CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。     

survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达

目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达。结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

人Sox2对CD133基因启动子的调控研究

目的构建人Sox2基因的真核表达载体并研究其对CD133基因启动子的调控。方法采用PCR方法,从人乳腺癌细胞MCF-7的cDNA中扩增出Sox2基因全长,将其定向克隆至真核表达载体pcDNA3.0中,构建重组质粒pcDNA-Sox2,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,分别将空载pcDNA3.0与重组质粒pcDNA-Sox2转染人神经胶质瘤U251细胞系,通过RT-PCR和Western blot方法,验证Sox2 mRNA和蛋白的表达。同样采用PCR方法,以人全基因组DNA为模板扩增CD133基因的启动子P1-3片段,并将此片段克隆到PGL3-basic荧光素酶报告基因质粒中,经限制性内切酶、PCR鉴定及测序正确后,将空载PGL3-bas-ic与PGL3-CD133-p1-3转染人神经胶质瘤U251细胞系,用双荧光素酶检测方法分析Sox2对CD133基因转录水平上的调控。结果扩增出954bp的Sox2基因,并检测到重组质粒Sox2 mRNA和蛋白的表达。扩增出2440bp的CD133-p1-3启动子片段,且Sox2可上调CD133基因启动子的表达。结论成功构建了人Sox2基因真核表达载体,以及CD133启动子荧光素酶报告质粒,并检测到Sox2与CD133之间存在一定的调控关系,为进一步研究人Sox2对CD133的作用奠定了基础。     

增强型绿色荧光蛋白基因在鸡胚盘细胞中的表达

从鸡胚发育为X期的鸡蛋中取胚盘细胞,经原代培养后用带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记基因的真核表达质粒pLEGFP-C1转染鸡胚细胞观察GEFP基因的表达情况,结果在不同条件下的活细胞均见有EGFP基因的稳定表达,这提示通过EGFP基因转染鸡胚盘细胞可连续且直接观察活细胞中的表达,为转基因鸡的研究提供一实用的标记基因。     

应用珠蛋白启动子驱动荧光蛋白在K562细胞中表达

目的应用红系特异性启动子驱动荧光蛋白（绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP）在血液病细胞K562中表达,以验证克隆所得红系特异性启动子的有效性。方法应用PCR的方法扩增红细胞系特异性启动子,构建该启动子驱动GFP基因表达载体和驱动RFP基因表达载体。然后转染K562细胞,用荧光显微镜、RT-PCR分析基因表达的情况。结果荧光显微镜示在K562细胞中可见较强的绿色荧光和红色荧光表达,RT-PCR进一步验证了GFP和RFP能在K562细胞中有效的表达。结论克隆的红细胞系启动子是有效的,能有效地启动目的基因在血液病细胞中表达,为下一步进行血液病基因治疗提供科学的资料。     

CD133~+细胞在结肠癌中的研究进展

<正>大量的研究表明实体瘤中有一小部分肿瘤细胞具有"干细胞"性质[1-2],即所谓的肿瘤起始细胞(tumor initiating cell)或者称肿瘤干细胞(cancerstem cell),其具有无限增殖和自我更新的潜能,能够驱动肿瘤的形成、生长、侵袭、转移,并具有抵抗放化疗的能力[3-4]。有研究证明在很多实体瘤中都存     

CD133在肝癌中的研究进展

肝癌恶性程度高、病情进展快.肿瘤干细胞被认为可能是癌症产生、转移和复发的关键.CD133作为公认的肿瘤干细胞标志物,在多种肿瘤组织中表达.同样也有望成为肝癌干细胞的特异性标记物,成为肝癌治疗的新靶点.     

CD133+细胞在局部晚期结肠癌中的异常表达

目的 探讨CD133+肿瘤细胞对结肠癌患者预后的影响。方法 收集有完整随访资料的104例IIIB期(T3-4N1M0)结肠癌根治术后石蜡包埋组织标本及临床资料,采用免疫组化方法检测癌组织及邻近癌旁相对正常组织中CD133抗原的表达情况,分析其与患者临床特征和预后的关系。结果 肿瘤组织中的CD133+肿瘤细胞比较少见而且分布不均匀。CD133染色见于结肠癌细胞膜的腺腔面及基底,在癌巢"出芽"处及有腺管结构的低分化腺癌也可见CD133染色。生存分析显示CD133及T分期都是IIIB结肠癌的独立预后因素。肿瘤组织中CD133+细胞＜5%的患者5年生存率较高（77.4%）,≥ 5％则为45.2%。CD133的表达与其他临床病理参数均无相关性。结论 CD133+肿瘤细胞是IIIB期结肠癌患者5年生存率的独立预后因素, CD133+肿瘤细胞促进了IIIB期结肠癌的进展。     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

肿瘤干细胞标记CD44和CD133在鼻咽癌细胞株中的表达检测

目的 探索肿瘤干细胞标记物CD44和CD133在鼻咽癌(NPC)中的表达量及其有效分选方式.方法 常规培养SUNE-1 5-8F细胞,采用免疫荧光技术及流式细胞学技术检测SUNE-1 5-8F细胞中CD44、CD133的表达,并用流式细胞仪分选CD44+、CD44+CD133+细胞.结果 激光共聚焦镜下鼻咽癌SUNE-...     

