葛根总黄酮对过氧化氢所致PC12胞氧化损伤的防护

背景：葛根具有防治高血压、心脏病、糖尿病和血液病等多种生物学功效，其提取物对S180肉瘤及Lewis肺癌的增殖有一定抑制作用。目的：观察葛根总黄酮对嗜铬细胞瘤细胞PC12细胞生长的影响和抗过氧化氢所致细胞氧化损伤的防护作用。设计：完全随机分组设计，对照实验。单位：解放军总医院生化科和老年病研究所。材料：葛根购自同仁堂药店，由本实验室用乙醇、乙酸乙酯按常规提取分离提纯葛根总黄酮，用理化方法和薄层色谱进行鉴定，定量测定提取物中葛根素含量为31．79％。四甲基偶氮唑盐（Sigma公司）。鲁米诺购自Sigma公司。抗氧化活性试剂用黄嘌呤氧化酶（Sigma公司）。PC12细胞为解放军总医院老年病研究所惠赠。方法：实验于2001—01／07在解放军总医院老年病研究所完成。①以20g／LDMEM细胞培养液（pH7、1～7.2）培养细胞。将培养细胞按随机抽签法分为2组：葛根总黄酮组和过氧化氢损伤＋葛根总黄酮组，其中每组又根据葛根总黄酮的浓度平行分为5个质量浓度进行观察（0，1．0mg／L，10．100mg／L，1．0g／L），每组平行培养8孔，每孔100mL培养液（细胞数为1&;#215;10^9 L^-1），葛根总黄酮组于37℃条件下，加入葛根总黄酮培养72h；过氧化氢＋葛根总黄酮组：在37℃条件下，加入葛根总黄酮培养48h后，再加入500mmol／L过氧化氢，继续培养24h。②用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞活性；用Gfiess方法测定培养液中亚硝酸盐含量，用次黄嘌呤／黄嘌呤氧化酶测定培养液中的超氧化物歧化酶活性，以观察葛根总黄酮对PCI：细胞生长活性的调控；并外源性加入过氧化氢，观察葛根总黄酮对过氧化氢所致培养PC12细胞氧化损伤的防护作用；结果以抑制率表示[（空白A值-测定A值）／空白A值&;#215;100％]，抑制率越高，说明培养液中清除0f的能力越强。③数据间差异比较采用单因素方差分析。主要观察指标：葛根总黄酮对PC12：细胞培养液中亚硝酸盐含量、超氧化物歧化酶活性、及细胞活性的影响。结果：①葛根总黄酮对PC12细胞活力的影响：1～10mg／L的葛根总黄酮对PC12：细胞的生长无明显影响，100mg／L葛根总黄酮可促进PC12细胞的生长（P〈0．05），当葛根总黄酮在培养液中的浓度增加至1．0g／L时，则表现出明显地抑制细胞生长效能（P〈0．01）。培养液中葛根总黄酮浓度在1～100mg／L内可有效提高过氧化氢损伤组细胞的活力（P〈0．05）。②葛根总黄酮对PC12细胞培养液清除O2^-的影响：葛根总黄酮组和过氧化氢损伤＋葛根总黄酮组清除O2^-的能力均随着葛根总黄酮质量浓度的增加而逐渐升高（除外过氧化氢＋葛根总黄酮组加入葛根总黄酮1mg／L时），具有明显量效关系。两组均在加入100mg／L和1g／L葛根总黄酮时PC12细胞培养液中超氧化物歧化酶活性明显高于未加入葛根总黄酮时（P〈0．05～0．01）。③葛根总黄酮对PC12细胞亚硝酸盐的调控：低浓度（1～100mg／L）的葛根总黄酮使培养细胞亚硝酸盐生成减少，但培养液中葛根总黄酮浓度达1g／L时，亚硝酸盐生成量则增加。结论：①葛根总黄酮对培养的PC12细胞具有一定生长调控作用，低质量浓度（1—100mg／L）时促进细胞生长，高质量浓度（1g／L）时抑制细胞生长，但抗氧化能力最强。②在培养液中加入1～100mg／L的葛根总黄酮对讨氧化氧所致PC12氧化搠伤具有明昂防护效能。     

