联合IDH1、1p/19q和ATRX对胶质瘤分子分型的临床意义

目的探讨联合异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）、1号染色体短臂和19号染色体长臂（1p/19q）和α-地中海贫血/智力低下综合征X染色体连锁基因（ATRX）对胶质瘤分子分型的临床意义。方法回顾经术后病理证实的104例胶质瘤患者的临床及组织病理资料,采用免疫组织化学法对其存档病理组织蜡块进行IDH1突变、ATRX表达缺失检测,采用荧光原位杂交法检测1p/19q缺失情况,通过门诊复查和电话等方式随访患者的术后生存情况,联合IDH1、1p/19q和ATRX将胶质瘤患者进行分子分型（A型:IDH1突变,1p/19q缺失;B型:IDH1突变,1p/19q完整;C型:IDH1野生,ATRX突变;D型:IDH1野生,ATRX野生）,并分析不同分子分型患者临床病理特征及预后间的差异。结果联合分子分型与胶质瘤患者的年龄、组织学分级、卡氏功能状态（KPS）评分与病理分型均有关（P<0.05）,其中与病理学分型的相关性最大,而与性别、肿瘤部位和肿瘤大小无关（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析结果显示,4组分子分型的胶质瘤患者术后总生存期差异显著（Log-Rank:χ2=31.631,P<0.001）,其中B型患者的中位生存期最长,D型患者中位生存期最短。COX风险回归分析显示,胶质瘤患者的预后与患者年龄、组织学分级、KPS评分、病理分型、IDH1、ATRX、联合分子分型和治疗方案均独立相关（P<0.05）,而与患者性别、肿瘤部位、大小和1p/19q缺失无关（P>0.05）。结论联合IDH1突变、1p/19q杂合缺失和ATRX突变对胶质瘤患者进行分子分型,有助于临床诊断,还可能为患者术后生存情况提供参考。     

电离辐射对沉默ATRX的HeLa细胞DNA损伤修复的影响

目的：靶向沉默宫颈癌HeLa细胞中α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色相关蛋白（ATRX）,检测电离辐射对ATRX、γH2AX和Rad51蛋白表达及γH2AX和Rad51焦点数的影响,探讨ATRX参与辐射后HeLa细胞DNA损伤修复的作用。方法： 3条ATRX-shRNA和阴性对照（Control-shRNA）的慢病毒载体转染293T细胞,收集慢病毒并感染HeLa细胞,利用puromycin筛选获得稳定沉默ATRX的细胞系,分别命名为shA₁-HeLa、shA₂-HeLa、shA₃-HeLa和shCon-HeLa,采用Western blotting法检测沉默ATRX效率以及电离辐射后ATRX、γH2AX和Rad51蛋白的表达,采用免疫荧光技术观察shCon-HeLa和shA₁-HeLa组中γH2AX和Rad51焦点并计数其数量。结果： shCon-HeLa细胞中可见ATRX蛋白表达,而shA₁-HeLa、shA₂-HeLa和shA₃-HeLa细胞中均无ATRX蛋白表达,表明沉默效率较高。在2和8 Gy剂量照射后1、6和24 h,shCon-HeLa组ATRX蛋白表达量逐渐升高,24 h时表达量最高,且8 Gy照射后1、6和24 h表达量均较高。4 Gy照射后0~6 h,与shCon-HeLa组比较,shA₁-HeLa组γH2AX焦点数在1 h明显升高（P<0.05）,而后逐渐降低,但在6 h焦点数仍明显高于shCon-HeLa组（P<0.01）;Rad51焦点数与γH2AX焦点数变化相一致,与shCon-HeLa组比较,shA₁-HeLa组Rad51焦点数在1 h明显升高（P<0.05）,在6 h时shA₁-HeLa焦点数仍明显高于shCon-HeLa组（P<0.01）。4 Gy照射后0~16 h,shA₁-HeLa组细胞中γH2AX和Rad51蛋白表达量均较shCon-HeLa组增加。结论：成功获得稳定沉默ATRX的HeLa细胞模型,电离辐射可诱导ATRX蛋白表达量增加,且沉默ATRX的HeLa细胞中γH2AX和Rad51焦点数及蛋白表达量均高于对照组,提示ATRX参与了辐射诱导的DNA损伤修复过程。     

