大鼠肝癌细胞系H4—ⅡE钙内流的检测方法

目的 利用大鼠肝癌细胞系Ｈ４Ⅱ－Ｅ建立一种适用于贴壁生长的细胞检测细胞内游离钙离子（〖Ｃａ＾２＋〗ｉ浓度的方法。原理 用荧光染料ｆｌｕｏ－３在细胞内能与ａ＾２＋结合。在一定波长的光激发下,可发出荧光,根据荧光的强度来检测细胞内游离Ｃａ＾２＋浓度及钙内流的方法。方法 以Ｈ４－ⅡＥ细胞系为材料,通过Ｃａ＾２＋回加技术、荧光显微镜技术和ＵＭＡＮＳ计算机软件或Ａｘｏｎ计算机成像系统来记录图像和处理数据。结     

钙调蛋白参与Reuber肝癌细胞的池操纵钙内流

目的 通过钙调蛋白抑制剂来研究钙调蛋白在Ｒｅｕｂｅｒ肝癌细胞池操纵钙内流的作用及其机制。方法 以Ｒｅｕｂｅｒ肝癌细胞系为材料，用钙离子回加技术，荧光显微镜技术以及加与不加钙调蛋白抑制剂来检测，定量该细胞系的钙释放、钙内流及钙内流速率。结果钙内蛋白参与Ｒｅｕｂｅｒ肝癌细胞池的钙内流。钙调蛋白抑制剂Ｗ１３、Ｗ７、ｃａｌｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ无论加在素胡萝卜素之前或之后，均能抑制由Ｔｇｘｈ ｆｈｎ ｒ     

柴胡皂苷-d对大鼠肝癌细胞H4-ⅡE细胞内Ca2+的影响研究

目的探讨柴胡皂苷-d(saikosaponin-D,SS-D)诱导大鼠肝癌细胞H4-ⅡE细胞内钙离子浓度([Ca2+]cyt)变化的影响研究。方法通过噻唑蓝(MTT)比色实验选择合适的药物浓度、荧光指示剂Fluo-3/AM检测[Ca2+]cyt及钙库中Ca2+的变化。结果 MTT比色结果显示,10、30、50、70、100μmol/L SS-D对细胞的存活率都在90%以上。第一大组中阴性对照组可引起细胞内钙离子浓度升高,其平均荧光强度(MFI)为35.76±1.37;阳性对照组可使其大幅度升高,其MFI值为74.74±1.26。不同浓度的SS-D也可使其不同程度升高,并且与SS-D呈浓度依赖性,其平均荧光强度(MFI)分别为59.95±1.02、73.89±1.35、80.30±0.04、93.30±0.83。阳性对照组及处理组的MFI值明显高于阴性对照组(P<0.05);处理组1、处理组3及处理组4 MFI值与阳性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);石胆酸(LCA)及SS-D、熊脱氧胆酸(UDCA)都能诱导细胞钙库中Ca2+释放。结论 SS-D能诱导细胞内Ca2+内流,增加[Ca2+]cyt,调控细胞内Ca2+的生理活动。     

尖叶假龙胆不同提取部位对胰岛素抵抗H4ⅡE细胞葡萄糖消耗的影响

目的:研究尖叶假龙胆不同提取部位对胰岛素抵抗H4ⅡE细胞糖消耗的影响。方法:采用CCK-8法评价H4ⅡE细胞活性;高浓度胰岛素(10-6mol/L)诱导培养H4ⅡE细胞36 h,建立新的胰岛素抵抗细胞模型。葡萄糖氧化酶法检测尖叶假龙胆不同提取部位对胰岛素抵抗H4ⅡE细胞糖消耗的影响。结果:尖叶假龙胆不同提取部位浓度大于150μg/m L时,对H4ⅡE细胞活性均有明显的抑制作用。尖叶假龙胆不同提取部位中乙酸乙酯提取部位对胰岛素抵抗H4ⅡE细胞葡萄糖消耗影响显著,大孔树脂95%提取部位与大孔树脂70%提取部位也不同程度地影响胰岛素抵抗H4ⅡE细胞葡萄糖消耗,大孔树脂30%提取部位效果不明显。结论:尖叶假龙胆乙酸乙酯提取部位改善胰岛素抵抗效果最佳,大孔树脂95%提取部位与大孔树脂70%提取部位也可不同程度地改善胰岛素抵抗作用。     

