环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中MMP-9表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9;MMP-9)表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备脱细胞猪主动脉瓣膜支架,用3%环氧氯丙烷处理48h的去细胞支架材料作为实验组;用0.2%戊二醛处理48h的去细胞支架材料作为对照组。将培养的人骨髓基质干细胞(human bone marrow mesenchy-mal stem cells;hBMSCs)种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜(tissue engineered heart valves;TEHV),分别行石蜡包埋切片HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,免疫组化检测MMP-9表达的阳性率。结果hBMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-9的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制hBMSCs的MMP-9表达,对防止组织工程心脏瓣膜钙化的形成有一定作用。     

环氧氯丙烷在组织工程心脏瓣膜构建中对基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的探讨环氧氯丙烷对组织工程心脏瓣膜构建中基质金属蛋白酶－1（matrix metalloproteinase-1 MMP-1）表达的影响。方法采用去垢剂和胰蛋白酶消化制备的脱细胞猪主动脉瓣膜支架作为对照组,用加用3％环氧氯丙烷处理24小时的去细胞支架材料作为实验组。将培养的人骨髓基质干细胞（human bone maiTow derived stroma cells BMSCs）种植于脱细胞支架上构建组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve 1EHV）,分别行石蜡包埋切片、HE染色和扫描电镜观察TEHV的组织结构,并行逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）测定BMSCs分泌MMP-1的功能。结果BMSCs在实验组脱细胞瓣膜表面生长良好,MMP-1的表达比对照组降低。结论环氧氯丙烷处理的脱细胞猪主动脉瓣膜支架,可以抑制BMSCs的MMP-1表达。     

骨髓间充质干细胞和猪去细胞瓣膜支架构建组织工程瓣膜

目的 探讨运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜支架构建组织工程心脏瓣膜的方法.方法 体外培养、扩增自体骨髓间充质干细胞并鉴定,接种于以曲拉通-脱氧胆酸钠、RnaseⅠ和DnaseⅠ去细胞的猪心脏瓣膜支架上,形成细胞材料复合物,体外培养7 d,将该复合物移植于裸鼠腹腔,4周后行组织学检测.结果 骨髓间充质干细胞具有与成纤维细胞相似的生物学特性,表达ASMA,Vimentin抗原,去细胞瓣膜去细胞彻底,骨髓间充质干细胞可在支架表面良好生长,形成表面光滑的细胞层,分泌细胞外基质,生长好.在裸鼠体内可继续扩增,形成多层细胞.结论 运用组织工程技术以骨髓间充质干细胞和去细胞猪心脏瓣膜可生成初级组织工程瓣膜.     

液氮冻融联合胰蛋白酶消化脱细胞法构建猪心脏瓣膜支架的研究

目的探讨液氮冻融联合胰蛋白酶消化脱细胞法构建猪心脏瓣膜支架的效果。方法将新鲜的猪心脏瓣膜剪成约1cm×1cm的小块,按随机数字表法分为实验组、对照组和未处理组,每组设5个重复标本。3组标本经液氮冻融后,实验组采用0.6%胰蛋白酶和5%十二烷基硫酸钠（SDS）各处理3d;对照组采用5%SDS处理6d;未处理组置于无菌0.9%氯化钠溶液中常温静置6d。通过HE染色和丽春红-苦味酸染色、残留DNA定量及α-Gal抗原检测确定脱细胞效率。将脱细胞的猪心脏瓣膜在大鼠皮下包埋2周,通过茜素红染色观察其抗钙化潜能。结果实验组的猪心脏瓣膜标本细胞成分基本去除,细胞外基质结构完整;残留DNA含量、α-Gal抗原分别为（55.6±16.8）滋g/g、0.02±0.01,明显低于对照组的（750.4±178.1）滋g/g、0.14±0.02（均P＜0.01）。大鼠皮下包埋2周后,实验组钙化结节明显少于对照组（P＜0.01）。结论应用液氮冻融联合胰蛋白酶消化构建的脱细胞猪心脏瓣膜基质可能是组织工程瓣膜的良好支架。     

向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的以绵羊骨髓间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化（MSC-ECs）作为种子细胞,去细胞猪主动脉瓣为支架,体外三维构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）。方法羊骨髓穿刺液,以Percoll梯度分离液离心法获取骨髓间充质干细胞（MSCs）,在内皮细胞诱导分化液中体外培养、扩增,鉴定;以酶消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,将体外培养扩增的诱导分化后的MSCs种植于支架上,体外三维培养,构建组织工程心脏瓣膜,研究细胞功能及组织学结构。结果MSC-ECs为梭形的成纤维细胞状形态,呈网格状排列;α-SMA、Vimentin、CD-31及Ⅷ因子细胞免疫染色阳性,培养上清液NO及ET-1分别为（165．6±8．9）μmol／L及（50．6±5．6）ng／L,其中NO值明显高于未诱导组（P〈0．05）,猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;诱导分化的MSCs在支架上生长良好,形成完整的细胞层。结论MSCs在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建TEHV。     

