转基因显微注射中的基因装液方法改良

目的 对转基因注射过程中的基因装液方法 进行改良.方法 预先从显微注射针背部装入石蜡油至直管部,再使用可编程微量注射仪从注射针针尖倒吸入基因液.结果 基因液顺利装入显微注射针,后续进行显微注射操作的压力状态稳定,避免溶液回吸.结论 本法简便有效地将注射用基因液装入注射针,确保基因液注入原核,有利于提高转基因注射的成功率.     

小鼠显微操作针的制作技术

目的探讨转基因小鼠制作中显微注射时所用移卵管、持卵针和注射针的最佳制作方案。方法通过酒精灯烧制和手拉以及通过P-97拉针仪设置不同的参数将薄壁硼硅玻璃管拉制成不同口径的移卵管、持卵针和注射针。结果按本方案制作的移卵针,持卵针和注射针用于小鼠受精卵的显微注射,实验过程顺利,效果非常好。结论该方法适用于小鼠受精卵显微注射的移卵管、持卵针和注射针制作。     

显微注射受精时第一极体位置和卵母细胞膜穿破类型对受精和胚胎发育的影响

回顾分析了782个经卵母细胞浆内单精子注射（ICSI）的卵母细胞，第一极体位于12点和6点时，卵母细胞膜穿破方式为显微注射针直接进入胸浆内，卵膜穿破，不形成凹痕（A）及显微注射针进入卵母细胞内，回吸少量胞浆，卵膜在细胞中部穿破，形成轻微的凹痕（B）两种类型时的卵母细胞存活率，卵母细胞受精率和卵裂胚胎的发育质量。结果显示：第一极体位于12点和6点时的卵母细胞存活率，卵母细胞受精率，卵裂胚胎发育质量差异均无显著性，卵母细胞膜穿破方式为A类型时的卵母细胞存活率，卵母细胞受精率，卵裂胚胎发育质量均显著低于B类型组，提示：显微注射受精时的第一极体位置对卵母细胞的受精和卵裂的影响不大，但不同卵母细胞膜穿破类型会影响受精和胚胎发育。     

受精卵原核显微穿刺导入DNA制备转基因兔

目的：受精卵原核显微DNA注射是转基因动物制备的最常用、最可靠的方法．研究技术上更为简易的受精卵原核显微穿刺导入DNA制备转基因兔的可行性．方法：重组转基因载体pCA-CHA,采用细胞原核显微穿刺将DNA导入兔受精卵制备转基因兔，用PCR和Southern Blot方法鉴定转基因兔．结果：转基因处理后获得仔兔92只，以PCR检测结果计算，转基因总效率为1．63%～2．40％，整合率为11．54%～16．13％；以Southern Blot检测结果计算，转基因总效率为0．27％，整合率为1．92％．结论：受精卵原核显微穿刺导入DNA与受精卵原核显微DNA注射制备转基因兔的结果相当．     

小鼠胚胎显微操作针的制备方法

本文结合我们自己制备用于小鼠胚胎显微操作的持卵针(holding pipette)和注射针(injection pipette)的经验,介绍其制备的一些方法和技巧.     

现代玻璃体视网膜显微手术术后的护理干预

随着眼科显微手术技术的迅速发展，以往常规手术方法难以治愈的复杂性视网膜脱离，现在通过玻璃体切割视网膜显微手术，并行眼内填充而获得满意的疗效。而术后实施有效的护理对保证手术成功和提高治愈率有着十分重要的意义。现将128例接受玻璃体视网膜显微手术患的术后护理总结如下。     

显微注射授精技术工具—固定针和注射针的研制

近年来．随着人类生殖医学基础理论研究的深入和新技术的迅速发展、对不育症中一些疑难病症如不射精、无精症、免疫性不育等采用显微授精法进行治疗取得了令人满意的效果。这种方法能从形态上挑选正常精子．再注人到卵细胞内来完成授精过程。使之在遗传学、优生学、生殖控制等方面有深远意义、显微注射用的固定计和注射针的质量，直其影响显微注射技术的成败。因此．研制出高质量的针是顺利完成该技术的关键。我们在较短的时间内，己经成功地自己制备此项技术的用针。现将做法及体会介绍如下。1设备与材料全套设备与耗材均从日本NIKON公司…     