高糖对H9C2心肌细胞系和乳大鼠心室肌细胞钙库操纵性钙内流及相关蛋白的影响

目的 探究高糖环境对大鼠胚胎心肌细胞系（H9C2）和乳大鼠心室肌细胞（neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs）钙库操纵性钙内流（store operated calcium entry,SOCE）功能的影响,对基质相互作用分子1（stromal interaction molecule 1,STIM1）蛋白表达及其激活结构的作用,完善SOCE在糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）中的潜在致病机制。方法 将H9C2和NRVMs细胞分为2组,对照组（5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖组（25 mmol/L葡萄糖）,分别培养48 h后用激光共聚焦显微镜实时观察各组心肌细胞在毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）刺激后Ca²⁺荧光强度值的变化;采用Western blotting技术检测各组细胞STIM1和钙释放激活钙通道调节分子1（calcium release-activated calcium channel modulator 1,Orai1）蛋白表达的变化;借助化学交联技术和免疫荧光法检测NRVMs的STIM1蛋白的聚集变化;免疫共沉淀技术观察NRVMs心肌细胞内源性STIM1和Orai1蛋白的直接相互作用。结果 与对照组相比,高糖组H9C2和NRVMs心肌细胞钙内流（Ca²⁺ influx）显著增加（P<0.05）;高糖组H9C2和NRVMs心肌细胞STIM1以及Orai1蛋白表达上调（P<0.01）;钙库排空后,高糖组NRVMs心肌细胞STIM1蛋白聚集体显著增多（P<0.01）。结论 体外高糖能诱导大鼠胚胎心肌细胞系H9C2及乳大鼠原代培养心室肌细胞NRVMs的STIM1和Orai1蛋白表达上调,促进STIM1蛋白激活形成聚集体和SOCE激活,Ca²⁺内流增多。该作用提示高糖增加的心肌细胞SOCE可能与糖尿病心肌肥大有关。     

钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ与阿尔茨海默病

钙／钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ(calcium/calmodulin—dependent protein kinase-Ⅱ,CaMKⅡ)是一种多功能蛋白激酶,存在于多种动物细胞内,尤其在神经组织中含量丰富。研究表明：CaMKⅡ广泛参与基因转录调节、骨架蛋白磷酸化,其活性异常可能是阿尔茨海默病的发病机制之一。     

三七皂甙单体2A-1-1对高血压患者血小板钙内流的影响

目的　观察三七皂甙单体2A - 1 - 1对高血压患者血小板钙内流的影响,并探讨其对血小板受体操纵性钙通道(ROC)的作用。方法　采用Fura - 2 Am荧光探针双波长测定细胞胞浆游离钙离子浓度( [Ca2 + ]i)技术,以Nifedipine为对照观察2A - 1 - 1体外对环匹阿尼酸(CPA)介导的高血压患者血小板钙内流变化。结果　高血压患者血小板静息钙和钙内流均高于正常人(P <0 .0 5 ) ;2A - 1 - 1 ( 5、1 0、2 0 μmol L)可抑制CPA介导的高血压患者血小板钙内流(P <0 .0 5或0 .0 1 ) ;Nifedipine( 2 0 μmol L)不能抑制CPA介导的高血压患者或正常人血小板钙内流(P >0 .0 5 )。结论　2A - 1 - 1可能通过抑制高血压患者血小板ROC ,减少钙内流,从而降低其血小板活性。     

七氟烷吸入麻醉对大鼠认知功能影响的钙内流机制研究

目的:探讨七氟烷吸入麻醉对大鼠认知功能影响及细胞钙内流增强的参与作用.方法:SD大鼠随机分为4组:对照组、1.5％七氟烷吸入2h组(低剂量组)、3.0％七氟烷吸入2h组(高剂量组)及3.0％七氟烷吸入2h+钙通道阻滞剂硝苯地平组(硝苯地平组).Morris型水迷宫测试各组大鼠认知功能,Western Blotting分析各组大鼠左侧海马IL-6/IL-8、TNF-α、细胞凋亡蛋白Bax/Bcl2及Caspase9的表达.结果:七氟烷组大鼠认知功能明显受到影响,IL-6/IL-8、TNF-α、细胞凋亡蛋白Bax及Caspase9表达明显上调,而Bcl2表达明显降低.硝苯地平组异常的认知功能及细胞凋亡蛋白得到明显恢复.结论:IL-6/8及细胞凋亡蛋异常表达及钙内流增强参与了七氟烷引起的大鼠认知功能障碍,硝苯地平可以明显恢复异常的大鼠认知功能障碍.     

