日本血吸虫亲免素基因的扩增及序列分析

\t\t\t\t\t  目的  \t\t\t\t\t扩增、原核克隆和表达日本血吸虫(Sj)p50亲免素基因全长cDNA, 并进行表达产物的纯化.\t\t\t\t\t  方法  \t\t\t\t\t从成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框后, 将其克隆入pET 30 a(+)原核表达载体中, 异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化.\t\t\t\t\t  结果  \t\t\t\t\t将Sjp50亲免素基因成功克隆入pET 30 a(+)表达载体中; 诱导表达并成功纯化出重组Sjp50亲免素蛋白.\t\t\t\t\t  结论  \t\t\t\t\t成功克隆Sjp50亲免素基因, 并表达和纯化得到了p50亲免素蛋白, 为研究Sjp50亲免素的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础.     

日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚基的序列分析

目的 发现并克隆日本血吸虫新基因。方法 对已获得的日本血吸虫表达序列标签(EST)进行同源性分析。识别血吸虫新基因；根据EST设计引物，用3′RACE从mRNA中扩增获得新基因全长，用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能分析，将新基因的完整编码阅读框克隆入原核表达载体pGEX一4T—1。结果 用3′RACE获得一个EST的3′端所缺序列，得到完整编码阅读框，其开放阅读框((ORF)654bp，编码217个氨基酸。利用生物信息学技术确定其为日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定，证明日本血吸虫CKⅡβ原核表达质粒构建成功。结论 扩增并成功克隆日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位编码基因的全长cDNA。为进一步的功能研究打下基础。     

日本血吸虫组织蛋白酶L家族1个新基因的克隆与序列分析

目的克隆与分析日本血吸虫组织蛋白酶L样(SjCLs)基因全长cDNA序列,为进一步研究其功能奠定基础。方法提取日本血吸虫成虫总RNA,经RT-PCR扩增获得cDNA序列;将目的片段连接至pMD18-T Simple载体上,连接产物转化大肠埃希菌,通过酶切和测序鉴定重组质粒;利用生物信息学软件分析序列的开放阅读框、蛋白序列的同源率和功能区。结果以成虫总RNA为模板进行RT-PCR,得到一段长为996 bp的cDNA片段,该片段含有完整读码框,该阅读框编码的蛋白含有331个氨基酸残基,分子量为38.3 kDa,命名为SjCLs;序列比对分析发现该蛋白氨基酸序列与SjCL2同源率最高,达到89.1%;进化树分析发现SjCLs与SjCL2亲缘关系也最近;SjCLs具有类似于SjCL2的N端信号肽,可能经加工后分泌到细胞外;两者所预测的功能基序及三维构象也基本相同。结论 SjCLs具有组织蛋白酶L的基本特征,从而证明研究获得组织蛋白酶L基因家族的一个新成员。     

日本血吸虫p 50亲免素基因克隆、表达及纯化

目的扩增、原核克隆和表达日本血吸虫（Sj）p50亲免素基因全长cDNA，并进行表达产物的纯化。方法从成虫RNA中RT-PCR扩增Sjp50亲免素基因完整的编码阅读框后，将其克隆入pET 30a（＋）原核表达载体中，异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导高表达后用亲和层析柱对表达产物进行纯化。结果将Sjp50亲免素基因成功克隆入pET 30a（＋）表达载体中；诱导表达并成功纯化出重组Sjp50亲免素蛋白。结论成功克隆sjp50亲免素基因，并表达和纯化得到了p50亲免素蛋白，为研究Sip50亲免素的功能及其进行疫苗等研究奠定了基础。     

日本血吸虫微管蛋白基因的分离和cDNA序列分析

目的 分离和鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行引物步移法测序，获取其全长cDNA序列；采用生物信息学等技术对该cDNA序列进行开放阅读框(ORF)的寻找、编码氨基酸的推导、核苷酸和氨基酸同源性比较以及蛋白质二级结构的初步预测。结果获得了1个日本血吸虫新基因—微管蛋白基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子量为7．2198KDa，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论 获得了日本血吸虫微管蛋白基因的全长cDNA序列，为该基因功能的实验性鉴定工作奠定基础。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的获得和序列分析

目的 从日本血吸虫(Schistosoma japonlcum，Sj)成虫cDNA文库中筛选日本血吸虫新基因，为日本血吸虫病的诊断或防治提供靶抗原。方法 筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，随机挑取重组阳性克隆进行DNA测序，再对新基因序列进行步移法测序获取全长cDNA，并利用生物信息学技术对其进行分析。结果 获得了1个新基因，其cDNA全长1251bp(AY225190)，编码331个氨基酸，编码蛋白与人类或螈、蟾蜍、鸡、鼠及猪等其它生物的乳酸脱氢酶高度同源。结论 利用表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术三者相结合，成功获得了编码日本血吸虫乳酸脱氢酶基因的cDNA全长序列。     