显微注射法和精原干细胞介导法制备乙肝病毒X基因转基因小鼠的方法学比较

目的 探讨经济简便有效的制备转基因小鼠的方法。方法 分别将线形和环状乙肝病毒X基因表达载体pcDNA3-X按常规显微注射入小鼠受精卵。导入假孕雌鼠，同时应用微量注射针将脂质体包裹的pcDNA3-X表达麓体直接注入C57BL／6N小鼠雄性小鼠睾丸的曲细精管内，运用PCR法和免疫组化法对所有转基因仔鼠进行鉴定．比较这两种方法的优缺点．结果 显微注射法繁琐，技术要求高，阳性率相对较高，达16．6％。精原干细胞介导法技术简便．阳性率为6．25％。结论 初步证明用精原干细胞介导法是一种经济简便有效的制备X基因转基因小鼠的方法。     

庚型肝炎病毒全基因转基因小鼠的制备与遗传

目的：利用显微注射方法产生整合庚型肝火病毒（HGV）全基因的转基因小鼠，并研究HGV基因的遗传特性。方法：将含有HGV全长基因的载体线性化后，将目的基因DNA溶于显微注射用缓冲液，依常规方法进行显微注射，得到仔鼠后用PCR及基因组DNA Southern印迹法鉴定。阳性小鼠即为建立者（founder)上鼠，将founder小鼠与正常小鼠交配得到1代小鼠，随后将F1代阳性鼠与正常小鼠交配得到F2代小鼠。结果：共得到5只founder小鼠，其中4只与正常小鼠交配，得到F1代小鼠共41只，其中29只为阳性，阳性率为71％。F2代小鼠共21只，其中16只为阳性，阳性率为76％。结论：得到了整合有HGV全长基因的转基因小鼠，并证明HGV基因可以在转基因小鼠体内稳定传递。     

自动注射针：应急医学现场救援的关键技术措施

自动注射针,一种将药物预先灌封好的由弹簧驱动的能自行完成注药过程的“药械一体化”组合产品,能帮助患者在无医护人员的现场自行完成注射药物过程,是应急医学现场实施自救互救的关键技术措施。美国是自动注射针技术的发明者也是该技术不断创新的领跑者。自动注射针载体技术从最初的战场到现在的民用,经历了挤压式半自动注射针、弹簧式单腔全自动注射针和弹簧式双腔全自动注射针等三大发展过程。现行的弹簧式载体装置共有小规格单腔式、大规格单腔式、液-液型双腔式、液-固型双腔式以及针头回缩式等5种基本类型,与之组合的军用药物主要有阿托品、解磷啶、双复磷、安定和吗啡等以及肾上腺素、利多卡因和舒马曲坦等其他急救药物。所有自动注射针品种均配备有相应的培训或训练专用模拟针。针头自动回缩或自动遮藏技术以及注药始末的提示技术,是自动注射针载体技术重要的研发应用趋势。     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。     

用部分补平法克隆乙型肝炎病毒preS／S基因

目的探讨利用Ｋｌｅｎｏｗ大片段对ＤＮＡ末端作部分补平而使非匹配粘端形成匹配粘端的可行性。方法用 ＢａｍＨＩ、ＸｂａｌＩ消解载体 ｐｃＤＮＡ３,用 ＢｇｌＨ、Ｈｉｎｄ Ⅲ从含乙型肝炎病毒全基因组质粒中切取 ＨＢＶｐｒｅＳ／Ｓ基因片段。 ｐｃＤＮＡ３的 ＸｂａｌＩ及 ｐｒｅＳ／Ｓ基因的 Ｈｉｎｄ Ⅲ切口端经 Ｋｌｅｎｏｗ大片段作部分补平后形成二碱基的互补粘端。连接修饰 后的ｐｒｅＳ／Ｓ基因片段与ｐｃＤＮＡ３并转化后筛选阳性克隆。结果限制性内切酶分析显示ｐｒｅＳ／Ｓ基因被定向克隆于载 体ｐｃＤＮＡ３的预定位点。结论部分补平法是连接非匹配ＤＮＡ粘性末端的较好选择。     