槲皮素对过氧化氢所致体外心肌细胞损伤的保护作用

目的:观察槲皮素对过氧化氢所致心肌细胞损伤的保护作用及其机制。方法:①实验于2004-12/2005-05在锦州医学院药理学教研室完成。选用出生1～3d的SD大鼠15只,雌雄不拘。②采用纯化培养的心肌细胞建立过氧化氢损伤模型,实验分为6组(每6孔细胞一组):正常对照组(正常细胞培养,加入等数量的培养基,不加入任何药物),10g/L二甲基亚砜组(加入10g/L二甲基亚砜),过氧化氢损伤组(加入过氧化氢200μmol/L),过氧化氢 低浓度槲皮素组(加入过氧化氢200μmol/L和槲皮素25μmol/L),过氧化氢 槲皮素中浓度组(加入过氧化氢200μmol/L和槲皮素50μmol/L),过氧化氢 槲皮素高浓度组(加入过氧化氢200μmol/L和槲皮素100μmol/L)。过氧化氢(200μmol/L)损伤时间为12h。③采用乳酸脱氢酶试剂盒测其释放量;采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶活力;硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛含量;硝酸还原法测定一氧化氮含量;四唑盐比色法测定线粒体脱氢酶活性。④计量资料差异比较采用t检验,组间数据处理根据处理方差齐性分析结果,采用非配对t检验。结果:①心肌细胞乳酸脱氢酶活性及丙二醛含量:过氧化氢损伤组明显高于正常对照组(P<0.01),过氧化氢 高、中、低浓度槲皮素组明显低于过氧化氢损伤组(P<0.01)。②心肌细胞超氧化物歧化酶活性:过氧化氢损伤组明显低于正常对照组(P<0.01),过氧化氢 高、中浓度槲皮素组明显高于过氧化氢损伤组(P<0.01)。③线粒体脱氢酶活性:过氧化氢损伤组明显低于正常对照组(P<0.01),过氧化氢 各浓度槲皮素组明显高于过氧化氢损伤组(P<0.01)。④心肌细胞内一氧化氮含量:过氧化氢损伤组高于正常对照组(P<0.05),过氧化氢 高、中、低浓度槲皮素组低于过氧化氢损伤组(P<0.05)。结论:槲皮素具有对抗缺氧复氧损伤、明显保护心肌细胞的作用,可能与其抗氧化、抗脂质过氧化反应有关。     

刺五加皂甙保护PC12细胞活性与缺氧诱导因子1α的表达

目的:观察刺五加皂甙对正常培养和缺氧条件下PC12细胞的活性和缺氧诱导因子1α表达的影响,探讨刺五加皂甙抗神经元缺氧损伤的可能机制。方法:实验于2004-09/2005-05在南通大学医学院航海医学研究所进行。培养大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株,加入终浓度为0.05mg/L的神经生长因子和终浓度为125mmol/L的氯化钴分别建立神经生长因子诱导PC12细胞分化的神经元模型和氯化钴诱导缺氧的模型;四甲基偶氮唑法检测12.5,25,50,100,150mg/L的刺五加皂甙对正常培养的和氯化钴诱导缺氧的PC12细胞活性的影响;蛋白免疫印迹检测刺五加皂甙对正常培养和氯化钴诱导缺氧的PC12细胞中缺氧诱导因子1α表达的影响,以上实验均以神经生长因子作为阳性对照。结果:①正常培养的PC12细胞为圆形,呈簇状生长。50mg/L神经生长因子诱导3d后,细胞停止增殖,部分PC12细胞开始呈现出神经元样的形态,产生类似于神经元的突起。随着诱导时间延长神经元样的细胞逐渐增多,至第7天,PC12细胞的突起形成网络。②12.5～100mg/L的刺五加皂甙可增加正常培养PC12细胞的活性,其中50mg/L刺五加皂甙作用最强。50mg/L刺五加皂甙的预处理可降低因缺氧引起的细胞活性的下降(P<0.01),其作用与50mg/L神经生长因子相当(P>0.05)。③正常培养的PC12细胞不表达缺氧诱导因子1α,氯化钴引起的缺氧可诱导PC12细胞表达缺氧诱导因子1α,刺五加皂甙、神经生长因子也可诱导缺氧诱导因子1α表达;刺五加皂甙和神经生长因子的预处理可以进一步增强缺氧PC12细胞中缺氧诱导因子1α的表达(P<0.01),刺五加皂甙和神经生长因子的作用差异无显著性(P>0.05)。结论:50mg/L的刺五加皂甙对PC12具有明显的缺氧保护作用,其抗缺氧损伤的作用与促进缺氧诱导因子1α的表达有关。     

水翁花对神经细胞氧化损伤保护作用的量效值

背景水翁花为中药桃金娘科植物水翁的干燥花蕾,已有报道水翁花提取物能通过抑制Na+/K+-ATP酶的活性加强心脏的收缩功能,同时降低心脏的收缩频率,水翁花提取物是否具有抗氧化方面的生物活性?目的观察水翁花对过氧化氢诱导的PC12神经细胞氧化损伤保护作用的量效关系.设计非随机对照的实验.单位华东理工大学生物工程学院生物反应器国家重点实验室.材料实验于2002-05/11在华东理工大学反应器国家重点实验室鲁华生物技术研究所完成.选择昆明种雄性小鼠8只.PC12神经细胞购自中国科学院上海细胞所.方法制备神经细胞氧化损伤模型.①水翁花细胞毒性测定在96孔微量培养板中加入PC12神经细胞,水翁花以RPMI 1640培养液稀释成0.001,0.01,0.1,0.5,1 g/L 5个浓度,每个浓度3孔,每孔接种2×103个细胞,另设空白对照组,即无药培养液组.标准条件下培养48 h,噻唑蓝比色法测定.②PC12神经细胞预先接种于96孔板中,培养24 h贴壁,分为正常对照组(正常细胞,不加H2O2和水翁花提取物)、0,0.01,0.1,0.5,1g/L水翁花提取物共7个组.除正常对照组外,其余细胞用200 μmol/L的H2O2处理,加入不同浓度的水翁花水提物,作用12 h后用噻唑蓝法测定细胞的存活率.③氧自由基水平测定PC12神经细胞处理同存活率测定法,采用CDCFH染色法测定细胞氧自由基水平.主要观察指标①水翁花提取物对PC12神经细胞的毒性.②水翁花提取物对氧化损伤的PC12神经细胞存活率影响.③水翁花提取物对氧化损伤的PC12神经细胞内、细胞外氧自由基水平的影响.结果①水翁花提取物在浓度低于0.055 g/L时,对神经细胞有保护作用,在0.055～1.00 g/L浓度时,对细胞生长几乎无任何影响.②在低于0.10 g/L的浓度下,水翁花提取物对H2O2诱导的PC12神经细胞的氧化损伤没表现出明显的保护作用.但当浓度为1.00 g/L时,对H2O2诱导的PC12神经细胞的氧化损伤表现出明显的氧化修复能力.③H2O2损伤后,PC12细胞内、外氧自由基水平显著升高,当水翁花提取物浓度为0.01 g/L时,能明显的降低氧化损伤神经细胞内、外的氧自由基水平.结论①水翁花水提物对H2O2诱导的PC12神经细胞的氧化损伤亦有很强的保护作用.②水翁花提取物抗氧化特性与提取液的浓度比有明显的关系,当浓度为1.00 g/L时,具有明显的修复能力;当浓度为0.01 g/L时能够降低细胞内外的氧自由基水平.     

