菟丝子提取物对肾阳虚大鼠睾丸P450arom、CYP19表达及性激素和精子的影响

目的:观察菟丝子提取物作用于腺嘌呤诱导的肾阳虚不育大鼠睾丸中P450arom、CYP19的表达、激素含量及精子数量的变化,探讨肾虚引起的雄性不育的病理机制及菟丝子提取物的作用。方法:30只雄性大鼠随机分为3组:正常对照组、模型组、治疗组,每组10只。用腺嘌呤150mg/(kg.d),分别给模型组及治疗组大鼠灌胃30天,诱导肾阳虚不育模型。诱导模型成功后,模型组用生理盐水灌胃30天;用菟丝子提取物200mg/(kg.d)给治疗组灌胃30天;用免疫组化法和Western-blot检测P450arom及CYP19在大鼠睾丸中的表达;用扫描电镜及透射电镜观察曲细精管中精子数量的变化;精子自动检测仪扫描观察精子的密度;放射免疫的方法检测FSH、LH、T、E2含量。结果:CYP19在大鼠睾丸的间质细胞、长形精子细胞中均有表达,其免疫阳性物质位于间质细胞质和长形精子细胞的头、尾部;P450arom表达于睾丸间质细胞的细胞质中。模型组大鼠睾丸CYP19、P450arom则明显低于正常对照组(P<0.05),治疗组CYP19、P450arom的表达明显高于模型组(P<0.05),正常对照组与治疗组之间无显著差异(P>0.05);正常对照组及治疗组曲细精管中的精子数量及FSH、LH、T和E2的含量明显高于模型组,正常对照组与治疗组之间无显著差异(P>0.05)。结论:P450arom及CYP19在睾丸表达的异常可能与肾虚引起的雄性大鼠不育有关,菟丝子提取物能够增加肾虚大鼠睾丸中P450arom、CYP19的表达,提高精子的数量及FSH、T、E2含量,为进一步探讨P450arom及CYP19在雄性肾虚不育模型大鼠精子生成和成熟中的作用及菟丝子提取物的作用机制提供了实验依据。     

089 银杏提取物EGb 761对大鼠肝细胞色素P450及对大鼠和人类固醇代谢和排泄的影响

一些对大鼠的体内、体外试验显示，服用银杏提取物可能影响肝的异生物体代谢和引起药物相互作用，而在人体试验未获得该提取物能调节细胞色素P450（CYP450）酶活性的证据。     

菟丝子、骨碎补提取物体外对酪氨酸酶活性的影响

[目的]考察菟丝子、骨碎补提取物体外对酪氨酸酶活性的影响。[方法]采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法检测菟丝子、骨碎补对酪氨酸酶的激活率。[结果]菟丝子、骨碎补提取物对酪氨酸酶活性具有激活作用。[结论]菟丝子、骨碎补提取物能够激活酪氨酸酶活性,为其外用治疗白癜风提供了药学依据。     

注射用盐酸头孢他美对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响

目的 研究注射用盐酸头孢他美对大鼠肝微粒体细胞色素P450(CYP450)酶系CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响。方法 将SD大鼠分成盐酸头孢他美给药组和生理盐水空白组,每组6只,雌雄各半,给药组尾静脉注射盐酸头孢他美50 mg/(kg·d),连续给药7 d,每天2次。HPLC法同时测定CYP450的3种同工酶特异性探针底物在SD大鼠肝微粒体内代谢产物生成量和原型探针底物降解量,判断酶亚型活性变化。分析柱Diamonsil C₁₈ (150 mm×4.6 mm,5 μm),流速1.0 mL/min。CYP1A2代谢样品测定条件为甲醇(0.1%甲酸)(A)-水(0.1%甲酸)(B),0~5 min: 18%A,5~10 min: 18%~60%A,10~15 min: 60%A,检测波长为247 nm;CYP3A4代谢样品测定条件为甲醇(A)-水(0.02%甲酸)(B),0~11 min: 40%~60%A,检测波长为223 nm;CYP2E1代谢样品测定条件为甲醇(A)-水(B),0~10 min: 37%~75%A,检测波长为287 nm。结果 探针底物及其代谢产物在测定浓度范围内线性关系良好(r≥0.999 7),精密度RSD<6％(n=5),提取回收率83.2%～97.5%。SD大鼠连续注射给予盐酸头孢他美后,CYP3A4的活性与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),可能存在诱导作用;CYP1A2和CYP2E1的活性与对照组比较差异无统计学意义 (P>0.05)。结论 静注给予盐酸头孢他美能诱导SD大鼠肝微粒体CYP3A4,对CYP1A2和CYP2E1没有诱导或抑制作用。提示经CYP3A4 代谢的药物在临床上与注射用盐酸头孢他美合用时,可能存在潜在药物-药物相互作用。     