先天性智能发育不全患儿的细胞遗传学研究

用低叶酸培养基（ＴＣ１９９）对９０例先天性智能发育不全（ＭＲ）患儿的外周血淋巴细胞进行了Ｇ显带分析及脆性Ｘ染色体研究。发现１９例染色体异常患者，占２１．１１％。其中先天愚型１４例，占１５．５６％；其它常染色体结构异常２例；性染色体异常１例；脆性Ｘ染色体２例，占２．２２％。结果表明对ＭＲ进行细胞遗传学研究时，不仅要注意染色体数目及结构的异常，尤应进行脆性Ｘ染色体的检测。本文首次证明脆性Ｘ综合征在本地区的存在，在ＭＲ中所占的比例与国外报道大致相同。脆性Ｘ染色体的诱导方法进行了讨论。还发现１例ＭＲ患儿，核型为４６，ＸＹ，ｔ（５；１５）（ｐ１５；ｑ１３），经鉴定为世界首报核型。     

羟基脲联合辐射对沉默ATRX后细胞周期及凋亡的影响

目的:探讨羟基脲(HU)联合辐射对沉默α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关蛋白(ATRX)后A549细胞周期和凋亡的影响,并阐明其可能的分子机制。方法:建立稳定沉默ATRX的A549细胞模型(shATRX-A549),荧光显微镜下观察细胞感染情况,采用Western blotting法检测沉默ATRX细胞中ATRX蛋白表达量验证细胞模型,以shNC-A549细胞作为阴性对照。实验分为对照组、HU组、辐射组(给予8 Gy X射线辐射)和HU+辐射组(给予HU+8 Gy X射线辐射)。流式细胞术检测各组不同细胞周期细胞百分率和细胞凋亡率,采用RNA测序(RNAseq)检测沉默ATRX后各组细胞中mRNA表达,采用Western blotting法检测各组细胞中细胞分裂周期因子(CDC25B)、细胞周期蛋白(Cyclin) B1和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1)蛋白表达量。结果:荧光显微下可见shNC-A549和shATRX-A549细胞表达绿色荧光蛋白(GFP);Western blotting法检测,与shNC-A549细胞比较,shATRX-A549细胞中ATRX蛋白表...     

垂体瘤转化基因反义寡核苷酸抑制胶质瘤增殖的实验研究

目的 观察垂体瘤转化基因(pituitary tumortr ansforming gene,PTTG)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对恶性胶质瘤增殖的抑制作用.方法 将C6胶质瘤细胞接种于大鼠右侧尾状核.按照不同的PTTG反义寡核苷酸浓度在选定的时间点立体定向原位注射于肿瘤区域.3周后处死大鼠,取标本做GFAP、PTTG、PCNA免疫组化染色.结果 不同浓度的PTTG-ASODN对C6胶质瘤模型的增殖抑制呈时间、浓度依赖性,而且高浓度,早期应用,反复应用PTTG-ASODN抑制胶质瘤模型肿瘤增殖的效果明显.结论 PTTG-ASODN可以抑制胶质瘤的增殖,有望成为胶质瘤基因治疗的一种新策略.     

人脑胶质瘤P73等位基因缺失及转录水平的实验研究

目的 :探讨P73等位基因缺失及转录水平是否与胶质瘤发生有关。方法 :运用DNA限制性酶切片段长度多态性 ,在 5 6例胶质瘤 正常组织标本对中进行P73等位基因杂合子的鉴定并确定胶质瘤中P73等位基因杂合性缺失率 ;运用半定量RT PCR分析P73 mRNA在胶质瘤中的相对表达水平。结果 :胶质瘤中P73等位基因杂合性缺失率为 14 .3 % ;胶质瘤与正常对照中P73 mRNA的表达水平无显著差别。结论 :人脑胶质瘤的发生可能与P73基因异常无关。     

番茄红素抑制人脑胶质瘤U251细胞生长的实验研究

目的探讨番茄红素对体外培养的人脑胶质瘤U251细胞增殖及诱导凋亡的作用。方法用CCK-8法检测不同浓度番茄红素作用于U251细胞24h、48h及72h后细胞的存活率;应用流式细胞术（FCM）检测细胞周期。结果番茄红素能抑制人脑胶质瘤U251细胞的生长,呈量-效及时-效关系（P〈0．01）;FCM检测表明,细胞主要被阻滞在G0／G1期;番茄红素诱导细胞凋亡率较对照组明显增加（P〈0．01）,具有浓度依赖性。结论番茄红素能抑制U251细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