水翁花对神经细胞氧化损伤保护作用的量效值

背景：水翁花为中药桃金娘科植物水翁的干燥花蕾,已有报道水翁花提取物能通过抑制Na＋/K＋-ATP酶的活性加强心脏的收缩功能,同时降低心脏的收缩频率,水翁花提取物是否具有抗氧化方面的生物活性？目的：观察水翁花对过氧化氢诱导的PC12神经细胞氧化损伤保护作用的量效关系.设计：非随机对照的实验.单位：华东理工大学生物工程学院生物反应器国家重点实验室.材料：实验于2002-05/11在华东理工大学反应器国家重点实验室鲁华生物技术研究所完成.选择昆明种雄性小鼠8只.PC12神经细胞购自中国科学院上海细胞所.方法：制备神经细胞氧化损伤模型.①水翁花细胞毒性测定：在96孔微量培养板中加入PC12神经细胞,水翁花以RPMI 1640培养液稀释成0.001,0.01,0.1,0.5,1 g/L 5个浓度,每个浓度3孔,每孔接种2&;#215;103个细胞,另设空白对照组,即无药培养液组.标准条件下培养48 h,噻唑蓝比色法测定.②PC12神经细胞预先接种于96孔板中,培养24 h贴壁,分为正常对照组（正常细胞,不加H2O2和水翁花提取物）、0,0.01,0.1,0.5,1g/L水翁花提取物共7个组.除正常对照组外,其余细胞用200 μmol/L的H2O2处理,加入不同浓度的水翁花水提物,作用12 h后用噻唑蓝法测定细胞的存活率.③氧自由基水平测定：PC12神经细胞处理同存活率测定法,采用CDCFH染色法测定细胞氧自由基水平.主要观察指标：①水翁花提取物对PC12神经细胞的毒性.②水翁花提取物对氧化损伤的PC12神经细胞存活率影响.③水翁花提取物对氧化损伤的PC12神经细胞内、细胞外氧自由基水平的影响.结果：①水翁花提取物在浓度低于0.055 g/L时,对神经细胞有保护作用,在0.055～1.00 g/L浓度时,对细胞生长几乎无任何影响.②在低于0.10 g/L的浓度下,水翁花提取物对H2O2诱导的PC12神经细胞的氧化损伤没表现出明显的保护作用.但当浓度为1.00 g/L时,对H2O2诱导的PC12神经细胞的氧化损伤表现出明显的氧化修复能力.③H2O2损伤后,PC12细胞内、外氧自由基水平显著升高,当水翁花提取物浓度为0.01 g/L时,能明显的降低氧化损伤神经细胞内、外的氧自由基水平.结论：①水翁花水提物对H2O2诱导的PC12神经细胞的氧化损伤亦有很强的保护作用.②水翁花提取物抗氧化特性与提取液的浓度比有明显的关系,当浓度为1.00 g/L时,具有明显的修复能力;当浓度为0.01 g/L时能够降低细胞内外的氧自由基水平.     