菟丝子水煎液对大鼠肝微粒体细胞色素P450亚型酶活性的影响

目的 观察菟丝子对大鼠肝细胞色素P450酶系统中CYP1A2,2D6以及3A4 3种亚型活性的影响.方法 对照组和实验组大鼠分别经口给予生理盐水和菟丝子水煎液2周,差速离心分离肝微粒体,HPLC法分别测定大鼠肝微粒体中CYP1A2,2D6以及3A4探针药物的代谢率;通过Western blot测定大鼠肝微粒体中CYP1A2,2D6以及3A4蛋白的相对含量.结果 ①实验组探针药物非那西丁代谢率高于对照组(P＜0.05),Western blot分析显示实验组CYP1A2蛋白表达略高于对照组;②实验组探针药物右美沙芬的代谢率明显高于对照组(P＜0.05),CYP2D6蛋白表达亦明显高手对照组;③两组间探针药物咪哒唑仑代谢率及CYP3A4蛋白表达无明显差异.结论 中药菟丝子水煎液可诱导大鼠肝微粒体中的CYP2D6和CYP1A2,而对CYP3A4无影响.     

左归饮对围绝经期大鼠卵巢P450芳香化酶表达的影响及调节

目的研究左归饮对围绝经期大鼠卵巢P450芳香化酶(P450 arom)及CYP19 mRNA表达的影响及机制。方法采用围绝经期大鼠动物模型,分别给予低、中、高剂量左归饮灌胃处理8周。用放射免疫法(RIA)检测血清中雌二醇(E_2)含量;用RT-PCR和免疫组化法检测卵巢CYP19mRNA及P450 arom的表达。未成年大鼠注射孕马血清后收集培养颗粒细胞,用RT-PCR方法检测给予不同处理后CYP19 mRNA的表达水平。结果围绝经期大鼠血清E_2水平及卵巢P450 arom及其基因CYP19的表达明显低于青年组(P0.01),给予中、高剂量左归饮处理后,血清E_2水平及P450 arom、CYP19表达显著升高(P0.01)。培养颗粒细胞给予不同处理因素,结果显示,与对照组相比,染料木黄酮(Genistein)、福司考林(Forskolin)、左归饮提取物可促进CYP19 mRNA表达(P0.05);与单纯加入左归饮提取物相比,同时加入左归饮提取物和佛波酯或Genistein可进一步促进CYP19 mRNA的表达(P0.05)。结论中、高剂量左归饮可通过上调卵巢CYP19及其产物P450 arom的表达,使围绝经期大鼠血清E_2含量升高。左归饮对CYP19 mRNA表达的促进作用可能是通过激活PKC途径或加强Genistein的作用实现的。     

小柴胡汤对大鼠子宫内膜异位症COX-2、P450arom表达的影响

目的探讨小柴胡汤对大鼠子宫内膜异位症(内异症)的治疗作用及其机制。方法建立大鼠内异症动物模型,随机分为空白对照组、模型对照组、小柴胡汤组、丹那唑组、联合用药组(小柴胡汤+丹那唑),利用免疫组化方法,观察分析各组大鼠在位、异位内膜中COX-2、P450 arom的表达水平。结果 COX-2、P450 arom在正常子宫内膜无表达,而在内异症内膜有强表达;小柴胡汤组和联合用药组COX-2、P450 arom的表达水平明显低于模型对照组(P<0.05);而西药丹那唑组COX-2的表达水平无明显变化,但P450 arom的表达明显低于模型组(P<0.01)。结论小柴胡汤可能通过下调异位内膜COX-2、P450 arom的表达,抑制局部雌激素的产生而达到治疗目的。     

黄芩苷对Chang Liver细胞CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19表达的影响

目的 在Chang Liver细胞中观察黄芩苷处理对CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19表达的影响.方法 在Chang Liver细胞中分别加入DMSO 0.1% (v/v) (溶剂对照) 和不同浓度的黄芩苷 (0.01、0.1和1 μM) 24、36和48h后,用半定量RT-PCR的方法分别检测CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19表达量的改变.结果 用不同浓度黄芩苷分别处理Chang Liver细胞24和36 h,CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19的表达均呈现出增强的趋势;但是黄芩苷处理48 h后各浓度对CYP3A4和CYP2C9的表达产生显著的抑制效应 (P<0.01) . 结论黄芩苷对细胞中CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19的表达具有影响作用,这种影响作用随药物处理时间不同而表现出双向效应.     

