星形孢菌素诱导NG108—15细胞凋亡

目的：研究星形孢菌素是否能引起NG108—15细胞的凋亡及它对数种与凋亡相关基因蛋白表达水平的影响．方法：用相差显微镜、荧光显微镜和透射电镜观察形态学变化;琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯带;免疫印迹法检测凋亡相关基因蛋白的表达水平．结果：经星形孢菌素0．1μmol／L处理后NG108—15细胞呈典型的凋亡形态学变化．星形孢菌素处理后6h即出现DNA凋亡梯带,可持续至24h．Bax蛋白表达在星形孢菌素处理后6h开始上升,12h至最高峰,24h后下降．Bcl-2蛋白表达在星形孢菌素处理后3h明显上升,随后逐渐下降．星形孢菌素处理后6h可见caspase-3切割产物出现,但Cdk5蛋白的表达水平未见明显变化．p53蛋白表达在星形孢菌素处理12h后下降．结论：星形孢菌素诱导了NG108—15细胞的凋亡,可能与Bax蛋白表达的增加及caspase-3切割有关,而与p53和Cdk5无明显相关性．     

泰乐菌素基因工程菌的构建

目的构建具有双拷贝tylF基因的泰乐菌素基因工程菌,以解决泰乐菌素基因生物合成的限速环节,提高泰乐菌素的发酵产量。方法通过SOE-PCR获得PermE-tylF基因,构建随机整合型重组质粒pBH05,通过接合转移将PermE-tylF基因及其载体随机整合到弗氏链霉菌的基因组中,并通过抗性筛选获得重组菌株D-120。将重组菌株D-120进行摇瓶发酵,采用生物效价测定的二剂量法测定泰乐菌素的发酵单位。结果在相同的发酵条件下,重组菌株泰乐菌素的发酵单位较出发菌株提高32.7%。结论该基因工程菌的构建改善了泰乐菌素生物合成的限速环节,大幅度提高了泰乐菌素的发酵效价。     

星形孢菌素诱导小鼠T细胞中Caspase非依赖性细胞死亡方式的研究

目的:研究星形孢菌素(staurosporine,STS)诱导的小鼠T细胞中Caspase非依赖性细胞死亡方式,探讨T细胞死亡的分子机制。方法:在加入或不加Caspase抑制剂z-VAD-fmk(20μmol.L-1)情况下,检测STS(100 nmo.lL-1)刺激后小鼠T细胞的凋亡率,DNA ladder,线粒体膜电位变化以及凋亡相关蛋白AIF,细胞色素C和Bax等的变化。结果:STS诱导的小鼠T细胞凋亡中存在Caspase非依赖性细胞死亡方式,其DNA ladder改变与Caspase依赖性死亡方式不同,线粒体膜电位依然下降,AIF从线粒体转移到细胞质中要早于细胞色素C,且两者的转移需要Bax结合到线粒体上。结论:在STS诱导的小鼠T细胞死亡中,Caspase非依赖性死亡方式可能是Caspase依赖性死亡方式的替代途径,这对于维持T细胞的数量和保证免疫系统功能的正常发挥具有十分重要的意义。     

小诺霉素产生菌棘孢小单孢菌突变菌株原生质体形成、再生及融合的研究

甘氨酸（Ｇｌｙ）的加入将会影响棘孢小单孢突变型菌株孢子发芽和菌丝生长，其影响程度与甘氨酸浓度及菌丝培养基成份有关，在Ⅱ号培养基中，０．３％Ｇｌｙ对菌丝形态的改变十分明显，而０．５％Ｇｌｙ能抑制孢子发芽。消色肽酶（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｉｔｉｄａｓｅ）与溶菌酶（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）联合作用比单一溶菌酶制备的原生质体形成率和再生率有明显提高。再生培养基以原分离培养基补充０．２ｍｏｌ／Ｌ蔗糖为宜，其再生频率可达到１５％。采用ＰＥＧ４０００，４２％（ｗ／ｖ）为助融剂，直接法检出融合重组体，其重组频率可达０．５％～１．０％，重组体中大部分苗株的次级代谢特性与亲株有较大差异，在再生菌落筛选中获得一些优良菌株，其小诺霉素产率较原亲株有显著提高。     