体外构建组织工程心脏瓣膜动物实验初步研究

目的探讨应用去细胞猪主动脉支架(decellularized porcine aortic valve scaffold，APAVS)与兔骨髓干细胞(rabbit bone marrow stromal cells，RBMSCs)体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法采用去垢剂-核酸酶消化法处理，去除猪主动脉瓣细胞成分，并做去细胞前后的形态学检查和生物力学测定；在去细胞支架上种植兔骨髓干细胞，行形态学检查和免疫组化测定。结果光镜及电镜证实，猪主动脉瓣膜中的细胞成分可完全去除，获得完整无细胞的纤维网状支架；瓣叶去细胞前后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化；种植的RBMSCs可在ACPAV表面形成一层连续的细胞层。结论种植RBMSCs于ACPAV上，可体外构造组织工程人工心脏瓣膜。     

新型防钙化无支架生物心脏瓣膜的毒性试验研究

目的 对采用环氧氯丙烷和Triton X-100联合处理的新型防钙化无支架生物心脏瓣膜进行临床应用前毒性试验研究。方法 参考美国《ASTM医用装置标准》试验方法，对该生物瓣膜进行细胞毒性、小鼠全身毒性、溶血、皮内注射刺激等试验。结果 （1）直接接法细胞毒性试验表明，该种生物瓣膜对L－929小鼠成纤维细胞株的生长无明显毒性作用；（2）用该材料的浸提液进行小鼠全身毒性、溶血试验、皮内注射刺激试验，表明毒性符合《ASTM医用装置标准》要求；（3）戊二醛处理的猪主动脉瓣，经环氧氯丙烷和Triton X-100联合化学改性后，毒性较单纯戊二醛处理的猪主动脉瓣减轻。结论 对新鲜猪主动脉瓣依次用戊二醛、环氧氯丙烷、Triton X－100联合防钙化处理，再以独特的缝合技术制作的新型防钙化无支架生物心脏瓣膜，从本组毒性试验研究的结果看符合美国《ASTM医用装置标准》，有开发和利用价值，可以进一步进行试验研究。     

MMP-2,9在羊膜移植治疗小鼠单疱病毒性角膜炎中的表达

目的:观察保存人羊膜移植(AMT)对单疱病毒性角膜基质炎(HSK)中基质金属蛋白酶(MMPs)在小鼠角膜中表达的影响,从而探讨羊膜移植对MMP-2,9的调节作用及对HSK治疗的潜在作用。方法:雌性BALB/c小鼠眼角膜接种Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-1,SM44毒株)以诱发单纯疱疹性角膜炎。选取右眼感染2 d后出现典型树枝状上皮病变的小鼠40只,随机分为实验组和对照组,实验组小鼠右眼角膜行AMT,对照组仅缝合睑裂不行AMT。术后第0,2,7,14天处死动物取出角膜,应用Western blot方法对结果进行分析,增强化学发光法(ECL)检测小鼠角膜中MMP-2,9的表达。结果:在对照组,角膜中MMP-2,9在第2天表达增加,第7天表达暂时减弱,第14天时达高峰。实验组羊膜移植2 d后角膜炎症反应明显消退且上皮缺损较快愈合,MMP-2,9阳性表达减弱,各时间点MMP-2,9的表达均低于对照组,其差异均有显著性意义(P<0.01)。结论:羊膜移植术可通过抑制角膜细胞及浸润的炎症细胞产生的MMP-2,9,促进快速上皮化并减轻角膜基质炎症反应,抑制角膜新生血管化和溃疡的形成。     

去抗原异种松质骨与骨髓基质干细胞相容性研究

目的：了解去抗原异种松质骨（AEXCB）对骨髓基质干细胞增殖的影响，为细胞移植载体的选择提供依据。方法：取新生小牛股骨下端松质骨经物理化学处理，制成去抗原异种松质骨载体，与兔骨髓基质干细胞（BMSC）体外复合培养，通过扫描电镜、MTT测试法、考马斯亮蓝和碱性磷酸酶（ALP）活性检测法，观察去抗原异种松质骨材料对细胞生长、增殖及功能表达的影响。结果：骨髓基质干细胞能在AEXCB材料上粘附、增殖，细胞形态良好。去抗原异种松质骨与BMSC作用后ALP活性的吸光收（OD）值，与对照组比较无显差异。结论：去抗原异种松质骨材料无细胞毒性作用，具有良好的细胞相容性。可用作骨组织工程的支架材料。     