脑益康药物血清对谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用

目的:运用血清药理学方法观察脑益康药物血清对谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞损伤的保护作用。方法:①实验于2004-10/12在南通大学基础医学院病理生理实验室完成。采用12月龄SD大鼠24只,随机分为2组:对照组和脑益康灌胃组,每组12只,脑益康组以人等效剂量的1.5倍连续10d灌胃,末次灌胃后1h采血,收集脑益康药物血清。收集对照组(灌胃等量生理盐水)血清为对照。②PC12细胞经神经生长因子诱导7d后,用DMEM基础培养基洗2次,DMEM培养基中分别加入100,300,500g/L脑益康中药血清,于37℃培养1h,后加入0.2mmol/L谷氨酸,0.5mmol/L过氧化氢继续培养30min。同时设模型组(造成谷氨酸和过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型)及对照组(对照组大鼠血清,不加谷氨酸和过氧化氢)。③采用四唑盐比色法测定PC12细胞存活率;按由南京建成生物工程公司提供测试盒说明书进行乳酸脱氢酶释放量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性测定。④计量资料差异比较采用ANOVA法。结果:①谷氨酸和过氧化氢模型组的PC12细胞存活率明显低于对照组(P<0.05,0.01);而乳酸脱氢酶释放量明显高于对照组(P<0.01);谷氨酸和过氧化氢模型组的PC12细胞丙二醛含量明显高于对照组(P<0.01);而超氧化物歧化酶活性明显低于对照组(P<0.01)。②脑益康药物血清组PC12细胞存活率明显高于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05～0.01);而细胞的乳酸脱氢酶释放量明显低于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05～0.01)。③脑益康药物血清组丙二醛含量明显低于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05,0.01);而超氧化物歧化酶活性明显高于谷氨酸模型组和过氧化氢模型组(P<0.05)。结论:脑益康药物血清能明显减轻谷氨酸和过氧化氢诱导的PC12细胞的损伤,其机制可能与减少膜脂质过氧化物生成,提高抗氧化酶活性有关。     

参芪脑保含药血清在体外培养PC12细胞抗凋亡作用中的量效分析

目的:观察在经典药方补阳还五汤基础上加减而成的参芪脑保对体外培养的正常PC12细胞增殖和对抗活性氧(100μmol/L过氧化氢)引起的细胞凋亡作用,分析该作用的量效关系。方法:实验于2002-09/2003-04在解放军总医院老年医学研究所老年医学实验室完成。①含药血清制备:选用3月龄SD大鼠,随机分为4组:对照组,参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组,每组12只。参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组:将参芪脑保颗粒剂(成分:黄芪、丹参、当归尾、桃仁、红花、川芎、赤芍、地龙,10g/包,由解放军总医院制剂室提供,批号000831)按6.4,3.2,1.6g/kg剂量溶于2mL蒸馏水中灌胃;对照组:给予等量蒸馏水。各组连续灌胃7d后腹主动脉取血分离含药血清。②参芪脑宝对正常细胞增殖的影响:采用大鼠PC12细胞作为体外神经细胞模型。将对数生长期细胞接种于96孔培养板,将细胞随机分为4组:对照组和参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组,分别加入含体积分数0.1各组相应含药血清的DMEM培养液,分别于培养24,60和86h进行细胞计数。③参芪脑保抗活性氧引起的细胞凋亡作用:将对数生长期细胞培养24h。将细胞随机分为5组:对照组、过氧化氢损伤组和过氧化氢 参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组,除对照组外,其余各组均用含过氧化氢(终浓度100μmol/L)和20g/LB27的无血清DMEM培养基处理30min,过氧化氢损伤组和氧化损伤组改用含体积分数0.1的对照组血清培养基,参芪脑保各剂量组改用相应的含药血清培养基继续培养48h。④采用四氮唑蓝比色法测定正常细胞增殖和活性氧损伤后细胞存活数;采用流式细胞仪和DNAladder法观察细胞凋亡及参芪脑保抗凋亡作用及其剂量效应关系。⑤多组间差异采用方差分析,根据方差齐性结果,采用非配对t检验作两组间比较。结果:①参芪脑保对正常细胞增殖的影响:与对照组相比,参芪脑保6.4,3.2,1.6g/kg组在培养24,48和86h时均能明显提高正常PC12细胞的存活数(P<0.01),但无明显剂量效应关系。②参芪脑保对活性氧损伤后细胞存活数的影响:过氧化氢损伤组的细胞存活数明显低于对照组(P<0.01),除了过氧化氢 参芪脑保1.6g/kg组外,过氧化氢 参芪脑保6.4,3.2g/kg组细胞存活数明显高于过氧化氢损伤组(P<0.01)。③参芪脑保对活性氧损伤后细胞凋亡率影响:过氧化氢损伤组的细胞凋亡率明显高于对照组,除过氧化氢 参芪脑保1.6g/kg组外,过氧化氢 参芪脑保6.4,3.2g/kg组细胞凋亡率均明显低于过氧化氢损伤组(P<0.01)。④参芪脑保对活性氧损伤后细胞DNA片断化的影响:过氧化氢损伤组细胞的DNA片断化明显增强,过氧化氢 参芪脑保3.2g/kg组也可见轻度DNAladder现象,但过氧化氢 参芪脑保3.2g/kg和6.4g/kg组的DNAladder则明显减弱甚至消失,说明有明显的剂量效应关系。结论:参芪脑保对正常培养PC12细胞具有明显促进增殖作用,并在较高剂量下能显著对抗过氧化氢引起的细胞存活率降低、细胞凋亡率增高和DNA片断化,表明参芪脑保具有明显的神经保护作用,其机制可能与抗氧化反应有关。     