小单孢菌及其产生的次级生物活性代谢产物

原核微生物小单孢菌产生了740多个生物活性物质，化学结构类型多样，生物活性各异，主要为抗生素和一些人体酶抑制剂。小单孢菌不但能产生链霉菌产生的抗生素化学类型而且还有其独到之处。最受人重视的抗生素是庆大霉素、最主要的特征是产生氨基糖苷类抗生素和大环内酯类抗生素。福建省微生物研究所自20世纪60年代成功研发庆大霉素之后不问断地从我国各地水生环境中分离到多种抗生素、几种酶抑制剂和其他生物活性物质。本文还阐述近年来国外在小单孢菌中发现的一些有实用价值和有前途的微生物新药物，特别是烯二炔类抗肿瘤抗生素。     

伊尼奥小单孢菌产生的西索米星抗性基因克隆及其特性

西索米星是一种广谱氨基糖苷类抗生素,对革兰氏阳性、阴性菌以及分枝杆菌有效。Reimann报道,西索米星具有拟三糖结构,存在一个氨基环醇配基,α—脱氧链霉胺通过糖甙键与α—氨基—α—脱氧—D—葡萄糖和D—木糖相连。尽管西索米星的生物代谢途径未作详细研究,有人用西索米星阻遏突变株分析了突变合成产物和中间体,发现有至     

小单孢菌FIM-203产生庆大霉素A的研究

从福建武夷山森林土壤中分离到一株小单孢菌,编号为F IM-203,分类特征的初步研究表明该菌株属于棘孢小单孢菌。生物活性检测提示F IM-203的发酵液具有抗G 、G-细菌活性,发酵液经离子交换树脂提取获得的初提物含有3个组分,其中FW-203C为主要组分。理化性质和光谱学分析研究证明FW-203C与庆大霉素A(gen tam icin A)同质。     

透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响

目的利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组菌,探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响。方法用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定血红蛋白,用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的差别。结果红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较,重组菌株发酵过程葡萄糖浓度的变化出现在第二时段(约38h),原始菌株达到了0.4g/L,而重组菌株只有0.25g/L;第三时段原始菌株出现了游离葡萄糖浓度高峰而重组菌株未出现。在两个菌株中生物物质浓度[以总蛋白质(g/L)表示]存在不同,重组菌株比原始菌株约低27%。红霉素效价,原始菌株和重组菌株分别为3.98和5.15g/L,相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%。结论重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白,提高了红霉素产率,对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。     

中生菌素产生菌发酵合成培养基的设计优化

目的 针对目前没有适合中生菌素产生菌的合成培养基的现状,进行中生菌素产生菌发酵合成培养基的设计,并对其进行优化,以期为以后中生菌素产生菌发酵生产、营养生长、代谢、遗传育种和产素机制的研究提供基础.方法 顺序通过无机氮源和有机氮源的筛选、正交试验,并利用统计学软件SPSS V13.0对实验数据进行分析,确定并优化中生菌素产生菌发酵合成培养基的组成成分.结果 最终确定了中生菌素产生菌发酵合成培养基,该培养基在定量加入微量元素的基础上,组成成分为谷氨酸钠0.5%,葡萄糖1.5%,可溶性淀粉1.5%,NH_4C10.3%,KH_2PO_4 0.02%,MgSO_4 0.025%,NaCl 0.5%,CaCO_30.3%.结论 经过发酵验证,该培养基的产素能力可达到2000μg/mL左右,虽然比天然成分培养基低,但可以满足以后营养生长、代谢、遗传育种和产素机制等的研究.     

刺糖多孢菌高产菌株转录组及其多杀菌素合成代谢调控研究

摘要：目的 通过对高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行转录组分析,挖掘多杀菌素合成相关代谢通路的差异基因,并在此基础上结合发酵优化进一步提高多杀菌素产量。方法 利用RNA-seq技术对高产株SS-168及低产野生菌株SS-WT进行比较转录组分析,通过荧光定量PCR验证差异基因表达,再通过发酵培养基优化考察高产菌株的发酵水平。结果 转录组分析表明,与低产菌株相比高产株中有1341个差异表达基因,GO注释表明DEGs主要参与氧化还原生物过程和脂质代谢及辅因子结合和辅酶结合,主要分布在甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢、脂肪酸降解等通路。荧光定量PCR结果与转录组数据一致性达到100%。采用分别含有不同浓度的甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸的发酵培养进行筛选,多杀菌素发酵水平显著提高。结论 本研究通过新颖的转录组学方法获得了刺糖多孢菌高产菌株的差异基因,并对其高产机制和发酵优化进行了初步分析,为改良刺糖多孢菌菌株和优化发酵工艺提供重要的理论基础和参考依据。     