4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达

目的:研究共刺激分子4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系的表达及其生物学意义。方法:流式细胞仪检测4-1BBL分子在不同的人恶性血液病细胞系的表达;用可介导4-1BBL逆向信号的鼠抗人4-1BBL单抗(mAb1F1)作用于8个不同的人恶性血液病细胞系,细胞计数法和3H-TdR掺入法评价细胞系的体外生长和增殖。结果:FACS结果显示4-1BBL分子在人恶性血液病细胞系上有不同程度的表达,其中髓性白血病细胞系U937、HL60及B淋巴瘤细胞系Raji、Daudi上呈现较高水平的表达。细胞计数和3H-TdR掺入实验结果表明mAb1F1对髓性白血病细胞系U937和HL60,具有较强的促增殖效应。结论:共刺激分子4-1BBL分子在髓性白血病细胞系和B淋巴瘤细胞系上表达率较高;4-1BBL分子可通过介导逆向信号促进髓性白血病细胞系U937和HL60的生长和增殖。     

PF-4促进脑胶质瘤细胞Ca^2＋内流的实验观察

目的探讨血小板因子-4（platelet factor-4,PF-4）对脑胶质瘤细胞Ca^2＋内流的影响。方法脑胶质瘤细胞U251传代培养,分别加入浓度为0（对照组）、900 ng/ml、1200 ng/ml、1500 ng/ml的PF-4,继续培养24 h。利用LSCM测定经Fluo-3标记的脑胶质瘤细胞内Ca^2＋荧光强度。结果对照组脑胶质瘤细胞内Ca^2＋荧光强度为24.21±2.36;实验组脑胶质瘤细胞内Ca^2＋荧光强度分别为39.35±3.31,52.39±3.26,65.56±2.81。经单因素方差分析,各组间差异P〈0.05。结论PF-4对脑胶质瘤细胞Ca^2＋内流有明显的促进作用。     

人参皂苷Rb1对肺动脉高压大鼠钙库操纵性钙内流的影响

目的：观察在体人参皂苷Rb1预处理对慢性低氧(CH)肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞钙库操纵性钙内流(SOCE)的影响。方法：将30只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(control组)、CH肺动脉高压模型组(CH组)和Rb1(30 mg/kg)组,每组10只。检测各组右心室收缩压、右心室质量指数和肺动脉血管环张力。体外培养大鼠肺动脉平滑肌细胞,采用细胞动态荧光检测游离Ca²⁺浓度。分别采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和western blotting检测基质相互作用分子2(STIM2)和钙释放激活钙调节因子2(Orai2)基因和蛋白表达。结果：与CH组比较,Rb1组大鼠右心室收缩压和右心室质量指数均明显降低(P<0.01),环匹阿尼酸(CPA)诱发的肺动脉收缩张力和钙内流量明显减少(P<0.01),STIM2和Orai2 mRNA和蛋白相对表达量明显降低(P<0.05)。结论：Rb1可明显改善CH肺动脉高压大鼠的肺动脉压,其作用机制可能与减弱肺动脉SOCE功能和STIM2和Orai2表达有关。     

血管紧张素Ⅱ对肝癌细胞系 HEPG2发生上皮间质转化的影响

目的：通过血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激肝癌细胞系HEPG2,探讨其是否可以促进HEPG2发生上皮间质转化（ EMT）。方法使用AngⅡ刺激HEPG2,进而采用蛋白印记法对HEPG2中Vimentin 和 E－cadherin 蛋白表达水平进行检测;探讨其发生EMT的合适时间;并使用AngⅡ的抑制剂Ang1－7和Ang1－7的抑制剂A779进行干预,明确AngⅡ诱导HEPG2发生EMT的作用。结果 AngⅡ刺激下,HEPG2中E－cadherin 转录水平下降,Vimentin转录水平升高;最适宜刺激时间是48 h。 AngⅡ诱导HEPG2发生EMT的作用可部分被抑制剂Ang1－7抑制。结论 AngⅡ刺激下,HEPG2可以发生EMT。     

高盐环境对大鼠冠状动脉平滑肌钙库操纵的钙内流及其介导的收缩功能的影响

目的 探讨不同浓度高盐环境下大鼠冠状动脉平滑肌中钙库操纵的钙内流(SOCE)及其介导的收缩功能的影响.方法 不同浓度高盐培养基(分别含137.65～167.65 mmol/L NaCl)培养离体大鼠冠状动脉24h后,采用免疫组化检测Orai1、STIM1、IP3R和ETA在冠状动脉平滑肌中表达情况;应用微血管张力测定系...     