MicroRNA-183对急性主动脉夹层细胞外基质重塑的作用及其机制研究

目的 探讨microRNA-183(miR-183)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在急性主动脉夹层（AAD）中的表达水平及其参与调节平滑肌细胞细胞外基质（ECM）的机制。方法 收集20例确诊为AAD的组织标本作为AAD组,20例无主动脉病变的冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的组织标本作为NC组,采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blotting检测检测miR-183、MMP-9蛋白相对表达量。将人主动脉平滑肌细胞（HASMC）分为3组：Mimic组、Inhibitor组和对照组;Mimic组用miRNA-183 mimic转染HASMC;Inhibitor组用miRNA-183 inhibitor转染HASMC,对照组未做处理。采用qRT-PCR和Western blotting检测miR-183、MMP-9 m RNA、MMP-9蛋白及其底物弹性蛋白（Elastin）的表达。结果 AAD组miRNA-183相对表达量低于NC组（P <0.05）,而MMP-9蛋白相对表达量高于NC组（P <0.05）。与对照组比较,Mimic组miRNA-18...     

去细胞组织工程心脏瓣膜构建的实验研究

目的:探讨人脐静脉内皮细胞(HUVECs)种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜的可行性。方法:测定瓣叶去细胞前、后的生物力学性能;观察去细胞瓣叶上内皮细胞生长情况。结果:瓣叶去细胞可获得完整无细胞的纤维支架,瓣叶去细胞前、后的生物力学性能无差异;内皮细胞在去细胞瓣叶表面生长,形成一层基本连续的细胞层。结论:去细胞瓣叶组织是一种良好的纤维支架,可以用于构建组织工程瓣膜;内皮细胞种植在去细胞瓣叶上构建组织工程心脏瓣膜是可行的。     

改良去细胞方法对猪源性逆转录病毒的影响

目的观察改良的去细胞方法对猪主动脉瓣膜的猪源性逆转录病毒的影响。方法用0．1％胰酶消化猪主动脉瓣后,再用TritonX-100-DNA酶／RNA酶洗脱消化,结合溶液渗透压改变等去除细胞;取新鲜猪瓣、猪外周血标本和去细胞猪瓣各20只,降主动脉内移植去细胞猪瓣后的犬外周血10例,以PK15细胞系为对照,采用PCR和RT-PCR法检测猪源性逆转录病毒。结果经去细胞处理后猪瓣内的细胞成分完全去除,纤维支架和力学性能保持良好;新鲜猪瓣及猪外周血标本均检测到219bp的扩增条带,与Medline公布的猪源性逆转录病毒有90％～95％同源性;去细胞猪瓣及移植了去细胞猪瓣犬的外周血,均未测到该病毒。结论改良的去细胞方法可以去除猪心瓣膜的猪源性逆转录病毒,能够有效预防该病毒物种间的交叉感染。     

Decellularized aorta of fetal pigs as a potential scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft

Background For cardiovascular tissue engineering, acellularized biomaterials from pig have been widely investigated. Our purpose was to study mechanical properties and biocompatibility of decellularized aorta of fetal pigs （DAFP） to determine its potential as scaffold for small diameter tissue engineered vascular graft. Methods Descending aorta of fetal pigs was removed cells using trypsin, ribonuclease and desoxyribonuclease. Mechanical properties of DAFP were evaluated by tensile stress-strain and burst pressure analysis. Assessment of cell adhesion and compatibility was conducted by seeding porcine aortic endothelial cells. To evaluate biocompatibility in vivo DAFP was implanted subcutaneously into adult male Sprague Dawley rats for 2, 4 and 8 weeks. Results Histochemistry and scanning electron microscopy examination of DAFP revealed well-preserved extracellular matrix proteins and porous three-dimensional structures. Compared with fresh aorta, DAFP had similar ultimate tensile strength, axial compliance and burst pressure. Cell culture studies in vitro showed that porcine aortic endothelial cells adhered and proliferated on the surfaces of DAFP with excellent cell viability. Subdermal implantation demonstrated that the DAFP did not show almost any immunological reaction and exhibited minimal calcification during the whole follow-up period. Conclusion The DAFP has the potential to serve as scaffolds for small diameter tissue engineered vascular graft.     

