4种消食中药的质量生物活性测定方法研究：消化酶种类选择与活力效价测定

目的 为有效评控消食类中药的质量,研究基于消化酶活力检测的消食类中药生物效价测定方法并结合传统论述以探索消食类中药的质量控制方法。方法 以山楂、六神曲、麦芽、谷芽为研究对象,筛选适宜消化酶种类;采用“质反应平行线法”建立基于酶活性的生物效价测定法,并进行方法学考察,测定10个批次各药物的生物效价;最后采用营养糊黏度测定法验证不同效价各药降低黏度的活性差异,评价酶活力效价与药物质量的相关性。结果 蛋白酶、脂肪酶与淀粉酶活力测定方法的吸光度与产物质量浓度有良好线性关系,r2均大于0.99;结合实验结果与传统论述,山楂善消肉积且蛋白酶活力效价系数为效价综合系数中的最大值,六神曲善消谷麦酒积但脂肪酶活力效价系数为效价综合系数中最大值,麦芽谷芽善消淀粉食积且淀粉酶活力效价系数为效价综合系数中的最大值,故山楂、六神曲、麦芽和谷芽分别选取蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶做标准酶。实验所用供试品制备方法的量效曲线与阳性药胃蛋白酶片相似,重复性、精密度及中间精密度考察结果均符合要求;各药10批样品的效价差异较大,山楂蛋白酶活力效价为175.40～330.66 U/mg,六神曲脂肪酶活力效价为187.36～858....     

不同产地六神曲麦芽低聚糖酶活力实验比较研究

目的:比较分析不同产地六神曲质量。方法:采用麦芽低聚糖酶活力为质量评价指标,比较不同产地六神曲生品、炒制品麦芽低聚糖酶活力,同时进行聚类分析。结果:六神曲各产地麦芽低聚糖酶活力有较大差异,其中生品六神曲中活力最高为广西(509.25±7.30)U·g~(-1)、最低为四川2(37.99±0.59)U·g-1,相同产地生品与炒制品比较中河北1生品(406.97±2.20)U·g~(-1),炒制后活力明显下降(P0.01),为(97.19±3.99)U·g~(-1)。结论:不同产地六神曲麦芽低聚糖酶活力均有差异,同一产地六神曲生品麦芽低聚糖酶活力大于炒制品,麦芽低聚糖酶活力可作为六神曲质量评价的指标,根据聚类分析可对不同产地六神曲质量进行分级分类。     

六神曲的市售生品与米曲霉发酵品对食积小鼠胃肠道功能的影响

目的观察六神曲市售生品与米曲霉发酵品对食积小鼠胃肠道功能的影响。方法实验分为:正常对照组、食积组、六神曲市售生品高剂量组(MLSH,4g/kg)和低剂量组(MLSL,1g/kg)、六神曲米曲酶接种高剂量组(MLFH,4g/kg)和低剂量组(MLFL,1g/kg)。复制食积模型,灌胃给药7d,测定胃酸及胃蛋白酶浓度、胃排空率、小肠推进率;检测结肠内容物双歧杆菌、乳酸杆菌、粪肠球菌、大肠杆菌数量。结果六神曲可提高食积小鼠胃排空率,降低食积小鼠胃酸浓度,但对小肠推进率和胃蛋白酶无明显影响。与模型组比较,六神曲可增加双歧杆菌、乳酸杆菌数量,降低大肠杆菌、粪肠球菌数量。结论六神曲市售生品与米曲霉发酵品可通过增加胃部动力,改善胃酸分泌,扶植有益菌,对食积小鼠有一定治疗作用。     

量反应平行线法在溶栓胶囊蚓激酶效价测定方法学研究中的应用

目的:建立蚓激酶的效价测定方法,并引入生物检定统计法控制实验误差。方法:用标准曲线法和生物检定的量反应平行线法统计计算效价,从方法耐用性、专属性、线性范围、供试品处理方法、精密度、重复性、溶液稳定性、回收率、统计计算方法等方面对溶栓胶囊中蚓激酶效价测定的琼脂糖纤维蛋白平板法进行了方法学研究。结果:不同琼脂糖、不同纤维蛋白原对本法测定影响较小,阴性对照无干扰;本法线性范围为12.5~400 U,精密度RSD 3.2%,重复性RSD 8.3%,回收率97.0%,RSD 16.6%;供试品溶液在4℃下72 h内稳定;用本法可以将测定误差由60%~70%降低到2%左右。结论:琼脂糖纤维蛋白平板法可以快速、简便、准确地测定蚓激酶的活性,用生物检定的量反应平行线法可以控制测定的误差。     