胃癌E钙粘素和β-连环素的表达及其临床意义

目的 探讨胃癌E钙粘素(Bcadherin，E-cad)和β-连环素(pcatenin，peat)的表达及其临床意义。方法 利用组织芯片技术，采用免疫组织化学(S-P)法检测58例胃癌、20例胃腺瘤和18例胃正常组织中E钙粘素和β-连环素基因蛋白产物的表达水平。结果 胃癌E-cad异常表达率(82．8％)显著高于胃腺瘤(50．0％)，B-cad的表达异常与胃癌的分化程度、淋巴结转移、浸润深度和肿瘤大小密切相关。胃癌β-eat的异常表达率(79．3％)高于胃腺瘤(60．0％)，β-cat的表达异常与胃癌的分化程度、淋巴结转移密切相关，与胃癌的浸润深度、肿瘤大小无相关性。结论 E-cad和β-cat的异常表达与胃癌的分化和转移密切相关，检测E-cad和β-cai的表达可作为判断胃癌侵袭、转移的良好参考指标。     

FQ-PCR检测小鼠肝癌模型中Cyclin E mRNA方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测小鼠肝癌模型中细胞周期蛋白cyclin E mRNA的方法。方法:以cyclin E和β-actin的PCR产物为阳性模板,分别将二者cDNA产物进行10倍梯度稀释,建立双标准曲线,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测cyclin E和β-actin mRNA含量,对熔解曲线进行分析确定扩增产物的特异性。结果:建立的标准曲线线性关系良好,相关系数r均为-1.00,cyclin E和β-ac-tin扩增效率分别为0.91和0.93,熔解曲线分析显示均为单峰,特异扩增产物的Tm值分别为(81.84±0.28)℃和(89.15±0.26)℃。10-4Cyclin E和β-actin cDNA标本日间变异系数(CV)和批内CV分别为1.02%、1.45%和0.90%、1.48%。结论:SYBR Green I实时荧光PCR定量检测cyclin E mRNA是一种方便快捷、经济实惠、灵敏度高、特异性好的方法,为cyclin E的进一步研究奠定方法学基础。     

茶多酚改善大鼠缺血/再灌注心脏功能和能量代谢并抑制体外培养心肌细胞的钙内流

目的：探讨茶多酚对缺血/再灌注心脏损伤的保护作用,并研究心脏能量代谢和心肌细胞钙内流是否参与了心脏缺血/再灌注损伤的保护作用。方法在大鼠Langendorff离体心脏上实施缺血/再灌注各30 min,用一导管经压力换能器连接放大器记录心功能指标;用31P NMR技术测定心脏的能量代谢,全细胞膜片钳技术记录心肌细胞钙内流。结果与对照组比较,茶多酚（2.5 mg/L）能使缺血/再灌注心脏的心室发展压、左心室压最大收缩速率（+dp/dtmax）、左心室压最大舒张速率（-dp/dtmax）和冠脉流量显著增加（P<0.05）,并显著改善缺血/再灌注心脏的能量代谢,增加心肌ATP和PCr含量（P<0.05）。浓度为2.5和5.0 mg/L的茶多酚均能显著抑制培养心肌细胞的钙内流（P<0.01）。结论茶多酚对大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用可能与其改善心肌能量代谢、抑制心肌细胞钙内流的作用有关。     