骨髓间充质干细胞分泌物对淀粉样β蛋白1～40损伤PC12细胞的神经保护作用

背景:由于骨髓间充质干细胞能分泌多种对退变胆碱能神经元有保护作用的神经营养因子,因此为阿尔茨海默病的治疗提供了新希望.目的:观察骨髓间充质干细胞分泌物对Aβ1～40损伤PC12细胞凋亡的保护作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-01/10在中国医科大学神经内科实验室完成.材料:体质量150 g左右的SD大鼠,雌雄不拘.方法:在体外培养、纯化骨髓间充质干细胞并收集其培养上清,实验分为4组:①空白对照组:在细胞培养体系中不加入任何药物和上清液.②骨髓间充质干细胞上清液组:细胞接种后24 h在细胞培养体系中加入骨髓间充质干细胞上清液30,60,120 已μL,并用体积分数为5%胎牛血清/RPMI 1640将终体积补足至300 μL,使其上清液体积分数分别为10%,20%,40%.③Aβ1～40损伤组:以10 mg/LAβ1～40刺激PC12细胞,终浓度为5,10,20 mg/L:换用1640培养24 h后,收集受损PC12上清培养液.④联合培养组:以10 mg/L Aβ1～40刺激PC12细胞过夜(阿尔茨海默病细胞模型),除去培养上清,换用1640培养24 h后,收集受损PC12上清作为条件培养液,分别给予骨髓间充质干细胞上清液30,60,120 μL,各组细胞给药后24 h和48 h进行指标检测.主要观察指标:①骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定.②骨髓间充质干细胞分泌物对PC12细胞活力的影响.结果:骨髓单个核细胞培养2～5 d为生长潜伏期,细胞增殖较慢,细胞数变化不明显.6～12 d为细胞快速增殖期,排列有一定方向性,呈旋涡样生长.培养15～18 d,细胞出现80%～90%的融合,克隆间出现重叠.胰酶消化传代的细胞于12 h内完全贴壁、伸展并重新变为长梭形,生长迅速,7～10 d达到完全融合.骨髓间充质干细胞表面抗原的鉴定通过免疫荧光检测显示,CD45表达为阴性,证明其为非造血类细胞;CD44表达阳性.②Aβ1～40的终浓度为5,10,20 mg/L孵育24,48 h后,细胞活力与空白对照组相比均降低(P<0.01),且随着Aβ1-40质量浓度的增大,活力降低越明显.与Aβ1-40 mg/L孵育24,48 h组相比,联合培养组细胞活力上升,且相邻剂量间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05);作用24,48 h骨髓间充质干细胞上清液组各浓度组与空白对照组相比,细胞活力没有变化.结论:骨髓间充质干细胞对Aβ1-40损伤的PC12细胞凋亡有保护作用,其保护作用的强弱与骨髓间充质干细胞上清液浓度有关.     

灵芝多糖肽对氧化应激损伤PC12细胞的保护作用与神经生长因子的比较

目的探讨灵芝的主要有效成分灵芝多糖肽对H2O2氧化应激损伤PC12细胞的保护作用,并以神经生长因子作为阳性对照.方法实验于2004-01/06在第二军医大学神经科学研究所进行.以H2O2损伤PC12细胞为氧化应激损伤神经元的模型,将培养的PC12细胞随机分成4组①正常对照组PC12细胞在无血清的DMEM培养基中培养.②H2O2作用组PC12细胞与终浓度为200 μmol/L的H2O2作用4 h.③灵芝多糖肽组PC12细胞预先用终浓度为10 mg/L的灵芝多糖肽预处理24 h后,加入终浓度为200μmol/L的H2O2共同作用4 h.④神经生长因子组PC12细胞预先用终浓度为0.1 mg/L的神经生长因子预处理24 h后,加入终浓度为200μmol/L的H2O2共同作用4 h.采用MTT法检测细胞的存活率以及Western blotting检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 P20活性片段.结果①细胞存活率H2O2作用组显著低于正常对照组[(38.6±7.1)%,(100±9.3)%,P＜0.01 ];灵芝多糖肽组和神经生长因子组显著高于H2O2作用组[(83.4±10.2)%,(75.9±7.4)%,P＜0.01],但两组间比较无差异(P＞0.05).②半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 P20活性片段Westernblotting检测结果提示灵芝多糖肽组和神经生长因子组较H2O2作用组明显减少.结论适量灵芝多糖肽灵芝多糖肽能促进氧化应激损伤PC12细胞的存活,抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡,对氧化应激损伤PC12细胞具有保护作用,其效果与神经生长因子相似.     

肝细胞生长因子对过氧化氢诱导肝细胞凋亡的影响

背景:肝细胞生长因子对多种细胞具有保护作用。目的:观察肝细胞生长因子对过氧化氢诱导肝细胞凋亡的保护作用及其机制。方法:采用人LO2肝细胞系,随机分成3组:正常对照组为正常培养的LO2细胞;模型组加入100mmol/L过氧化氢作用LO2细胞4h;肝细胞生长因子组加入50mg/L肝细胞生长因子预处理LO2细胞24h,再加入100mmol/L过氧化氢继续培养4h后处理细胞。结果与结论:体外培养的LO2细胞经100mmol/L过氧化氢作用4h后,LO2细胞可出现明显的凋亡现象,表现为细胞存活率降低(P<0.01),Caspase-3蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)。给予质量浓度50mg/L肝细胞生长因子预处理24h后再加入100mmol/L过氧化氢继续培养4h,LO2细胞的凋亡被显著抑制(P<0.01),说明肝细胞生长因子可通过增加LO2细胞Bcl-2的表达来抑制过氧化氢诱导的LO2细胞凋亡。     