止血生物效价用于白及品质评价的研究

采用凝血酶时间(TT)将对照物质维生素K1注射液与白及参照物质进行对比检定,对白及参照物质进行标化,建立了白及体外测定凝血酶时间的生物活性测定方法,运用"量反应平行线法"(3.3)对不同产地的白及进行止血生物效价测定。白及参照物质量效之间具有良好的线性关系(Y=66.332-23.913X,R2=0.995 3),测得不同产地白及止血生物效价为821.93~1 187.53 U·g-1,并均能通过可靠性检验(偏离直线P>0.05,偏离平行P>0.05)。该方法仪器精密度(RSD3.8%)、中间精密度(RSD 4.6%)、重复性(RSD 3.2%)、稳定性(RSD 3.7%)较好,所建立的白及止血生物效价检测方法可靠,操作简便,重复性好,可用于白及止血生物效价的测定。     

Box-Behnken响应面法优化六神曲两优势菌协同发酵工艺

目的 利用Box-Behnken响应面法优化六神曲中2种优势菌的协同发酵工艺。方法 利用米根霉Rhizopus oryzae、扣囊复膜孢酵母Saccharomycopsis fibuligera 2种优势菌协同六神曲发酵,在《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第19册中六神曲组方的基础上,以蛋白酶活力和淀粉酶活力为评价指标进行发酵工艺单因素考察,进而采用Box-Behnken响应面法设计四因素三水平试验,并结合CRITIC权重法计算2种酶活力的综合得分,优化筛选六神曲2种优势菌协同发酵工艺。结果 以米根霉和扣囊复膜孢酵母按1∶2接种比例和15%总接种量接种于六神曲基质,32.5 ℃温度下发酵6 d制得六神曲,与同一厂家的9批商品六神曲相比,自制六神曲的酶活力批次间更稳定。结论 优化后的两菌协同发酵六神曲批间质量更加稳定。     

六神曲最佳发酵周期研究

目的:探讨不同发酵时间六神曲中淀粉酶、糖化酶、蛋白酶活力的动态变化规律,验证六神曲样品对小鼠肠胃运动的影响,为六神曲最佳发酵周期的确定提供依据。方法:取8批六神曲每天发酵样品,分别测定其中淀粉酶、糖化酶、蛋白酶的活力,选择最佳发酵天数。此后选取最佳天数的六神曲进行药效学验证。结果:淀粉酶、糖化酶活力在第4天达到峰值,蛋白酶活力到第5天达到峰值,以第4天样品进行药效学研究发现其对小鼠肠胃运动有显著影响,同时能显著升高食积模型小鼠的胃泌素、胆碱酯酶含量,降低血清NO含量。结论:六神曲发酵第4天,综合酶活力较高,且经验证有较好的消食作用,因此其最佳发酵时间为第4天左右。     

六神曲炮制工艺研究

以饥饿小鼠胃中游离酸、总酸含量、胃蛋白酶活性和胃肠推进功能为指标,对六神曲生品和不同炮制品进行了比较,初步认为用于健脾消食以麸炒或炒焦为好。     

六神曲不同的制备工艺对其淀粉酶活力的影响

目的:优化六神曲的制备工艺。方法:采用单因素试验,以六神曲的淀粉酶活力为评价指标,考察发酵时间及原料药的拌曲工艺等因素对六神曲淀粉酶活力的影响;同时将最优制备工艺所制六神曲与市售六神曲的优品和劣品从淀粉酶活力、可溶性淀粉量、可溶性多糖量3个方面进行对比。结果:最佳发酵时间为7 d;赤小豆的最佳处理方法为煮烂拌曲;青蒿、辣蓼、苍耳草的最佳添加方式为以鲜品水煎液混合均匀后拌曲,发酵后六神曲的酶活力可达49.372 mg.min-1.g-1,可溶性淀粉含量可达7.967%,可溶性多糖含量可达16.65%,明显高于市售的2种六神曲。结论:六神曲的最优制备工艺为将赤小豆粉碎后,加入面粉、苦杏仁粉末混合均匀,陆续加入青蒿、辣蓼、苍耳草的鲜品水煎液混合均匀后拌曲,发酵时间为7 d。     