异种肝移植模型-转人CD59蛋白基因小鼠的建立

目的　通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD5 9蛋白的转基因小鼠模型。方法　实验中利用OMT作为目的基因hCD5 9cDNA的启动子 ,CMV作为报告基因GFP的启动子 ,构建重组质粒 pGOC。通过显微注射法 ,把CMV GFP OMT CD5 9基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果　产生出 86只F0 代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测 ,12只阳性 ,进一步用Southernblot法检测 1只阳性。结论　通过显微注射法 ,外源基因hCD5 9cDNA在小鼠基因组中得到整合 ,产生出了阳性转人CD5 9蛋白基因小鼠 ,可用于进一步异种移植研究     

人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立

目的 建立人乙型肝炎病毒ｘ（ＨＢｘ）基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠,用分子杂交法鉴定转基因小鼠ＨＢｘ的整合与表达。结果 建立了人ＨＢｘ的基因转基因小鼠模型。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定得到１７只转基因首建鼠。逢肝脏提取总ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,结果显示１７只首建鼠肝脏中均有ＨＢｘ表达。结论 为从整体水平研究慢性乙肝炎患者诱发肝癌的作用机制及ＨＢｘ的反式激活作用机制提供了     

小鼠受精卵显微注射影响因素的体外研究

目的:利用体外培养探讨受精卵显微注射的影响因素的作用。方法:获取小鼠受精卵,在其他条件固定的情况下,分别比较不同的注射基因浓度,在CZB(加HEPES)操作液中显微操作时间以及注射前受精卵的质量对显微注射后的胚胎体外培养结果的影响。结果:基因浓度越高,受精卵发育越差,操作时间不同的卵发育无明显差异,质量好的受精卵发育较好,质量差的几乎不发育。结论:选用较低的基因浓度,良好的操作介质CZB(加HEPES),使用质量好的受精卵,会提高显微注射的效率。     

胆固醇酯转移蛋白转基因家兔制作及生物学特性分析

摘要: 目的 制作肝脏特异性高表达人胆固醇酯转移蛋白（CETP）转基因家兔并对其生物学特性分析进行分析。方法 利用显微注射方法制作CETP转基因家兔,利用Western Blot、Real-time PCR和CETP活性鉴定试剂盒鉴定模型家兔中人CETP转基因的表达和活性。结果 PCR检验结果显示我们成功获得CETP转基因家兔,转基因主要在肝脏特异性表达,其血浆CETP活性相对于非转基因家兔明显升高。结论 本研究首次成功建立了高表达人CETP的转基因家兔,为研究CETP功能和其参与心血管疾病的机制提供了良好模型。     

臂旁内侧核区微量注射羟基马桑毒素二小时的神经组织学研究

目的观察臂旁内侧核区微量注射羟基马桑毒素后的神经组织有无毁损.方法在注药后2小时,动物出现了非常明显的呼吸效应且机能状态良好时灌注固定,分别取材做光镜(Nissl法染色) 和透射电镜标本切片,观察拍照.结果在光镜和电镜下观察,未见NPBM 区注射羟基马桑毒素后神经组织有明显的毁损表现,与对侧等量注射生理盐水比较也未发现明显差异.结论在本实验条件下,羟基马桑毒素对臂旁内侧核区的呼吸神经元无毁损作用.     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.     

臂旁内侧核区微量注射羟基马桑毒素二小时的神经组织学研究

目的：观察臂旁内侧核区微量注射羟基马桑毒素后的神经组织有无毁损，方法，在注药后2小时，动物出现了非常明显的呼吸效应且机能状态良好时灌注固定，分别取材做光镜（Nissl法染色）和透射电镜标本切片，观察拍照。结果：在光镜和电镜下观察，未见NPBM区注射羟基马桑毒素后神经组织有明显的毁损表现，与对侧等量注射生理盐水比较也未发现明显差异。结论：在本实验条件下，羟基马桑毒素对臂旁内侧核区的呼吸神经元无毁损作用。