小鼠PRL-3原核表达载体的构建

目的:构建小鼠PRL-3基因的原核表达载体,并在感受态细菌BL21中表达。方法:提取小鼠黑色素瘤B16F10细胞的总RNA,经RT-PCR扩增小鼠PRL-3基因,并将其克隆入原核表达载体pGEX-4T-1中,阳性克隆经限制性内切酶BamHI、EcoRI酶解及测序鉴定后,转化感受态细菌BL21,经IPTG诱导表达GST-mPRL-3融合蛋白。结果:获得全长为522bp的小鼠PRL-3基因片段,构建重组质粒pGEX-4T-1-mPRL-3,转化感受态细菌BL21后,经IPTG诱导,表达出分子质量约为46KD的GST-mPRL-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以可溶性形式存在于E.coli BL21的胞质中。结论:成功地构建了原核表达载体pGEX-4T-1-mPRL-3,为抗体的制备筛选和肿瘤的相关研究奠定了实验基础。     

重组人白血病抑制因子的原核表达及优化

目的在大肠杆菌中表达重组人白血病抑制因子(HLIF)蛋白,并探索其高效表达的条件。方法将HLIF重组质粒转化至大肠杆菌BL21,分别给予不同诱导时间(4、8、12、16、20、24 h)、不同浓度大肠杆菌(吸光度值分别为0. 5、0. 6、0. 8、1. 0)、不同诱导温度(20、25、30、37、42℃)、不同浓度诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 mmol·L-1)、不同浓度乙酸(0. 0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol·L-1)进行培养,蛋白电泳考马斯亮蓝染色后,采用Image J软件分析HLIF蛋白的相对表达量,观察不同干预条件对HLIF表达的影响。结果不同诱导时间下HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=22. 088,P <0. 05),诱导16 h时的HLIF蛋白相对表达量显著高于诱导4、8、12、20、24 h(P <0. 05)。不同浓度(以吸光度值表示)大肠杆菌诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=17. 153,P <0. 05);吸光度值为0. 8时HLIF蛋白相对表达量显著高于吸光度值为0. 5、0. 6时(P <0. 05),吸光度值为1. 0时与吸光度值为0. 8时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。不同温度诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=18. 053,P <0. 05),25℃时HLIF蛋白相对表达量显著高于20、30、37、42℃时(P <0. 05)。不同浓度诱导剂诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(F=1. 181,P> 0. 05)。不同浓度乙酸诱导时HLIF蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(F=27. 181,P <0. 05),乙酸浓度为0. 00 mmol·L-1时HLIF蛋白相对表达量显著高于乙酸浓度为0. 1、0. 2、0. 3、0. 4 mmol·L-1时(P <0. 05)。结论成功在大肠杆菌表达了HLIF,并探索出了适合最佳表达的诱导时间、大肠杆菌浓度、诱导温度、诱导剂浓度、乙酸浓度等条件。     

人分化抑制因子3基因靶向微小分子RNA表达载体的构建及筛选

目的人分化抑制因子3(inhibitor of differentination 3,Id3)基因在A549细胞中的外源性表达能抑制细胞生长并诱导细胞凋亡。文中旨在构建靶向人Id3基因的微小分子RNA(miRNA)表达载体,观察miRNA对A549细胞中Id3表达的下调作用,为进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用机制提供一定实验依据。方法依据miRNA设计原则,针对人Id3基因的mRNA序列,设计并合成编码miRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体中,构建含靶向人Id3基因的miRNA表达质粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3),DNA测序验证后,采用Lipofectamine2000TM脂质体转染技术将该质粒导入A549细胞。荧光倒置显微镜下观察miRNA干扰质粒转染A549细胞后EGFP的表达情况,应用RT-PCR和Western blot方法分别检测miRNA干扰后Id3mRNA及蛋白水平的表达。结果DNA测序表明重组质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-Id3构建正确,将其成功导入A549...     