AFP启动子对绿色荧光蛋白在人肝癌细胞中表达的影响

目的：研究AFP5‘端3.1kb启动子序列对GFP在人肝癌细胞中表达的影响。方法：首先采用重组DNA技术,构建了由AFP5‘端前导序列（AFP启动子＋AFP EI增强子,3．1kb)调控的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因哺乳动物表达载体pcDNA3-GFP-AFP-w,然后将pcDNA3-GFP-AFP-w、pcDNA3-GFP及空载（pcDNA3-neo)经lipofectin分别转染Bel7402、Hela二种肿瘤细胞,G418抗性筛选得到含各不同质粒的稳定阳性细胞克隆,Western blotting和密度积分扫描检测GFP基因的表达。结果：转染pcDNA3-GFP-AFP-w细胞的GFP表达量在Bel7402中明显高于Hela细胞,在Hela细胞中GFP几乎不表达,但均低于相应转染pcDNA3-GFP的细胞,呈现一定的专一性。结论：AFP5‘端3．1kb启动子序列调控的GFP报告基因载体pcDNA3－GFP－AFP－w对Bel7402肝癌细胞呈现一定的细胞专一性。     

CD133+结直肠肿瘤干细胞中ABC转运蛋白的表达

目的 探讨CD133+结直肠肿瘤干细胞表面ABC转运蛋白的表达.方法 运用流式细胞仪(FACS)分析结直肠肿瘤细胞中CD133的表达,通过实时荧光定量PCR分析9种常见ABC转运蛋白在结直肠肿瘤细胞及正常组织细胞中的表达情况,并筛选出在肿瘤组织中高表达的ABC转运蛋白做免疫荧光分析,观察CD133+细胞中ABC转运蛋白的表达.结果 有(2.59±1.26)%的结直肠肿瘤细胞表达CD133表面标记,在9种ABC转运蛋白中,MRP1在结直肠肿瘤细胞中表达显著高于正常组织细胞,共聚焦显微分析后证明CD133+细胞为主要MRP1表达细胞.结论 MRP1为结直肠肿瘤中主要表达的ABC转运蛋白,并且这一转运蛋白集中表达在CD133+肿瘤细胞中.     

PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白基因的表达

目的：研究PC12细胞中增强型绿色荧光蛋白(GFP)基因的表达。方法：用脂质体转染法将增强型GFP基因转入PC12细胞,在荧光显微镜下观察转染细胞GFP表达及荧光强度。用碘化丙啶(PI)标记缺氧血清剥夺再灌流后的PC12／GFP细胞,在流式细胞仪上分选GFP阳性(活)细胞并测定其比例。结果：克隆转移后几乎所有细胞表达GFP,可连续稳定传40代以上。流式细胞仪可精确分选出GFP( )／PI(-)、GFP( )／PI( )、GFP(-)／PI(-)、GFP(-)／PI( )4组细胞。结论：增强型GFP基因可在PC12细胞中稳定高表达。PC12／GFP细胞株的建立为短暂脑缺血再灌流后干预治疗的研究提供了理想的对照实验细胞模型。     

高能X线诱导喉癌Hep-2细胞凋亡及相关基因的表达研究

目的：研究高能X线诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的作用及其分子机制。方法：采用不同剂量的高能X线作用于Hep-2细胞株，流式细胞仪检测其凋亡率。Western blot和RT-PCR方法检测细胞的BCL-2和BAX蛋白及mRNA转录水平。结果：在一定范围内，随着剂量的增加和时间的延长，细胞凋亡率基本呈增加趋势。Western blot和RT-PCR结果显示辐射后BCL-2表达下调。而BAX无明显改变，BCL-2／BAX的比值明显降低。结论：高能X线诱导的Hep-2细胞凋亡具有时间剂量依赖性。BCL-2和BAX参与了辐射诱导的Hep-2细胞凋亡，BCL-2抑制细胞凋亡可能是Hep-2细胞恶性增殖的主要原因之一。     

CD133蛋白在卵巢浆液性肿瘤中的表达及临床病理意义

目的:研究CD133在卵巢浆液性肿瘤中的表达及临床病理意义.方法:采用免疫组织化学EnvisionTM 二步法检测100例浆液性肿瘤组织中CD133的表达,并分析其与临床病理的关系.结果:CDD3阳性表达率在良性浆液性肿瘤、交界性卵巢浆液性肿瘤及浆液性腺癌分别为0％、26.1％和69.6％,浆液性腺癌的表达高于交界性卵...     