盐酸利多卡因神经毒性损伤大鼠脊髓钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的表达

目的 观察大鼠鞘内注射盐酸利多卡因神经损伤后脊髓钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMK Ⅱ)的表达变化.方法 鞘内成功置管的雄性SD大鼠48只,体质量(230±20)g,用随机数字表法将大鼠分成4组(n=12,其中行为学检测大鼠8只,免疫印迹实验大鼠4只):正常组(C组)、假手术组(S组)、溶媒组(D组)、10％利多卡因组(L组).分别于给药前、给药后2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d、4d、5d等时点检测大鼠机械缩腿阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)和热缩腿潜伏期(thermal withdrawal latency,TWL).并于给药后12h取4只大鼠脊髓腰膨大,免疫印迹检测大鼠脊髓腰膨大CaMKⅡ的表达.结果 C组、S组和D组大鼠MWT的基础值分别为(11.2±3.1)g、(11.8±2.2)g和(11.4 ±2.4)g,其余各时间点与基础值比较差异无统计学意义(n=8,P＞0.05);L组大鼠MWT在给药后2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d、4d时点显著增加(n=8,P＜0.01),分别为(22.0±6.6)g、(22.2 ±5.3)g、(20.5 ±5.8)g、(18.5 ±4.3)g、(16.7 ±3.2)g、(15.2 ±3.1)g、(15.5 ±3.5)g、(13.7±2.4)g.与MWT结果相似,C组、S组和D组大鼠TWL的各时间点比较差异无统计学意义(n=8,P＞0.05);L组大鼠TWL在给药后2h、4h、8h、12h、1d、2d、3d时点显著增加(n=8,P＜0.01).C组、S组、D组及L组大鼠脊髓CaMK Ⅱ表达分别为0.17±0.03、0.16 ±0.03、0.19 ±0.05、0.42 ±0.11,L组大鼠表达显著增加(n=4,P＜0.01).结论 鞘内注射盐酸利多卡因可致脊髓CaMK Ⅱ表达显著增加,提示CaMK Ⅱ可能与盐酸利多卡因所致的神经损伤有关.     

髓系白病细胞系HLA-Ⅱ基因型的探讨

目的检测髓系白血病细胞系HLA-Ⅱ基因型.方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对4种髓系白血病细胞系(U937、K562、HEL、MEG)的HLA-Ⅱ基因型进行DNA分型.结果该4种白血病细胞系的HLA-Ⅱ基因型分别是,U937细胞DRB1*0301/*0301,DQB1*0201/*0201,DPB1*0402/*0402;K562细胞DRB1*0301/*0301,DQB1*0201/*0201,DPB1*0402/*0402;HEL细胞DRB1*1302/*1302,DQB1*0201/*0201,DPB1*1401/*1401;MEG细胞DRB1*1406/*0410,DQB1*0401/*0401,DPB1*0501/*0501.结论该4种细胞系虽然来源于不同个体,但均属于髓系肿瘤细胞,国际FAB分类均属于急性髓系白血病细胞.然而,分子免疫遗传学类型有所差异.通过本研究提高了髓系白血病细胞系HLA-Ⅱ基因型认识,对今后髓系白血病分子免疫遗传学的研究,提供了初步资料.     

β-淀粉样蛋白与载脂蛋白E4对大鼠海马突触素的影响

目的观察β-淀粉样蛋白（Ap）和载脂蛋白E（apoE）4对大鼠海马突触素（synaptophysin,SYN）的影响以及二者是否具有协同作用。方法将24只雄性Wistar大鼠分为4组：对照组海马注射生理盐水,n13组注射Aβ1-40,apoFA组注射apoE4,Aβ＋apoFA组注射Aβ1-40＋apoFA。15d后水迷宫检测各组大鼠的学习记忆能力,之后免疫组化法检测CA1区突触素的表达。结果apoE4组、Ap组与对照组比较大鼠第5天的逃避潜伏期明显延长,跨台次数明显减少（P〈0．01）;AB组与apoE4组比较,大鼠第5天的逃避潜伏期明显延长,跨台次数明显减少（P〈0．01）;AB与apoFA之间存在交互作用（F=7．098,P〈0．01）。apoE4组、A13组比对照组突触素OD值下降明显（P〈0．01）;Ap组比apoFA组下降明显（P〈0．05）;Aβ＋apoE4组比对照组、apoFA组及Ap组均下降明显（P〈0．01）;Aβ与apoFA具有交互作用（P〈0．05）。结论Aβ及apoE4均可损伤海马突触结构;A13对海马突触结构损伤比apoE4严重。Aβ与apoFA对海马突触结构的损伤具有协同作用。     

微波辐射合成7-硝基-4(3H)-喹唑啉酮

目的用微波辐射法合成7-硝基-4（3H）-喹唑啉酮,研究微波功率、微波辐射时间和酸胺摩尔比等对反应收率的影响。方法以2-氨基4-硝基苯甲酸、甲酰胺为原料,采用微波辐射合成7-硝基-4（3H）-喹唑啉酮,并通过正交设计实验优化反应条件。结果最佳条件为：微波功率95W,辐射时间9min,酸胺摩尔比1：12,收率可高达96．8％,与常规加热法比较提高了约35％。结论微波辐射法对合成7-硝基-4（3H）-喹唑啉酮具有非常好的效果,与传统加热方法及文献方法相比,缩短了反应时间,提高了反应速率和收率。