刺糖多孢菌原生质体制备与再生条件优化

目的研究多杀菌素产生菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)原生质体制备与再生的最佳条件。方法利用数理统计的方法研究了不同制备培养基、菌龄、甘氨酸浓度、溶菌酶处理条件以及再生培养基对原生质体制备和再生的影响,并考察了原生质体的适宜保藏温度。结果菌体在添加0.3%甘氨酸的EHC培养基中培养72h,用2mg/mL溶菌酶32℃酶解40min后,涂布在再生培养基R6上再生,原生质体制备率超过99%,再生数可达到107cfu/mL。刺糖多孢菌原生质体可置于4℃短期保存72h,长期保存需要放置于-80℃条件下。结论优化的结果为刺糖多孢菌原生质体融合育种和遗传转化体系建立奠定了基础。     

小单孢菌产生的扁枝衣霉素B的研究

从福建森林土壤中分离到一株小单孢菌F IM 98-125,其发酵产物对革兰氏阳性细菌包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(M RSA)有强的抗菌活性。其活性产物中以抗生素FW 98-125 I的活性最强。根据FW 98-125 I的理化性质及有机光谱行为,确定其为寡糖类抗生素扁枝衣霉素B(Evern inom icin B)。     

蛋白激酶C抑制剂星形孢菌素对肺腺癌A549细胞侵袭力的影响研究

目的:探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂星形孢菌素(STS)对肺腺癌A549细胞侵袭移动的影响及作用机制。方法:取A549细胞加入不同浓度STS(1、10、100 nmol.L-1)处理后,应用Transwell小室检测A549细胞移动抑制率和侵袭抑制率;免疫荧光染色法检测细胞内蛋白水解酶基质金属蛋白水解酶-9(MMP-9)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)蛋白表达;激光共聚焦法观测细胞内骨架蛋白微管蛋白α-tubulin的分布,Western blot法检测胞膜和胞浆内PKC-α活性。同时设立不加STS处理的对照组进行比较。结果:与对照组比较,A549细胞的移动抑制率、侵袭抑制率、MMP-9和uPA蛋白表达量均明显下降(P<0.05或P<0.01);胞浆内α-tubulin蛋白分布不均;胞膜内PKC-α蛋白含量减少,而胞浆内PKC-α蛋白含量无明显变化。结论:PKC抑制剂STS能抑制A549细胞移动和侵袭;其机制可能与抑制PKC-α的活性,减弱肿瘤细胞中MMP-9、uPA表达,诱导肿瘤细胞骨架变化相关。     

中生菌素高产菌的选育及发酵条件的研究

中生菌素是由淡紫灰链霉菌海南变种产生的一种氨基糖苷类抗生素，其产生菌用紫外诱变、磁场辅助紫外诱变等手段获得高产菌株O－66，产量达500mg/ml，比原株提高了2．5倍。在选育过程中注意了菌落形态与产量的相关性并采用正交法筛选出发酵培养基。     

小单孢菌FIM98-160产生的抗分枝杆菌抗生素labilomycin

在筛选抗结核杆菌药物的过程中 ,从福州水库底土样品中分离到小单孢菌FIM98 1 60 ,对该菌株作分类鉴定 ,抗菌物质的分离纯化 ,所得化合物含有三个组分 ,其中A组分经理化性质、光谱特征和生物学活性研究 ,证明它与链霉菌产生的labilomycin同质。它是首次从小单孢菌代谢产物中分离得到。     

壳二孢氯素产生菌的鉴定及发酵培养基优化

目的对壳二孢氯素产生菌F05Z0761进行菌种鉴定,并进行培养基优化,提高其发酵单位。方法首先通过形态学特征进行鉴定,然后通过发酵培养基筛选实验并采用Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验、中心组合实验设计等方法提高发酵单位。结果 F05Z0761经形态学鉴定显示该菌株属于镰刀菌属（Fusarium）,并得到了优化后的发酵培养基配方即:淀粉1.8%、葡萄糖2.5%、棉籽粉1.9%、热榨黄豆饼粉0.8%和KH₂PO₄0.2%,发酵单位较对照提高了4.38倍。结论由镰刀菌属产生壳二孢氯素在国内还未见报道,并将响应面实验设计应用于该菌株的发酵培养基优化中。     