多聚酶链式反应扩增日本血吸虫基因组DNA重复序列

目的：探索日本血吸虫基因组内是否存在DNA重复序列。方法：分别根据曼氏血吸虫基因组特异的DNA重复序列单位Sm1-7和埃及血吸虫基因组特异的DNA重复序列单位The Dral Repeat设计并合成了寡核苷酸引物，然后以日本血吸虫基因组DNA为模板，用自备的多达12种的反应缓冲液进行多聚酶链式反应（PCR）优化扩增。结果：分别成功地从日本血吸虫基因组中扩增出与曼氏血吸虫基因组特异的DNA重复序列单位Sm1-7和埃及血吸虫基因组“特异的”DNA重复序列单位The Dral Repeat同源的DNA重复序列。PCR反应提示该两种重复序列在日本血吸虫基因组内的拷贝数均较低。同时，日本血吸虫与曼氏血吸虫表现出较好的同源性。结论：日本血吸虫基因组内可能存在着长度为121bp的DNA重复序列，进一步确认尚有赖于DNA序列测定。     

日本血吸虫31／32KDa蛋白质基因扩增及克隆

目的 克隆日本血吸虫３１／３２ＫＤａ蛋白质的编码基因，用于血吸虫病免疫诊断和预防，方法 以日本血吸虫成虫ＲＮＡ为模板逆转录合成ｃＤＮＡ链，参照Ｓ．ｍ３１／３２编码序列设计合成引物，用ＰＣＲ法扩增３１／３２ＫＤａ蛋白质基因编码序列，将其克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ载体。并用双酶切和以质粒为模板的ＰＣＲ进行鉴定。结果 ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一条约１２７０ｂｐ大小的特异性条带，重组质粒的双酶切和以质粒为模板的ＰＣＲ均     

日本血吸虫未知功能基因SJFCE3549的克隆及生物信息学分析

目的克隆与日本血吸虫未知功能的新基因SJFCE3549,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其功能。方法应用PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增SJFCE3549基因全长ORF,将其亚克隆到真核表达载体pCMV-Tag2A中,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定。应用生物信息学初步分析其细胞定位、蛋白序列、结构域及功能。结果获得日本血吸虫未知功能基因的克隆SJFCE3549,序列分析结果提示该cDNA序列含有一个453 bp的完整阅读框序列,编码150个氨基酸,其编码蛋白的理论分子量为16.67 kDa,等电点为6.28。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论成功地克隆了日本血吸虫基因SJFCE3549全长ORF,构建了其pCMV-Tag2A真核表达载体,为进一步研究其结构与功能创造了条件。     

日本血吸虫性别特异性候选基因的生物信息学分析

目的运用生物信息学方法对日本血吸虫性别特异性候选基因SJCHGCD6309（登录号为AY813032）进行分析,为该基因的进一步研究奠定基础。方法利用“数据库消减杂交”（DigitalDifferentialDisplay,DDD）方法筛选出在日本血吸虫雄虫中特异表达的候选基因AY813032,使用生物信息学软件分析该基因的开放阅读框（ORF）,细胞定位、蛋白序列等特征,并预测该基因的结构和功能。结果AY813032蛋白由287个氨基酸编码,属于Cwfl5／Cwcl5结构域家族,定位于细胞核,有8个磷酸化位点,理论等电点（pI）为5．10,分子量为32．17kDa,该蛋白在日本与曼氏血吸虫之间具有较高保守性。结论AY813032基因为日本血吸虫性别特异性候选基因,可能与日本血吸虫性别发育相关。     

青蒿琥酯作用后日本血吸虫童虫蛋白质组学分析

目的探讨青蒿琥酯处理前后日本血吸虫童虫蛋白质组的差异表达,研究青蒿琥酯抗日本血吸虫的分子机制。方法新西兰兔经贴片法感染日本血吸虫尾蚴（2000条／只）第7天一次性灌服青蒿琥酯（实验组,8mg／kg）和1％羧甲基纤维素钠（对照组）,第10天经肝门静脉系统灌流收集童虫,观察虫体形态,提取总蛋白。应用同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ技术）鉴定青蒿琥酯处理前后13本血吸虫童虫的差异蛋白质组,通过数据库检索和生物信息学分析差异表达的蛋白质。结果青蓠琥酯处理后日本血吸虫童虫与对照组相比,形态较为粗短细小,并存在明显的发育不良或畸形。iTRAQ技术检测显示,处理后的血吸虫童虫有75个（含3个未知蛋白）蛋白存在明显表达差异。其中表达量上调的蛋白23个,下调的蛋白52个。结论差异表达的蛋白主要参与了童虫的代谢、生物调节和细胞稳态等过程,同时与应激、细胞组织和生成等密切相关。     