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4源性活性氧过量产生抑制胚胎干细胞向心肌细胞的分化

背景:作为信号传导通路中的第二信使,活性氧(主要指超氧离子和过氧化氢)对细胞的生长、分化起重要作用。过量的活性氧在心脏疾病中启动了心肌细胞的凋亡,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4源性活性氧的过量产生诱导凋亡是否抑制了胚胎干细胞向心肌细胞的分化。目的:探讨尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4活性氧对心肌细胞分化的抑制作用。设计:随机对照实验观察。单位:卫生部北京医院老年医学研究所。材料:胚胎干细胞CGR8为本实验室自存,其他主要试剂除特别注明均购自Sigma公司。方法:实验于2003-10/2005-08在卫生部北京医院老年医学研究所进行。①将小鼠胚胎干细胞分化成胚小体。在分化4d后以不同浓度的过氧化氢(1,10,100,1000nmol/L)处理胚小体1h,在分化8d后观察心肌细胞的生成,分析活性氧对心肌细胞分化的影响。②将pcDNA3.1和pcDNA3.1-NOX4质粒分别转染CGR8细胞,同时以未进行转染的CGR8细胞为对照,以RT-PCR和WesternBlotting测定尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4mRNA和MLC2v蛋白水平,应用定量四唑氮蓝高水平表达尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4干细胞中活性氧水平。③采用活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(5mmol/L)和过氧化氢酶(200U/mL)转染前处理2h作为对照,用Hoechst染色、TUNEL和DNAladder分析尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达后CGR8细胞凋亡情况,同时检测转染尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶氧化酶4后CGR8细胞中p21、p53及Bcl-2的表达。主要观察指标:①活性氧对心肌细胞分化的影响。②胚胎干细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的表达。③尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达后活性氧产生量、心肌细胞的分化和胚胎干细胞凋亡的观察。④p53,p21和Bcl-2是否参与了尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达诱导的细胞凋亡。结果:①不同水平的活性氧对心肌细胞分化具有不同的效应。在分化后4d用较低浓度(1～100nmol/L)的过氧化氢处理胚小体2h可明显促进心肌细胞分化(P<0.01),而较高浓度(>1μmol/L)的过氧化氢则显示出抑制作用(P<0.01)。②尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在小鼠胚胎干细胞中的表达水平最高,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶3虽然也在胚胎干细胞中表达,但表达水平低,而尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1、2在胚胎干细胞中不表达。RT-PCR检测结果显示,与单纯转染pcDNA3.1细胞相比,转染pcDNA3.1-NOX4质粒的CGR8细胞中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达。③四唑氮蓝实验检测结果显示,高水平表达的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4引起过量活性氧产生(P<0.05)。与未转染质粒的细胞相比,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达抑制了心肌细胞的分化(P<0.01)。WesternBlot结果显示高水平尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4导致胚小体内MLC2v蛋白水平降低。④p21和p53可能参与了NADPH氧化酶4诱导的凋亡过程。转染尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4的p53-/-ES细胞R72D27并未发生凋亡,高水平的Bcl-2可以抑制尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4过表达诱导的细胞凋亡。结论:尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4在心肌细胞分化中起关键作用,p53和p21以及Bcl-2可能参与了凋亡信号通路的调控。     

H_2O_2致PC12细胞凋亡与细胞内14-3-3蛋白表达水平下调的关系

目的:探讨用H2O2处理PC12细胞制作PD氧化应激细胞模型的最佳浓度与最适处理时间,以及H2O2致PC12细胞凋亡与14-3-3蛋白表达水平的关系。方法:采用MTT法、荧光分光光度计、流式细胞术及免疫印迹技术分别检测PC12细胞活力、Caspase酶活性、细胞凋亡率以及14-3-3蛋白表达量。结果:当H2O2浓度为100μmol/L时Caspase活性最高;100μmol/LH2O2处理PC12细胞24h时细胞凋亡率最高;PC12细胞的凋亡率与14-3-3蛋白表达的水平呈显著负相关。结论:100μmol/L和24h分别为用H2O2制作PD氧化应激模型的最佳浓度和处理时间,H2O2致PC12细胞的凋亡与细胞内14-3-3蛋白表达水平下调有关。     

L-肌肽对过氧化氢诱导PC12细胞损伤的保护机制

目的探讨L-肌肽对H2O2诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）凋亡保护的作用机制。方法在H2O2诱导PC12细胞凋亡模型的基础上加入肌肽,采用MTT比色法检测肌肽对H2O2抑制PC12细胞增殖的影响;RT-PCR法检测凋亡相关基因Caspase-3 mRNA的表达变化;免疫组织化学SABC法检测Caspase-3蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果不同浓度的肌肽对H2O2损伤的PC12细胞的存活率有显著的提高作用,20mmol/L浓度时达最大值（P〈0.05）;20mmol/L的肌肽作用于PC12细胞可降低其Caspase-3 mRNA的表达及Caspase-3蛋白的表达,流式细胞仪检测显示,肌肽可抑制细胞的早期和晚期凋亡。结论肌肽对H2O2损伤的PC12细胞有保护作用,机制可能是通过抑制Caspase-3的表达来抑制PC12细胞的凋亡而实现的。     

淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡与奥氮平的保护作用

背景:在阿尔茨海默病中起着重要作用的淀粉样β蛋白能够诱导细胞凋亡。目的:探讨奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡的机制及其保护作用。单位:解放军总医院南楼神经科。设计:随机设计。材料:实验于2002-05/2003-03在加拿大萨斯卡彻温大学医学院神经精神研究所完成。方法:P12细胞在RPMI1640培养液中培养。在96孔板每孔中接种100μL细胞悬液,在胶原被覆的25cm2培养瓶中接种5mL细胞悬液,培养24h后,分别加50μmol/L、100μmol/L奥氮平培养24h,再加不同浓度的淀粉样β蛋白25～35(0.01μmol/L、2μmol/L、20μmol/L)培养24h。将收获好的96孔板以淀粉样β蛋白25～35诱导PC12细胞凋亡,采用MTT比色分析测定细胞存活率。收获25cm2培养瓶中的PC12细胞,应用Westernblot检测奥氮平对PC12细胞Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响。主要观察指标:细胞存活率的测定,PC12细胞中Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达水平。结果:①细胞存活率比较:淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞的细胞活性从75%降低到35%;50μmol/L、100μmol/L奥氮平预处理组PC12细胞的活性明显提高。②奥氮平对淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞凋亡中Bax表达的影响:0.01μmol/L,2μmol/L,20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞Bax的表达增加,50μmol/L奥氮平预处理使淀粉样β蛋白25～35诱导的PC12细胞Bax的表达减低。③奥氮平对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的影响:0.001μmol/L、0.01μmol/L淀粉样β蛋白处理的PC12无变化,50μmol/L奥氮平预处理对PC12细胞表达亦无影响;2μmol/L、20μmol/L淀粉样β蛋白25～35处理的PC12细胞表达增高,50μmol/L奥氮平预处理能抑制其表达升高。结论:①淀粉样β蛋白25～35能够诱发与细胞凋亡密切相关的Bax、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在培养的PC12细胞中高表达。②奥氮平具有降低其表达,提高PC12细胞存活的保护作用。     

天麻素干预对过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡、活力及PI3K／AKT信号通路蛋白的影响

【目的】探讨磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）蛋白表达量及蛋白激酶 B（AKT ）信号通路在过氧化氢（H2 O2）诱导的 PC12细胞中的作用及天麻素的干预对其通路的影响。【方法】PC12细胞随机分为正常对照组,模型组（400μmol／L H2 O2）,天麻素低、中、高浓度组（0．1、1、10μmol／L 天麻素＋400μmol／L H2 O2）。咪唑蓝法检测各组细胞活力,Hoechst 染色观察各组细胞凋亡情况,比色法检测天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase 3）、Caspase 8及 Caspase 9活性,western blot 分析 Bcl‐2、Bax 及 PI3K 蛋白表达量与 AKT 磷酸化水平。【结果】与正常对照组比较,模型组中细胞活力下降,细胞凋亡率提高,Caspase 3、Caspase 8及 Caspase 9活性提高,Bcl‐2及 PI3K 表达量下降,Bax 表达量上升,AKT 磷酸化水平降低,差异均具有统计学意义（ P ＜0．01）;与模型组比较,天麻素低、中、高浓度组细胞活力提高,细胞凋亡率降低,Caspase 3、Caspase 8及 Caspase 9活性降低,Bcl‐2、PI3K 蛋白表达量及 AKT 磷酸化水平提高,天麻素中、高浓度组 Bax 表达量降低,差异均具有统计学意义（ P ＜0．01）。【结论】天麻素可通过激活 PI3K／AKT 信号通路,从而抑制 H2 O2诱导的 PC12细胞凋亡。     

葛根素对淀粉样β蛋白所致痴呆模型小鼠学习记忆的影响

背景葛根素是中药葛根的主要有效成分,能对抗东莨菪碱、D-半乳糖等因素引起的动物学习记忆障碍.目的探讨葛根素对淀粉样β蛋白所致痴呆模型小鼠学习记忆障碍的保护作用及脑和血中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的变化.设计随机对照实验.单位首都医科大学药理学系.材料实验于2002-03/06在首都医科大学药理学系完成.实验选用40只ICR小鼠,随机分成4组假手术组、痴呆模型组、葛根素25 mg/kg组、葛根素50 mg/kg组,每组10只.方法①造模小鼠戊巴比妥钠麻醉,痴呆模型组、葛根素25 mg/kg组、葛根素50 mg/kg无菌操作下一次性右侧脑室内注射淀粉样β蛋白3μL/只.假手术组操作同模型组,但不注射淀粉样β蛋白.②给药假手术组、模型组腹腔注射生理盐水10mL/kg;葛根素25 mg/kg组腹腔注射25 mg/kg;葛根素50mg/kg组腹腔注射50mg/kg.各组于造模当日开始给药,12 d后开始行为学检测.③用Morris水迷宫法检测小鼠学习记忆能力,记录2 min内寻找到平台的时间(逃避潜伏期),航行距离,初始角度及搜索策略,作为学习成绩.④小鼠完成上述实验后,乙醚麻醉眼眶取血,制备血清,然后断头处死,迅速取右脑冰浴下制备脑匀浆,检测脑、血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量.主要观察指标①各组小鼠到达平台的逃避潜伏期和游泳距离、搜索策略及初始角度.②各组小鼠脑、血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量.结果40只小鼠均进入结果分析.①葛根素25 mg/kg和50 mg/kg组逃避潜伏期、航行距离缩短(P＜0.05～0.01).搜索策略及初始角度结果显示随着训练天数的增加,各组小鼠随机+边缘式策略的出现率逐渐下降;其中假手术组及葛根素25 mg/kg组、葛根素50 mg/kg组的下降速度和程度较痴呆模型组快,同时趋向+直接式的增加速度和程度也较痴呆模型组快.初始角度各组间均无显著差异(P＞0.05).②葛根素25 mg/kg组、葛根素50 mg/kg组能使模型小鼠脑及血中超氧化物歧化酶增多、丙二醛的减少(P＜0.05～0.01).结论葛根素可对抗淀粉样β蛋白的神经毒性,使模型小鼠的学习记忆成绩提高,与剂量无关,可能与清除脑自由基及提高抗氧化活性作用有关.     