n-6/n-3多不饱和脂肪酸对乳腺癌大鼠乳腺癌组织CYP17和CYP19表达的影响

目的 探讨不同n-6/n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)膳食构成比对MNU诱导的乳腺癌大鼠血清雌二醇水平及乳腺组织CYP17、CYP19 mRNA表达的影响.方法 雌性SD大鼠65只随机分为5组,即n-6 PUFA组、10∶1 n-6/n-3组、5∶1 n-6/n-3组、1∶1 n-6/n-3组和正常对照组,前4组以50 mg/kg MNU单次腹腔注射诱导大鼠乳腺肿瘤发生,正常对照组注射等体积无菌生理盐水.给药后立即分组喂养不同饲料,并在8周和18周时经阴道涂片证实间情期,股动脉取血液并剖取乳腺组织,采用放射免疫法检测血清雌二醇水平,利用RT-PCR技术检测乳腺组织中CYP17、CYP19 mRNA表达状况.结果 4组乳腺癌大鼠血清雌二醇水平及乳腺组织中CYP17、CYP19的表达较正常对照组均有所升高,其中 n-6组最高,其余各组随n-6/n-3值减小而下降,1∶1 n-6/n-3组显著低于n-6组.结论 不同n-6/n-3 PUFA膳食构成比对MNU诱导的乳腺癌大鼠血清雌二醇水平及乳腺组织CYP17、CYP19 mRNA的表达具有不同影响,1∶1 n-6/n-3 PUFA膳食构成比能有效抑制乳腺癌大鼠血清雌二醇水平及乳腺组织CYP17、CYP19 mRNA表达的升高.     

壮骨关节丸对大鼠肝微粒体P450的影响

[目的] 考察壮骨关节丸对大鼠肝微粒体细胞色素P450的影响。[方法] 壮骨关节丸及其两个新工艺按含生药2.1 g/kg连续给大鼠灌胃7 d,末次药后24 h断头处死大鼠并取肝脏,用钙沉降法制备肝微粒体。在体外用含氨苯砜、非那西丁、奥美拉唑、氯唑沙宗的cocktail探针代谢来考察肝微粒体CYP3A、CYP1A2、CYP2C19、 CYP2E1的活性。[结果] cocktail探针在体外肝微粒体系统中代谢1 h后,包括壮骨关节丸及其两个新工艺的给药组剩余氯唑沙宗浓度显著高于对照组,而奥美拉唑、非那西丁、氨苯砜浓度与对照组之间差异无统计学意义。[结论] 壮骨关节丸可以抑制大鼠肝脏CYP2E1活性,但对CYP1A2、CYP3A及CYP2C19无显著影响。     

内异症中芳香化酶的表达与其局部雌激素异常合成的关系

目的 研究卵巢巧克力囊肿异位内膜腺上皮、间质细胞及卵巢内异症的在位内膜中P450芳香化酶蛋白和mRNA表达,探讨其在子宫内膜异位症发病中的作用及其临床意义.方法 采用反转录聚合酶联反应(RT-PCR)和免疫组化技术检测45例卵巢巧克力囊肿的囊壁(巧囊)、32例卵巢内异症的在位内膜和35例正常子宫内膜中P450芳香化酶(P450A)mRNA及蛋白的表达.结果 巧囊壁异位内膜P450A mRNA表达量高于在位内膜(P＜0.01);35例正常子宫内膜中仅有2例表达;免疫组化检测巧囊壁P450A蛋白其表达特征与mRNA一致.结论 子宫内膜异位症异位灶中有P450A表达,这种雌激素的合成酶能在异位灶局部合成异常的雌激素;卵巢内异症的在位内膜有P450A表达,提示在位内膜本身局部有雌激素的合成,其保护机制劣于正常内膜.子宫内膜异位症中P450A的表达在其发病中起到重要作用.     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.     

