出黄酮类化合物生物合成相关途径差异表达基因19条,包括2条CHS、3条CHI等;调控网络分析和加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选出调节黄酮类成分积累的关键酶基因CHS1、FLS1和HCT;同时发现MYB12和LBD4这2个转录因子可能通过调控关键酶基因CHS1、FLS1和HCT的表达来调控黄酮类成分的生物合成;qRT-PCR结果显示,随机选取的14个差异表达基因的表达模式与RNA-seq结果基本一致。该研究初步解析了2个品种灰毡毛忍冬黄酮类成分差异积累的转录调控机制,为进一步阐明其中关键酶基因及相应转录因子对灰毡毛忍冬...     

蚜虫危害对灰毡毛忍冬药材产量和质量的影响

目的:探讨蚜虫危害对灰毡毛忍冬药材产量和质量的影响。方法:测定同一植株上蚜虫不同危害等级的花枝鲜花和干花的产量,采用HPLC-ELSD法,分别测定蚜虫不同危害等级的花蕾中绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、3,5-二咖啡酰奎宁酸、川续断皂苷乙和灰毡毛忍冬皂苷乙6种有效成分的含量。结果:蚜虫危害显著影响灰毡毛忍冬的产量,极显著影响木犀草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的含量(P0.01),显著影响绿原酸的含量(P0.05),对咖啡酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸含量无显著影响。结论:灰毡毛忍冬GAP生产中应规范蚜虫的防治。     

湖南3个产地灰毡毛忍冬花蕾的挥发油成分分析

目的:比较湖南省3种不同来源的灰毡毛忍冬花蕾中挥发油成分.方法:采用气相色谱-质谱法(GC-MS)研究湖南金银花主流品种灰毡毛忍冬花蕾中挥发油的化学成分.结果与结论:3种不同来源的灰毡毛忍冬花蕾中的挥发油均含有芳樟醇(Linalool)、香叶醇(Geraniol)、α-松油醇(α-Terpineol)、辛烯醇(1-Octen-3oL)、二十一烷醇(3-Henen-1-oL)等26个相同成分,其中芳樟醇的百分含量最高,在隆回、溆浦、新宁产灰毡毛忍冬花蕾中所占相对含量分别为15.77%、28.85%、31.88%.     

灰毡毛忍冬与忍冬的主要药效学比较研究

目的 研究灰毡毛忍冬的主要药效,并与忍冬相关药效进行比较.方法 通过测定灰毡毛忍冬的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),研究其对6种常见致病菌的抗菌作用;采用醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加、二甲苯致小鼠耳廓肿胀、角叉菜胶致大鼠足肿胀和大鼠棉球植入致肉芽肿等实验,研究其抗炎作用;采用酵母粉致热大鼠模型,研究其解热作用;通过测定大鼠白细胞数和免疫低下小鼠免疫器官质量及碳粒廓清实验,研究其免疫作用,并与忍冬进行比较.结果 灰毡毛忍冬对6种常见致病菌具有显著的抑菌和杀菌作用,MIC为7.8～62.8 mg/mL,MBC≥250 mg/mL;灰毡毛忍冬(10 g/kg)能显著降低小鼠腹腔毛细血管通透性、大鼠足肿胀度和减少肉芽组织的增生,有抑制小鼠耳肿胀和降低发热大鼠体温的趋势,显著提高小鼠脏器指数、廓清指数(K)、吞噬指数(α),有增加大鼠白细胞数的趋势.灰毡毛忍冬与忍冬的上述药效学指标无显著差异.结论 灰毡毛忍冬具有抗菌、抗炎作用和解热的趋势,能增强动物非特异性免疫功能,作用强度与忍冬相当.     

灰毡毛忍冬的藤茎扦插育苗栽培方法

灰毡毛忍冬的藤茎扦插育苗栽培方法田谨为,王桂英(四川省中医药研究院药物种植研究所南川648408)灰毡毛忍冬LoniceramacranthoidesHand-mass.又名拟大花忍冬、大叶金银花,是金银花的高产优质良种,野生于海拔600～1500m的中性至微酸性土壤的地区,植株立地生长,高达1m左右,呈披撒站立株形,枝叶繁茂,着花丰盛,在金银花中独具特色,有较好的开发前景。经多年试验,总结出人工育苗栽培方法。1扦插育苗1.1选择扦插藤茎灰毡毛忍冬1年萌发....     

刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、 生物信息学及表达分析

目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达最具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.