鲜干品组方及不同制法六神曲中消化酶活力的动态检测及分析

目的:探讨青蒿等鲜干品组方及不同制法对六神曲中脂肪酶、淀粉酶活力的影响及其动态变化规律,为六神曲发酵工艺优化及青蒿等鲜干品可能的入药机制分析提供依据。方法:通过拆方研究,制备6组六神曲样品,第1组为基本组(面粉、赤小豆、苦杏仁),第2~3组为鲜品组(基本组+鲜品榨汁、煎汁),第4~6组为干品组(基本组+干品1/3量煎汁,全量煎汁,1/3量粉碎拌料)。各组分别在28,33℃条件下自然发酵,保持湿度70%~80%,发酵时间10 d,逐日动态取样,置于40℃下干燥后待测。动态测定不同温度下各组发酵样品中脂肪酶和淀粉酶的活力。结果:六神曲样品在28℃条件下发酵并不充分;在33℃条件下发酵,脂肪酶、淀粉酶活力在第3~4天达到峰值,基本组与2个鲜品组消化酶活力均明显高于干品组,差异具有显著性,基本组与鲜品组之间差异无显著性。结论:以脂肪酶、淀粉酶活力为检测指标,六神曲33℃发酵优于28℃发酵,青蒿等鲜品入药优于干品入药,鲜品煎汁组优于鲜品榨汁组;六神曲发酵时间以3~5 d为宜。     

六神曲酶活性研究进展

六神曲为临床常用曲剂,其含有丰富的维生素B 复合体、消化酶、挥发油等多种成分,具有健脾和胃、消食调中等功效,临床多用于饮食停滞、脾胃虚弱、小儿食积及胸痞腹胀的治疗,应用广泛。目前,关于六神曲的研究主要包括制作工艺及质量标准的建立等方面。以六神曲的应用为基础,对近年来关于六神曲酶活性及测定方法等方面的研究进展进行梳理,旨在为六神曲的深入研究提供参考。     

基于抗凝血活性的丹红注射液生物效价测定方法的建立

目的 以凝血酶时间(thrombin time,TT)为指标,建立丹红注射液(Danhong Injection,DHI)抗凝血生物效价测定方法,以评价其质量。方法 收集10批次合格DHI,同时采用光照、高温、暴露进行稳定性加速处理,共得样品40批。工作参照物的制备采用丹酚酸B、羟基红花黄色素A与辅料1∶1∶8混合,并调制成40 mg/mL。按照“量反应平行线(3.3)法”设计抗凝血活性测定实验,所用的血浆为4只家兔等比混合的血浆,药物剂间距为1∶0.8,半自动凝血分析仪测定TT值,对线性关系、可靠性、精密度、重复性、稳定性进行考察,优化并确定检测条件,即反应体系为100μL血浆+工作参照物或样品溶液50μL+凝血酶试剂100μL,对样品开展生物效价检测。结果 工作参照物和DHI在20～40 mg/mL时,与TT值线性关系良好,r值分别为0.982 7、0.969 6。生物效价结果表明工作参照物和合格的DHI均具有显著的抗凝血活性,且结果能通过可靠性检验,10批次DHI的效价值范围为3700～4300 U/mL;与加速处理的样品生物效价测定结果比较,暴露、光照处理DHI样品可被全部检出...     