日本血吸虫再感染危险因素的探讨

目的 探讨山丘型疫区日本血吸虫再感染的有关危险因素。方法 选取一山丘型疫区,随访观察居民吡喹酮普治后疫水接触及血吸虫再感染状况,对可能影响血吸虫再感染的有关因素进行非条件logistic回归分析。结果 多因素非条件logistic回归分析结果显示再感染与下列因素有关:化疗前每克粪便虫卵数(OR=2.066,95％CI:1.173～3.639),性别(OR=4.260,95％CI:1.275～14.235),4～10月份疫水接触平均指数B(OR=1.138,95％CI:1.045～1.240),性别与4～10月疫水接触平均指数B间的交互作用(OR=0.875,95％CI:0.817-0.982)。结论 性别、化疗前感染度、疫水接触的持续时间及暴露面积与再感染的发生有关,其中性别与疫水接触之间尚存在弱的拮抗作用。     

日本血吸虫尾蚴及童虫可溶性抗原蛋白质组研究

应用免疫蛋白质组研究方法筛选、鉴定日本血吸虫尾蚴、童虫可溶性抗原蛋白质。方法日本血吸虫尾蚴可溶性粗抗原(SCAP)、童虫可溶性粗抗原(SLAP)分别用双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白质，每样本同时制3块胶，1块胶进行银染，2块胶通过电转印后再分别用感染兔和正常兔血清作Western印迹分析，确定特异性阳性反应点，再从相...     

血吸虫不同感染频次对宿主肝纤维化程度的影响

目的以等量血吸虫尾蚴分别进行1次性和分2次、3次、4次感染4组小鼠,建立小鼠血吸虫感染模型,观察不同感染频次对肝纤维化程度的影响。方法通过肝脾指数来判断肝损害程度;化学发光法检测血清中透明质酸（HA）;病理切片HE染色观察胶原沉积、纤维形成情况和形成率。结果 1次性感染组肝纤维化形成率及纤维化程度不高,肝损害较轻;2次以上感染组,18周后所有小鼠均有肝脏纤维化的形成,纤维化程度与感染频次呈正相关,肝损害程度随感染频次增加而加重。结论血吸虫反复感染可导致患者严重肝损害,患者一旦被血吸虫尾蚴感染应及时治疗,避免反复多次感染。     

日本血吸虫成虫吡喹酮用药前后差异表达序列的筛选

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建吡喹酮治疗日本血吸虫感染新西兰大白兔前后肝脏内差减cDNA文库,为筛选吡喹酮治疗过程中日本血吸虫体内药物反应分子靶标奠定基础。方法日本血吸虫感染新西兰大白兔,吡喹酮治疗者为实验组,未经吡喹酮治疗者为对照组,应用PCRSelectcDNASubtraction试剂盒进行SSH分析,分别构建正向和反向消减cDNA文库,对文库进行筛选,挑取阳性克隆测序获得差异表达EST或新EST,并进行生物信息学分析。结果从2个消减文库中共筛选到39个有效阳性克隆,其中正向文库22个,反向文库17个,分析表明这些EST编码主要是一些酶及与蛋白质合成和降解相关的蛋白质。结论成功构建日本血吸虫成虫吡喹酮治疗前后消减文库,为进一步研究吡喹酮治疗血吸虫病的分子机制奠定了基础。     

日本血吸虫卵计量变异的模型建立与参数估计

目的建立虫卵计量变异的随机模型,并估计描述虫卵计量变异特征的参数。方法随机模型把人群中虫卵计量总变异分成两个来源：①虫卵计量在个体间的变异;②个体内虫卵计量的变异。用具有重复虫卵计数的实际资料对模型的参数进行估计。结果参数Ｍ、ｒ值在各年龄组中不同,ｋ值在各年龄组中近于相同;ｒ和Ｍ值的最佳年龄分割点分别为８和１２岁;模型Ｅ中假定ｋ值在各年龄组中相同,ｒ值在２～７岁和８岁以上年龄组间不同,Ｍ值在２～１１岁和１２岁以上年龄组间不同,ＡＩＣ值最小。结论年龄可能为影响Ｍ,ｒ值的重要因素,模型Ｅ为最佳模型