遗传改造刺糖多孢菌菌株生产多杀菌素 J 和 L

目的 发展刺糖多孢菌遗传操作体系,构建生产多杀菌素 J 和 L 遗传重组菌株。方法 由于刺糖多孢菌是公认的难操作放线菌之一,本文通过 λ-Red 和 FLP 重组酶介导的体内重组体系结合黏粒文库,发展了刺糖多孢菌的高效基因操作体系。结果 利用该方法实现目标基因高效敲除,测试基因敲除效率可达 66%。利用该技术构建了 SpnK 失活的刺糖多孢菌突变菌株,HPLC-MS 和 NMR 分析显示突变株产生的新化合物为多杀菌素 J 和 L,且产量与出发菌株产生的多杀菌素 A 和 D 相当。结论该策略可用于刺糖多孢菌的遗传改造,可将多杀菌素高产菌株改造后直接生产多杀菌素 J 和 L。     

高产CL—UACA酰化酶菌侏的获得及其培养条件的研究

从假单胞菌的野生菌侏ＳＰ－８２１出发，经化学、物理诱变，获得ＣＬ－７ＡＣＡ酰化酶高产菌株７９ｕ－１８，酶活性７００ｕ／Ｌ。在菌株选育过程中一个突破性进展是分离获得构成型ＧＬ－７ＡＣＡ酰化酶产生菌株，即该菌在培养中不需加入戊二酸作诱导剂。本文介绍上述菌株的获得及培养条件的研究。     

十字孢碱产生菌筛选及其肿瘤细胞毒活性产物研究

目的 寻找海洋放线菌来源的十字孢碱产生菌,筛选获得目标菌株,分离鉴定其具有吲哚咔唑母核的产物。方法 以十字孢碱在λ_max290 nm附近尖锐的特征紫外吸收为标准,利用HPLC-UV对不同来源的海洋放线菌的发酵提取物进行定向筛选,筛选出十字孢碱产生菌,利用16S rRNA序列对筛选得到的菌株进行种属鉴定。通过比较各产生菌的十字孢碱类产物的丰度,选择能够产生更多该类化合物的菌株进行规模化发酵,并采用硅胶柱层析、Toyopearl HW-40F凝胶柱层析、高效液相色谱(HPLC)等方法对其发酵提取物进行分离、纯化,运用质谱(MS)、核磁共振(NMR)等技术鉴定化合物的结构。采用CCK-8法测定化合物的细胞毒活性。 结果 从42株放线菌中筛选出12株十字孢碱的产生菌,其中Streptomyces sp. OUCMDZ-5380的产物最为丰富,从该菌株发酵提取物中分离鉴定了3个吲哚咔唑类化合物,分别为K252c (1)、十字孢碱 (2)和4"-O-去甲基十字孢碱 (3)。细胞毒活性测试表明,化合物3对12株肿瘤细胞株的IC₅₀值达到纳摩尔、介于0.0003–0.623 μM之间。 结论 筛选得到12株主产十字孢碱的海洋放线菌,从OUCMDZ-5380的发酵产物中鉴定了3个吲哚咔唑类化合物,化合物3具有广谱的肿瘤细胞毒活性(半数抑制浓度IC₅₀为0.0003–0.623 μM.)和对内部串联复制突变的人急性髓细胞性白血病细胞MV4-11的选择性(相对于人正常细胞株L-02和其它人肿瘤细胞株的选择指数分别为1120和50–2080)。     

22株星形奴卡菌的临床分布及其耐药性分析

目的：分析星形奴卡菌的临床感染和对抗生素的耐药性,指导临床治疗。方法：对2000年7月～2010年5月从临床分离的星形奴卡菌的临床分布特点,伴随的原发疾病及耐药情况进行回顾分析。结果：星形奴卡菌主要引起呼吸道感染,这种感染常伴随多种原发的基础性疾病,磺胺类药物是治疗星形奴卡菌感染的首选用药。结论：监测本地区星形奴卡菌对药物,特别对磺胺类药物的耐药性,根据药敏试验针对性选用抗菌药物,为临床治疗提供指导意见。