Numb蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及其与CD117、CD133、ALDH1的关系

目的 探讨膜相关蛋白Numb在上皮性卵巢癌中的表达及其与卵巢癌干细胞标志物CD117、CD133、乙醛脱氢酶1（ALDH1）的关系。方法 选择四川大学华西第二医院妇科住院的136例卵巢肿瘤患者及无卵巢肿瘤患者22例为研究对象,根据摘除卵巢的病理组织学检查结果,将其分为上皮性卵巢癌组（n=92）、交界性卵巢肿瘤组（n=23）、良性卵巢肿瘤组（n=21）及正常卵巢组（n=22）。采用免疫组化SP法检测患者卵巢组织中Numb、CD117、CD133及ALDH1蛋白的表达水平,统计分析几种蛋白的表达差异及相关性。结果 ①Numb蛋白在上皮性卵巢癌组阳性表达率高于良性卵巢肿瘤组及正常卵巢组,交界性卵巢肿瘤组Numb蛋白阳性表达率高于正常卵巢组,且差异均有统计学意义（P<0.05）。②Numb蛋白阳性表达率在上皮性卵巢癌患者中FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期患者低于Ⅲ～Ⅳ期患者,无淋巴结转移患者低于有淋巴结转移患者,且阳性表达率差异均有统计学意义（P<0.05）;而不同年龄、组织病理学类型、病理分级及残留灶大小之间比较,差异则无统计学意义(P>0.05)。③上皮性卵巢癌患者卵巢组织中Numb蛋白与CD117及CD133阳性表达无相关性（r=0.116,P=0.261;r=0.083,P=0.425）;而Numb蛋白阳性表达与ALDH1表达呈正相关关系（r=0.296,P=0.003）。结论 Numb蛋白的表达与上皮性卵巢癌的发生、侵袭和转移有关,与卵巢癌干细胞标志物ALDH1表达呈正相关,有可能影响患者的预后。     

CD2AP真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达定位

目的:构建pEGFP-CD2AP真核表达载体,检测其在COS-7细胞中的表达.方法:PCR扩增CD2相关蛋白(CD2-associated protein,CD2AP)全长编码序列,PCR产物连接入pGEM T-Easy载体,经测序确认无误后,亚克隆入pEGFP-C2构建pEGFP-CD2AP真核表达载体,采用Lipofectamine 2000转染COS-7细胞,荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP.结果:pEGFP-CD2AP表达载体转染COS-7细胞后,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物.结论:pEGFP-CD2AP真核表达载体构建成功,并可在细胞内表达,这将为今后的CD2AP功能研究奠定基础.     

肿瘤干细胞标志物 CD133在大肠癌组织中的表达及意义

目的：研究探讨大肠癌组织中肿瘤干细胞表面标记物CD133的表达及临床意义。方法：采用术后大肠癌组织标本60例,应用免疫组织化学法分别检测癌组织和癌旁组织中的CD133的表达情况,分析其与临床病理特征的关系。结果：CD133在大肠癌组织中的表达较癌旁组织增强（ P＝0．000）。 CD133在癌组织中的表达在肿瘤的组织学分化程度、肿瘤浸润深度及是否有淋巴结转移间具有统计学意义（ P＝0．008,0．014）。结论：CD133在大肠癌组织中过表达,与部分临床病理特征有关,可以作为大肠癌的免疫学诊断候选标记物。     

CD133、TROP-2在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究初探

目的:探讨肿瘤干细胞标志物CD133?人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigens 2,TROP-2)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及意义?方法:用免疫组化?免疫荧光法检测CD133?TROP-2在NSCLC中的表达,激光共聚焦显微镜观察其定位和共定位?结果:①CD133?TROP-2在NSCLC组织中的阳性表达率分别为30.00% 和41.25%,均明显高于癌周正常肺组织及肺良性病变组织(P < 0.01);②细胞分化程度越低,CD133表达阳性率越高(P = 0.024);③CD133?TROP-2在有淋巴结转移组的阳性表达率高于无淋巴结转移组(P < 0.05),TROP-2的阳性表达率随着TNM分期的升高而升高(P < 0.05);④CD133?TROP-2在NSCLC中的表达具有密切相关性(P < 0.001),且两种蛋白有共定位现象?结论:CD133?TROP-2的阳性表达均与NSCLC的侵袭?转移密切相关,初步证实二者在NSCLC组织中存在共定位关系,CD133联合TROP-2或许能成为 NSCLC 的肿瘤干细胞筛选标记物?