人Heparanase基因真核和原核表达载体的构建及融合蛋白的表达

目的：构建人Heparanase基因的真核、原核表达载体，大肠杆菌表达其融合蛋白．方法：采用反转录．聚合酶链反应从人肝癌细胞株HepG2cDNA中，分别扩增出Heparanase编码基因，用限制性内切酶BamHI消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1中，经酶切鉴定与测序证实后，连接成包括完整的人Heparanase基因ORF区的真核表达载体，以亚克隆法构建于原核表达载体pRSET的相应酶切位点，转化大肠杆菌BL21菌株，异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生融合蛋白．结果：构建的人Heparanase基因表达载体经序列测定证实，与GenBank登录结果完全一致；双酶切鉴定证实，克隆基因正确插入载体pcDNA3．1及pRSET；SDS-PAGE证实融合蛋白表达成功．结论：成功构建了人Heparanase基因真核、原核表达载体，成功正确表达了6His／Heparanase融合蛋白     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的：构建人CIDE-3基因的原核表达载体，并在E．coli BL21（DE3）中表达．方法：提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA，经RT—PCR扩增人CIDE-3基因片段，并将其克隆入原核表达载体pET28a（＋）中，构建重组质粒pET28a（＋）-CIDE-3.经限制性内切酶Bam H I、Xho I双酶切鉴定及序列测定后，转化E．coli BL21（DE3），经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白．     

人血管生成抑制因子canstatin原核表达载体的构建及表达

目的：构建国人血管生成抑制因子canstatin的原核表达载体并在大肠杆菌BL21中表达canstatin重组蛋白。方法：用Trizol试剂提取人肝脏组织总RNA,通过RT—PCR扩增canstatin的cDNA,克隆到pMD18-T载体中并进行序列分析。将canstatin cDNA定向克隆于原核表达载体pET30a( )中,而后在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达。结果：canstatin cDNA克隆人质粒pET30a( )获得了重组表达载体pET30a( )／Cans,canstatin的cDNA长度为684bp．编码227个氨基酸。IPTG诱导原核表达载体pET30a( )／Cans在大肠杆菌BL21中的表达量约占菌体总蛋白量的35％。结论：原核表达载体pET30a( )／hCans存大肠杆菌BL21中高效表达canstatin重组蛋白。     

人Api6融合蛋白原核表达系统的构建

目的:本研究拟采用蛋白原核表达的方法,诱导表达人Api6(Apoptosis inhibitor 6)融合蛋白,为进一步研究Api6在凋亡抑制、脂质代谢和肿瘤发生中的作用奠定基础.方法:利用PCR技术扩增人Api6基因,将其克隆至原核表达载体ppSUMO,构建重组质粒ppSUMO-Api6;重组质粒转化原核表达宿主菌E...     

外源性人分化抑制因子3在A549／DDP细胞中的表达及意义

目的:Id 蛋白即分化抑制因子(Id),在人类多种肿瘤中异常表达,并参与肿瘤细胞的增生、分化和凋亡等.文中旨在探讨人分化抑制因子3(Id3)基因体外转染在人肺腺癌细胞顺铂耐药株A549/DDP细胞中的表达及意义. 方法:构建人Id3基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体Id3/pEGFP,采用脂质体介导的转染技术将Id3融合基因(Id3-EGFP)导入A549/DDP细胞,激光共聚焦显微镜观察细胞内EGFP的表达情况;半定量RT-PCR检测Id3表达的改变;MTT法观察Id3对细胞的增殖抑制情况. 结果:成功构建人Id3/pEGFP真核表达载体并转染A549/DDP细胞,倒置荧光显微镜下转染的A549/DDP细胞发出强绿色荧光,转Id3/pEGFP质粒的细胞其荧光主要表达于细胞核;RT-PCR结果显示Id3 mRNA在转染后的A549/DDP细胞能有效表达;MTT法结果表明,与对照组相比,转染Id3重组质粒的细胞增殖被抑制. 结论:转染的Id3/pEGFP融合基因在A549/DDP细胞能有效表达,外源性Id3基因能抑制该细胞的增殖.     