靶向沉默ATRX对辐射诱导宫颈癌HeLa细胞周期阻滞和凋亡的作用

目的:靶向沉默HeLa细胞中α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色相关蛋白(ATRX),探讨其对辐射诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡的作用.方法:利用RNA干扰(RNAi)技术建立稳定沉默ATRX的HeLa细胞模型,命名为shATRX1-HeLa,以shCon-HeLa为阴性对照.分别给予0、2和8 Gy X射线照射后,...     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

白介素-24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究

目的探讨白介素-24基因转染对胶质瘤生长的影响。方法将载有人白介素-24eDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对该细胞系生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测其凋亡和Bax／Bel-2的表达情况。结果Ad5F35-IL24感染U251细胞和肿瘤组织后,IL-24蛋白高表达,U251细胞和组织的生长受到明显抑制,其凋亡率明显升高,Bax／Bel-2也明显升高。结论白介素-24具有抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5P35-IL24转导白介素-24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。     

靶向IGF-1基因的siRNA抑制胶质瘤生长的体内外实验研究

目的观察靶向IGF-1基因的小干扰RNA（siRNA）在体内和体外对胶质瘤生长的抑制作用。方法采用逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹测定干扰后IGF-1的表达水平；采用Transwell体外侵袭试验进行细胞体外的侵袭力分析；用流式细胞仪检测细胞凋亡率；应用裸鼠成瘤实验测定IGF-1基因表达下调后胶质瘤C6细胞在体内致瘤能力的改变。结果靶向IGF-1基因的siRNA可以有效抑制IGF-1基因的表达，使IGF—1 mRNA表达减少50％～80％，蛋白表达减少60％，流式细胞术检测细胞凋亡率明显提高（P〈0．01），降低了在裸鼠体内成瘤的能力。结论siRNA介导的IGF-1基因下调可明显抑制胶质瘤细胞的生长。IGF-1可以作为胶质瘤基因治疗的一个新的靶点。     

亲细胞非均质分子脂质抑制人脑胶质瘤U87细胞株增殖的实验研究

目的研究亲细胞非均质分子脂质（cytotropic heterogeneous molecular lipid,CHML）对人脑胶质瘤U87细胞增殖的影响及其可能的作用机制。方法不同浓度CHML不同作用时间处理U87细胞后,采用MTT比色法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,Western印迹法检测细胞周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达。结果 CHML作用于U87细胞后,细胞生长受到明显抑制。流式细胞术检测显示,CHML使G0/G1期细胞比例升高,S期和G2/M期细胞比例降低。Annexin V-PI法发现,用药24 h后,U87细胞凋亡比例随着CHM L的浓度升高而上升。Western印迹法检测显示,CHML引起U87细胞的周期相关蛋白Cyclin D1和CDK6表达降低,p21表达升高,凋亡相关蛋白Bax和Caspase 3表达增高,Bcl-2表达下降。结论 CHML可能通过诱导细胞凋亡和G1期细胞周期阻滞抑制U87细胞的增殖。     

小分子干扰RNA靶向抑制suvivin基因诱导U251细胞凋亡的实验研究

目的 构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA（siRNA）表达载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸（19nt）靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点．形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin;采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin—V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示：survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制：流式细胞仪检测结果显示：survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi—l／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达,并明显诱导了U251细胞发生凋亡。     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

Oncol2012: 转染肿瘤抑素（Tumstatin)的U251胶质瘤细胞通过抑制血管生成遏制肿瘤生长的体内外实验研究

背景 血管生成是肿瘤生长的必要条件,尤其在快速生长的肿瘤（如恶性脑胶质瘤）。既往研究表明有很多促血管生成因子和抑制血管生成因子共同控制血管生成的平衡“开关”。其中,内源性血管生成抑制因子,如肿瘤抑素（Tumstatin)近年越来越受到重视。本研究探索脑胶质瘤细胞表达Tumstatin能否抑制血管生成,进而抑制肿瘤生长。方法 我们用脂质体转染法将Tumstatin转染入恶性胶质瘤细胞系U251,并用G418筛选出稳定转染的U251细胞系,并用western blot证实转染成功。在体外用稳定转染的U251细胞上清培养内皮细胞（HUVECs),用MTT法、小管形成实验、流式及动物实验检测Tumstain的生物功能。结果 Tumstatin转染组、空质粒转染组、未转染组U251细胞增殖活性无显著差别;Tumstatin在体外能显著抑制HUVECs的增殖,诱导其凋亡、抑制其形成小管的能力。裸鼠皮下成瘤实验结果显示转染组能明显抑制肿瘤生长,免疫组化结果显示微血管密度明显比空质粒组及未转染组低,但三组见ki67增殖指数无统计学差异。结论 人Tumstatin有抑制U251移植瘤生长的作用,通过抑制肿瘤血管生成可能是其主要机制。     