芦荟大黄素对PC12细胞骨架保护作用的实验研究

目的 研究芦荟大黄素(AE)对H2O2及甲醛引起的PC12细胞损伤的保护作用.方法 将PC12细胞分成AE+H2O2干预组、H2O2损伤组、AE+甲醛干预组、甲醛损伤组、AE对照组和正常对照组6组.各组加入相应药物干预2 h后用不同浓度H2O2或甲醛损伤后进行细胞骨架及凋亡染色、LDH检测.结果 AE+H2O2干预组LDH(67.7±5.5)U/L显著低于H2O2损伤组的(92.0±9.9)U/L(P<0.01);AE+甲醛干预组LDH与甲醛损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05);AE+H2O2干预组细胞骨架损伤、凋亡较H2O2损伤组少.结论 AE可通过纠正H2O2诱导的细胞骨架的异常改变,阻滞或延缓PC12细胞的过度凋亡但对甲醛诱导的细胞骨架重排无明显保护作用.     

鼠脑缺血再灌注时葛根素对核因子κB表达的影响

背景:近年研究证明,炎症反应是脑缺血再灌注损伤的主要机制之一,核因子κB作为一种转录因子在脑缺血再灌注炎症反应中起着调控多种炎性细胞因子表达的关键作用.先期实验表明,葛根素具有抗氧自由基和神经细胞凋亡的作用,如果还具有抗炎作用,则可进一步阐述葛根素的脑保护作用机制.目的:探讨葛根素在全脑缺血再灌注损伤中对核因子κB的影响.设计:随机平行对照设计.单位:卫生部北京医院急诊科、华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊科、华中科技大学同济医学院的病理学教研室、实验动物中心和公共卫生学院卫生统计学教研室.材料:实验于2003-04/12在同济医学院病理学教研室进行.将健康清洁级的Wistar大鼠75只随机分为假手术组,脑缺血再灌注组和葛根素组3组各25只,每组按再灌注的时间又分为2,6,12,24和48 h共5个观察时间点,每个时间点5只大鼠.方法:[1]假手术组:不电凝双侧椎动脉,分离双侧颈总动脉不夹闭,不给药.[2]脑缺血再灌注组:电凝双侧椎动脉后用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10 min后松开,行再灌注,在再灌注开始时腹腔注射1 mL的生理盐水,以后每隔6 h注射1次.[3]葛根素组:处理程序同脑缺血再灌注组,只是将生理盐水改为葛根素100 mg/kg.主要观察指标:在大鼠全脑缺血10 min后再灌注2,6,12,24和48 h时,用免疫组织化学法检测海马CA1区核因子κB和抑制蛋白κB的活性;用原位杂交法检测肿瘤坏死因子αmRNA的表达,用苏木精-伊红染色检测存活神经元数目.结果:经补充后75只大鼠进入结果分析.[1]核因子κB的活性:脑缺血再灌注组再灌注2 h即明显升高,6 h达到高峰,48 h仍高于假手术组(P均＜0.01);葛根素组在各个时间点均低于脑缺血再灌注组(P＜0.01).[2]肿瘤坏死因子αmRNA的表达:脑缺血再灌注组再灌注2 h即明显升高,12 h达到高峰,48 h仍高于假手术组(P均＜0.01);葛根素组在再灌注6～48 h均低于脑缺血再灌注组(P＜0.01).[3]抑制蛋白κB的活性:脑缺血再灌注组再灌注2 h有明显下降,6 h降至最低点,以后逐渐升至2 h水平,葛根素组在各个时间点均高于脑缺血再灌注组(P＜0.01或0.05).[4]存活神经元数目:脑缺血再灌注组随再灌注时间的延长而逐渐减少(P均＜0.01).在各对应时间点,葛根素组均多于脑缺血再灌注组(P＜0.05或0.01).结论:全脑缺血再灌注时,葛根素可通过抑制抑制蛋白κB的降解及核因子κB的活性,下调肿瘤坏死因子αmRNA的表达,抑制炎症反应而起到脑保护作用.