人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达

目的:构建热休克蛋白70(HSP70)与人端粒酶逆转录酶融合表达载体,在大肠杆菌进行表达.方法:利用PCR方法扩增hTERT基因片段(532aa～637aa),双酶切后插入原核表达载体pET32a的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,形成pET32a-hTERT质粒.通过PCR方法扩增人HSP70全长cDNA.双酶切后插入pET32a-hTERT的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点之间,构建hTERT与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pET32a-hTERT-HSP70.含有该质粒的大肠杆菌BL21经异丙醛-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:成功的扩增了HSP70基因与hTERT基因片段;测序结果表明成功的构建了pET32a-hTERT-HSP70原核表达载体.含有该质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达约110 kD的蛋白.结论:HSP70与人端粒酶逆转录酶融合表达质粒构建成功,并成功获得了融合蛋白hTERT-HSP70.     

人钠/二羧基转运蛋白2融合蛋白载体的构建及其原核表达

目的：观测和鉴定人钠／二羧基转运蛋白2(hSDCT2)在大肠杆菌中的表达，并分离、纯化其蛋白产物。方法：应用：DNA重组技术，构建重组表达质粒pGEX-hSDCT2；IPTG诱导其表达。采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B亲和层析纯化GST-hSDCT2，经Factor Xa酶切和二次亲和层析后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting进行鉴定。结果：成功构建hSDCT2基因融合蛋白载体，SDS-PAGE及Western Blotting显示GST-hSDCT2融合蛋白表达于原核细胞，蛋白产量约占菌体总蛋白量的25％。经酶切及二次纯化后，获得纯化的hSDCT2蛋白。结论：人钠／二羧基转运蛋白2可在大肠杆菌中稳定表达。     

My027融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌的表达

目的探索My027蛋白的体外表达,通过原核表达获得大量可溶性My027融合蛋白。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出My027片段,插入原核表达载体pGEX-4T-2,构建质粒pGEX-My027。转化BL-21菌,IPTG低温诱导表达融合蛋白,亲和层析法获得融合蛋白,采用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)、Western印迹法及质谱进行鉴定。结果融合蛋白以水溶形式分泌于大肠杆菌BL-21胞质中,纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE、Western印迹法及质谱证实高效表达,氨基酸序列正确。结论人脂肪细胞新蛋白My027在pGEX-4T-2原核表达载体可获高效表达,为进一步研究其功能奠定基础。     

TAT-BPI融合蛋白原核表达载体的构建

目的 探讨使BPI能高效率穿透细胞膜或多种屏障,中和不同解剖部位的LPS,构建TAT-BPI原核表达载体并鉴定的方法,为研制多肽抗生素打下基础.方法 人工合成编码TAT蛋白转导区的DNA片段,插入载体pUC57后得到pUC57-TAT重组质粒;提取正常人外周血多形核粒细胞总RNA, 采用RT-PCR技术扩增BPI N端cDNA片段,构建pUC57-TAT-BPI克隆载体;用酶切和双脱氧测序法进行鉴定.结果 获得含有约630 bp的TAT-BPI融合蛋白基因片段序列,测序分析与Genebank中该序列相符,同源性分析TAT序列中第10、30位核苷酸有突变,氨基酸同源性为93%,蛋白质同源性为90%,在BPI序列中234、454、495、556位核苷酸有突变,氨基酸同源性为98%,蛋白质同源性为95%.结论 成功构建了TAT-BPI融合蛋白的原核表达载体,为进一步研究BPI的抗菌作用奠定了基础.Abstract：Objective To enable BPI efficiently penetrate the cell membrane or a variety of barriers, and neutralize endotoxin in different anatomical parts, construct and identify a prokaryotic expression vector of TAT-BPI, in order to lay the foundation for new bio-antibiotic development. Methods A synthesized DNA fragment encoding TAT protein transduction domain was inserted into pUC57 vector. Then Total RNA was extracted from human polymorphonuclear neutrophils(PMN) and then the human BPI cDNA gene was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pUC57 plasmid and the sequence was confirmed by restriction enzyme digestion and dideoxy-mediated-chain termination. Results Restriction enzyme digestion and DNA sequence analysis revealed that bioactive N-terminal fragment of BPI were not only identical to those of the published human BPI sequence but also were contained in the recombinant vector. Conclusions pUC57-TAT-BPI is successfully constructed, which lays the foundation for studying the protein of BPI.     