基于成分-药效对比分析鸡内金不同给药形式对功能性消化不良大鼠的疗效差异

基于现代分析技术和功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)大鼠模型系统评价鸡内金不同入药形式化学成分和药效的差异性,为鸡内金消食功效物质基础提供依据。分别测定鸡内金散剂和汤剂蛋白质、酶、多糖、氨基酸及黄酮类成分,散剂和汤剂总蛋白分别为0.06%、0.65%;散剂胃蛋白酶和淀粉酶活力效价分别为27.03、44.05 U·mg^-1;汤剂多糖为0.03%,散剂中未检出多糖;散剂和汤剂中L型氨基酸总量分别为279.81、8.27 mg·g^-1;总黄酮质量分数为59.51μg·g^-1,汤剂未能检测出酶和黄酮类成分。散剂可明显降低体外营养糊黏度,而汤剂与空白组对营养糊黏度降低无明显作用。采用碘乙酰胺灌胃结合不规则饮食法制备FD大鼠模型,结果显示,散剂和汤剂均可显著提高大鼠胃排空作用、小肠推进率、消化酶活力、血清胃泌素(gastrin, GAS)、胃动素(motilin, MTL)、饥饿素(ghrelin, GHRL)水平,显著降低血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide、VI...     

小半夏汤对化疗小鼠胃排空和小肠推进异常的改善作用

目的 :观察小半夏汤对正常小鼠和化疗模型小鼠胃残留率和小肠推进率的影响,从胃肠动力角度初步探讨小半夏汤防治化疗性恶心呕吐的机制。方法:小半夏汤给正常小鼠连续灌胃给药7 d后,灌胃营养性半固体糊,测定胃残留率和小肠推进率;小半夏汤连续给小鼠灌胃7 d,从灌胃第4天起腹腔注射顺铂2 mg/kg,连续注射4 d,灌胃营养性半固体糊,测定胃残留率和小肠推进率。结果:小半夏汤对正常小鼠胃残留率和小肠推进率均无明显影响(P0.05)。与正常对照组比较,顺铂模型小鼠胃残留率显著升高(P0.01),小肠推进率显著加快(P0.001);小半夏汤高剂量可使模型动物胃残留率显著降低(P0.01),小半夏汤中、低剂量有使胃残留率降低的趋势,但无统计学意义;小半夏汤低、中剂量可显著抑制模型动物小肠推进亢进(分别P0.001、P0.05),而大剂量只有抑制趋势(P0.05)。结论 :小半夏汤对正常生理状态小鼠的胃排空和小肠推进无明显影响;对顺铂所致的胃排空延缓和小肠推进亢进具有显著改善作用。     

六神曲的质量调查与评价研究

目的调查六神曲的质量现状,完善其质量评价方法。方法对六神曲的文献研究、市场调研及对各地六神曲样品的外观性状、显微特征及酶活力进行比较分析。结果各地药品标准中六神曲的制作工艺要求不一,差异主要体现在原料配比与生产条件上;市场六神曲的产品来源有4种,少数源自正规厂家,多数来自小作坊,其发酵制作缺乏规范,生产加工的随意性较大;不同产地的六神曲外观性状差别主要体现在颜色、质地、表面和断面特征上;各地六神曲粉末显微特征鉴别大多含有麦麸的单细胞非腺毛与种皮珠心残余细胞,多数缺乏苦杏仁的石细胞,部分缺乏赤小豆的栅状细胞及脐点裂隙状淀粉粒;淀粉酶活力有显著差异。结论六神曲市场待规范,其质量评价体系待完善。     

茯苓对正常小鼠胃肠功能的影响

目的：采用不同模型考察茯苓对正常小鼠胃肠功能的影响。方法：采用炭末法和营养型半固体糊两种方法,考察茯苓不同给药时间对小鼠胃残留率和小肠推进率的影响。结果：茯苓水煎液对正常小鼠的胃残留、小肠推进具有抑制作用。结论：茯苓水煎液对正常小鼠胃肠运动有抑制作用,而且采用多次给药的营养半固体糊方法评价茯苓对小鼠胃肠功能影响较佳。     