CYP2C19基因多态性与不同年龄层大动脉粥样硬化型小卒中患者口服氯吡格雷治疗后临床预后的相关性研究

背景　氯吡格雷作为一种经典抗血小板聚集药物已广泛应用于缺血性脑卒中患者的二级预防及治疗中。然而部分患者接受氯吡格雷治疗后仍发生缺血性脑卒中事件。CYP2C19基因多态性被认为与此相关,然而不同年龄患者中该基因多态性是否为脑卒中的独立危险因素尚存争议。目的　探讨CYP2C19基因多态性与不同年龄层大动脉粥样硬化型小卒中患者口服氯吡格雷治疗后临床预后的相关性。方法　选取2015年4月-2018年4月在苏州大学附属第一医院神经内科住院治疗的大动脉粥样硬化型小卒中患者479例作为研究对象,年龄≤60岁169例,年龄>60岁310例。患者均接受氯吡格雷口服治疗为期1年。住院期间收集患者的基线资料,包括年龄、美国国立卫生研究院卒中量表（NIHSS）评分、血糖、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、白细胞计数、糖尿病、高血压、CYP2C19 LOF等位基因、吸烟、饮酒、性别。随访记录患者卒中后三个月卒中复发/死亡的情况,采用改良Rankin量表评分（mRS）评价1年期的临床预后,mRS≤2分为临床预后良好（预后良好组）,mRS>2分为临床预后不良（预后不良组）。根据CYP2C19功能变异型（LOF）等位基因携带状态分为携带组和非携带组。使用同质性检验分析不同年龄层结果异质性,并使用多因素Logistic回归分析不同年龄层中与临床预后相关的潜在预测因子。结果　年龄≤60岁患者：预后良好组与预后不良组NIHSS评分、血糖、LDL、白细胞计数、糖尿病、高血压、CYP2C19 LOF等位基因、吸烟比例比较,差异有统计学意义（P<0.05）;年龄>60岁患者：预后良好组与预后不良组血糖、HDL、LDL、TG、糖尿病、高血压、性别比较,差异有统计学意义（P<0.05）。Breslow-Day检验：CYP2C19 LOF等位基因携带和临床预后的相关性与年龄间存在交互效应（χ2=6.352,P=0.012）,Tarone's检验：CYP2C19 LOF等位基因携带和临床预后的相关性与年龄间存在交互效应（χ2=6.351,P=0.012）。使用二元Logistic回归法分析交互效应大小,结果显示,交互效应的大小比较差异有统计学意义〔P=0.013,OR=3.63,95%CI（1.31,10.07）〕。此外,不同年龄层患者CYP2C19 LOF等位基因与卒中后3个月卒中复发/死亡相关性差异并无异质性（P>0.05）。CYP2C19 LOF等位基因携带患者3个月卒中复发/死亡比例（9.7%）高于非携带患者（3.9%）（P=0.023）。多因素 Logistic回归分析结果显示,年龄≤60岁的患者中,CYP2C19 LOF等位基因、高血压、糖尿病、吸烟、LDL可能是临床预后的独立预测因子（P<0.05）;年龄>60岁的患者中,高血压、糖尿病、饮酒、男性、血糖、HDL可能是临床预后的独立预测因子（P<0.05）。在控制CYP2C19 LOF等位基因、高血压、糖尿病、吸烟、饮酒、性别、NIHSS评分、血糖、TC、TG、LDL、HDL、白细胞计数上述临床混杂因素后,尚不能肯定CYP2C19 LOF是该类研究患者卒中后3个月卒中复发/死亡的独立预测因子（P>0.05）。结论　在接受氯吡格雷治疗的大动脉粥样硬化型小卒中患者中,年轻患者的长期功能预后与CYP2C19 LOF基因的相关性可能较年老患者更强。     

CYP2C19基因多态性影响稳定型冠心病患者氯吡格雷治疗后血小板P2Y12受体信号通路的分子机制

 目的  探讨中国冠心病患者CYP2C19基因多态性影响氯吡格雷疗效的分子机制。方法  入组208例接受冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)的稳定型冠心病(stable coronary artery disease, SCAD)患者,采用PCR产物直接测序的方法对所有纳入对象进行CYP2C19基因多态性分析,血栓弹力图检测300 mg氯吡格雷负荷量24 h后的血小板聚集率,流式细胞仪检测P2Y12受体下游信号分子血管扩张刺激磷蛋白血小板反应性指数(vasodilator-stimulated phosphorylation-platelet reactivity index, VASP-PRI)和Akt磷酸化(P-Akt)水平。结果  208例患者中85例(40.9%)的基因型为CYP2C19*1/*1 (非携带者),无等位基因缺失(loss-of-function, LOF),93例(44.7%)为CYP2C19*1/*2或CYP2C19*1/*3(1个LOF),30例(14.4%)为CYP2C19*2/*2或CYP2C19*2/*3 (2个LOF)。氯吡格雷治疗后的血小板聚集率及VASP-PRI随着携带LOF数目的增加而增加,而P-Akt只在2个LOF的情况下才会明显增加。VASP-PRI与氯吡格雷治疗后血小板聚集率有相关性(r=0.672,P<0.001),但是与P-Akt不相关。结论  携带2个CYP2C19 LOF的SCAD患者经氯吡格雷治疗后血小板聚集率更高,并与活性更高的G蛋白偶联受体P2Y12信号通路相关。