凋亡素原核表达载体的构建和表达

目的 构建凋亡素原核表达系统，以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 通过PCR方法，以pcDNA-VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET-DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达栽体pET-DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素原核表达载体pET-DsbA-VP3的大肠杆菌E．coliBL21(DE3)plysS经IPTG诱导后，聚丙烯酰胺凝胶电泳出现38300的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达栽体pET-DsbA-VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达载体构建研究

目的　构建一种诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质的原核表达系统 ,以制备抗原物质凋亡素融合蛋白。方法　通过PCR的方法 ,以pcDNA -VP3质粒为模板 ,扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体 pET DsbA的多克隆位点 ,构建成凋亡素的高效原核表达载体 pET DsbA VP3,将该质粒转化到大肠杆菌E .coliBL2 1 (DE3) plysS中 ,以异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (isopropylthio β D galactoside,IPTG)对其进行诱导表达 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。 结果　转化有凋亡素原核表达载体pET DsbA VP3的大肠杆菌E .coliBL2 1 (DE3) plysS经IPTG诱导后 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳出现 38 3KD的目的蛋白条带。结论凋亡素原核表达载体 pET DsbA VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白     

融合蛋白人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3在原核细胞中的表达

目的：构建人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican3, GPC3）重组原核表达载体。方法以人类肝脏cDNA文库为模板扩增出GPC3基因产物,与pMD-18 simple T 载体进行连接构建出T克隆载体;从T载体上获取基因片段,并对pET-32a（＋）空载体进行双酶切,用T4连接酶连接,构建出pET-32a（＋）-GPC3原核表达载体;对构建好的载体再次测序,并进行诱导表达。结果 PCR产物长度为837 bp,即扩增的GPC3 C末端长度,与NCBI网站的相比较,序列完全一致,说明pET-32a （＋）载体中正确插入了目的片段,并且诱导表达出蛋白。结论成功构建了融合表达Pet-GPC3载体,蛋白诱导表达成功。     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白原核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因全长cDNA,构建原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从大鼠脑组织中扩增出目的基因,先以A-T连接方式克隆到pTA2载体中,再将其克隆到原核表达载体pQE30-Xa中,并进行酶切、测序鉴定。结果:RT-PCR扩增出约700bp特异性片段,重组原核表达载体经酶切鉴定结果同预期相符,经测序鉴定序列同源性与GeneBank报道一致。结论:成功构建了重组原核表达载体pQE30-Xa-OSCP。     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。     

mompS-linker-flaA融合基因原核表达载体的构建及诱导表达

目的在嗜肺军团菌主要外膜蛋白S基因(mompS)和鞭毛亚单位蛋白基因(flaA)基因间加入一段柔性链接头(Linker),以构建mompS-Linker-flaA融合表达载体,并使其在大肠杆菌中表达。方法以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR分别扩增获得嗜肺军团菌mompS基因和flaA基因,与带有硫氧还蛋白(Trx)基因的高效原核表达质粒pET32a( )定向重组,构建含mompS-Linker-flaA基因的重组质粒pET-LpSLF,经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx-MOMPS-Linker-FlaA融合蛋白,用SDS-PAGE及Westernblotting进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了嗜肺军团菌906bp的mompS及1440bp的flaA基因,成功构建了重组质粒pET-LpSLF,SDS-PAGE及Westernblot分析显示重组质粒pET-LpSLF在原核系统中得到了表达。结论嗜肺军团菌mompS-Linker-flaA基因在大肠杆菌中得到了表达,为进一步从分子水平研究其免疫原性、免疫保护性及其在临床诊断上的应用价值提供研究基础。     

人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体的构建

目的构建人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。方法以人胰腺癌(PANC)-1细胞株cDNA为模板,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增胰腺十二指肠同源异型盒基因-1(PDX-1)蛋白编码的全部序列,克隆入原核表达载体pET28a中,经限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切及DNA序列分析重组质粒的目的基因。结果 RT-PCR扩增产物的特异性片段长度为885 bp,以此构建的重组质粒pET28a-TAT-PDX-1经HindIII和BamHI双酶切后显示5 900 bp和885 bp左右的2条片段,测序结果与Genbank中的人PDX-1基因cDNA序列一致。结论成功构建了人TAT-PDX-1融合蛋白原核表达载体。