北冬虫夏草多肽酶解工艺及对小鼠免疫功能的影响

目的研究北冬虫夏草多肽的酶解提取工艺及对小鼠免疫功能的影响。方法选用胃蛋白酶和胰蛋白酶,分别采用单酶酶解法和双酶酶解法,按不同酶解条件设计正交试验,通过测定水解度获得最佳水解条件。将小鼠随机分为空白对照组,模型组,北冬虫夏草多肽低(32 mg/kg)、中(160 mg/kg)、高剂量组(800 mg/kg)和阳性药组,连续灌胃45 d,用环磷酰胺在给药结束前5 d通过腹腔注射造模,连续2 d,给药结束后测定各项指标。结果采用胃蛋白酶,水解时间5 h,加酶量2.5%,底物为12%时酶解效果最佳。北冬虫夏草多肽能促进小鼠免疫器官的生长,增加小鼠血液中白细胞的数量,增强绵羊红细胞诱导小鼠足肿胀程度,提高小鼠血清中溶血素的含有量。结论北冬虫夏草多肽具有提高小鼠免疫力的作用。     

生物效价测定法用于活血化瘀中药三棱品质评价的研究

目的:建立三棱抗凝效价的检测方法,以对不同产地三棱药材的活血化瘀效应进行评价;并通过三棱抗凝效价与阿魏酸、总黄酮含量之间的相关性分析,探究三校抗凝活性的物质基础.方法:采用活化部分凝血活酶时间(APTT)测定不同产地三棱药材的抗凝血时间,运用“量反应平行线法”(3,3)法计算三棱抗凝效价;运用Pearson相关分析法计算三棱抗凝效价与化学成分之间的相关度.结果:三棱对照药材量效之间具有良好的线性关系(Y=172.76X-193.39,R2=0.995 5),该方法的精密度(RSD 4.7％)、重复性(RSD 2.3％)、中间精密度(RSD 5.4％)较好,测得不同产地三棱药材抗凝效价为52.33～238.58 U·g-1,并全部通过可靠性检验;相关性分析结果表明三棱抗凝效价与2种化学成分含量之间无显著性相关.结论:本实验所建立的生物效价检测方法可以作为三棱品质评价的方法之一.     

六神曲对实验动物肠道运动功能的影响

目的:观察不同产地和不同炮制方式的六神曲对实验动物肠运动功能的作用。方法:取用生、炒香、炒焦,三个状态的山东产六神曲和自制的未经发酵的六神曲为实验材料,采用离体方法研究实验材料对家兔回肠平滑肌收缩活动的影响;采用在体方法研究实验材料对小鼠肠内容物推进的影响。结果:离体实验结果表明,三种六神曲都能引起大鼠肠平滑肌的收缩作用增强。小鼠肠内容物推进实验结果表明,与模型组比较,三种六神曲都对小鼠肠内容物推进具有提高作用,未经发酵的六神曲作用不明显。结论:六神曲可增强家兔离体回肠平滑肌的收缩和小鼠小肠推进作用。六神曲中促进肠道运动的物质产生于发酵过程中,炮制和煎煮的过程对其影响不大。     

基于抗氧化活性测定的山药品质评价新方法

目的 鉴于一些中药的单一成分检测难以关联其药效进而全面反映其内在品质,本实验建立一种与山药抗氧化活性相关的生物学评价方法,对山药进行品质评价.方法 75％乙醇超声提取不同批次山药样品,DPPH·法测定其抗氧化能力,采用《中国药典》生物检定统计程序BS2000,以“量反应平行线法(2·2)法”对23批山药样品分别与工作对照品S进行效价对比检定和可靠性检验.结果 以6号样品为例可靠性检验结果,回归项及同剂间差异有显著意义(P＜0.01),偏离平行差异不显著(P＞0.05),说明实验设计合理;23批样品的Pr分别为0.29、0.30、0.23、0.70、1.16、0.18、4.27、1.81、0.69、0.11、0.78、0.64、0.55、0.11、0.7、0.44、6.95、0.17、0.49、0.04、0.85、0.35、1.67 U/mg,方法学考察结果,仪器精密度、方法的重复性、样品稳定性RSD值分别为1.29％、4.31％、4.98％.结论 所建立的生物测定法可以对不同批次、不同加工方式的山药样品进行区分,方法学考察结果符合“中药生物活性测定指导原则”相关要求,为山药的品质评价和质量控制研究提供了新思路.