Gadd45α对绒毛外滋养细胞迁移和侵袭能力影响的相关研究

目的：研究人生长阻滞和DNA损伤45α（growth arrest and DNA damage 45 alpha,Gadd45α）基因对滋养细胞HTR8/SV－neo增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学功能的影响,探讨其在子痫前期（preeclampsia,PE）发生发展中的可能作用。方法：构建Gadd45α短发夹干扰RNA,以阴性对照组作为参照,转染人滋养细胞HTR8/SVneo,即分为实验组（si-Gadd45α）和阴性对照组（si-NC）进行实验;应用流式细胞仪检测转染效率,并应用qRT-PCR和Western blot检测转染后各组细胞中Gadd45α mRNA和蛋白表达水平;采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）显色法检测转染后各组细胞增殖能力;应用流式细胞仪对转染后各组细胞进行细胞凋亡分析;采用Transwell法检测转染后各组细胞迁移和侵袭能力;采用早孕绒毛外植体培养模型观察敲除Gadd45α基因后对绒毛外滋养细胞外生性迁移能力的影响;收集各组细胞培养上清液,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）的表达,蛋白免疫印迹检测基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of MMPs,TIMPs）的表达。结果：流式细胞仪检测转染效率约为 90％;转染后实验组较对照组Gadd45α mRNA的表达量约降低80%,蛋白表达水平约下降70%,差异均有统计学意义（P<0.01）,证明干扰Gadd45α表达成功。MTT法和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,结果显示实验组和对照组细胞增殖和凋亡均无统计学差异（P >0.05）。Transwell实验表明干扰Gadd45α后HTR8/SVneo侵袭能力明显增加,约为对照组的1.65倍;迁移能力也明显增加,约为对照组的2倍,均有统计学差异（P<0.01）。早孕绒毛外植体培养结果显示：与阴性对照组的绒毛相比,Gadd45α干扰片段处理的绒毛外滋养细胞外生性迁移的距离明显增加,差异有统计学意义（P=0.005）。明胶酶谱实验结果显示干扰Gadd45α后基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases,MMP-2）和MMP-9的活性增强,而Western blot检测发现其抑制因子TIMP-1和TIMP-2相应地下降（P<0.01）。结论：推测Gadd45α可能是通过调控蛋白酶的活性来抑制滋养细胞的迁移和侵袭,从而参与PE的发生发展。     

Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制研究

目的 为了探索Bcl2抑制NNK诱导的DNA损伤后修复的分子机制.方法 Western Blotting检测Bcl2、APE1和XRCC1蛋白的表达情况,定量检测AP位点来观察DNA损伤程度,免疫沉淀检测Bcl2蛋白和APE1蛋白,APE1蛋白和XRCC1蛋白相互作用,免疫荧光染色检测Bcl2蛋白的细胞分布情况及其变化,亚细胞结构分离提取蛋白观察Bcl2蛋白在细胞核及线粒体中表达水平及其变化.同位素测定APE1核酸内切酶活性观察Bcl2对APE1核酸内切酶活性的影响及其Bcl2的BH结合域的关系.结果 Bcl2下调APE1核酸内切酶活性与抑制AP住点修复有关.4-(N-甲基-N-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)与细胞接触导致Bcl2在细胞核中积聚,并且与APE1相互作用,这种相互作用需要Bcl2的所有BH结合域参与.Bcl2的BH结合域的任一缺失导致Bcl2与APE1相互作用的能力和对APE1活性、AP位点修复的抑制作用消失.Bcl2在细胞中的过度表达减少了APE1/XRCC1修复复合物的形成,并且Bcl2纯蛋白在体外直接使APE1/XRCC1复合物分裂从而抑制APE1核酸内切酶活性.结论 Bcl2蛋白下调APE1核酸内切酶活性抑制NNK诱导的DNA损伤后AP位点的修复.