异种牛颈静脉带瓣管道重建右室流出道的实验研究

目的观察去细胞牛颈静脉带瓣管道（BJVC）重建猪右心室流出道后的血流动力学。方法应用经去细胞（B组）及未去细胞（A组）的牛颈静脉带瓣管道分别进行猪肺动脉与右心室连接,行超声心动图检测牛颈静脉带辫管道血流动力学参数。结果重建术后3个月16头猪均存活。A组及B组牛颈静脉近端及远端吻合口口径、牛颈静脉反流量差异无统计学意义,A组近端及远端吻合口压差、跨瓣压差大于B组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论去细胞化的牛颈静脉可能是一种更好的重建右室流道材料,但远期效果需进一步研究。     

猪主动脉组织工程瓣膜制备的初步研究

目的：初步探索猪主动脉组织工程瓣膜的制备方法。方法：经胰酶－EDTA、表面活性剂、核酸酶处理，去除猪主动脉瓣的细胞成分，测定瓣叶去细胞前、后的生物力学特性，并在其表面种植BAECs。结果：猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全被去除，获得完整无细胞的纤维网状支架，瓣叶去细胞前、后的断裂强度和断裂伸长率无明显变化，瓣膜近端存留的主动脉壁中的细胞一半被去除；种植的BAECs在去细胞瓣膜表面、主动脉内膜形成一连续的细胞层。结论：猪主动脉瓣膜去细胞后获得的纤维支架适宜血管内皮细胞的生长，可以用来构建组织工程瓣膜。     

骨髓间质干细胞和脱细胞基质构建组织工程血管的动物实验

目的以骨髓细胞作为种子细胞,血管脱细胞组织基质作为支架、构建组织工程血管。方法分离小猪骨髓单个核细胞,分别置于内皮细胞培养液和平滑肌细胞培养液中培养,观察分化细胞的抗原标志;多步骤法制备犬血管脱细胞组织基质,将未经分化的骨髓单个核细胞种植于脱细胞基质构建组织工程血管,移植至骨髓供体小猪,代替部分肺动脉血管。结果小猪骨髓细胞经内皮细胞培养液或平滑肌细胞培养液培养后,分别出现成熟内皮细胞或平滑肌细胞的形态学改变,并分别表达内皮细胞或平滑肌细胞的特异性抗原;组织工程血管移植100d后管腔通畅,无血栓、钙化或动脉瘤形成,内皮细胞和平滑肌细胞分化、增殖良好;移植血管的最大负载为2．76N,最大伸长度为20．31mm。结论骨髓单个核细胞复合脱细胞基质可成功构建组织工程血管。     

再细胞化牛心包纤维支架试片体内移植:1年的动物实验研究(英文)

目的进一步观察移植后内皮细胞（EC）抗切应力和抗钙化能力以及肌成纤维细胞迁移和自身修复能力。方法新鲜牛心包片经脱细胞、鞣制、改性后备用；A、B组试片上依序种植宿主肌成纤维细胞和EC，C组试片上不种植细胞，随后将3组试片分别移植于猪的腹主动脉壁上；2个月后对A组试片，12个月后对B、C组试片进行厚度、钙含量、扫描电镜及组织学的检测。结果A、B组试片钙含量显著低于C组（P〈0．05），但显著高于新鲜牛心包（P〈0．05）；A、B组试片钙含量差异无显著性（P〉0．05）；A、B组试片显著厚于C组试片（P〈0.05），A、B组试片的厚度差异无显著性（P〉0．05）；B组试片80％～90％的表面覆盖EC，肌成纤维细胞已迁移至表层下支架的3／4；C组试片表面无细胞，肌成纤维细胞已迁移至表层下支架的1／4～1／3，大部分胶原纤维间隙消失。结论人工EC化使生物材料抗钙化能力增强；种植肌成纤维细胞使生物材料具有自身修复能力。但增厚的瓣叶是否影响其功能，尚有待进一步研究。     

环氧氯丙烷法活化琼脂糖凝胶及其动力学分析

[目的]探索环氧氯丙烷法活化琼脂糖凝胶的最佳反应条件,建立活化反应动力学模型。[方法]研究了活化反应中氢氧化钠、环氧氯丙烷和硼氢化钠的浓度以及反应温度、时间和溶剂对活化反应的影响。通过测定活化反应中环氧基的浓度,计算反应的活化度,以确定环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶的最佳反应条件。对影响活化反应的主要因素进行分析,建立活化反应动力学模型。[结果]环氧氯丙烷法活化琼脂糖凝胶的最佳反应条件为:5g琼脂糖、7.5mL0.8mol/L氢氧化钠、2mL环氧氯丙烷以及10mg硼氢化钠于25℃反应8h。根据活化反应动力学模型推导出了反应过程的宏观动力学公式。[结论]对影响活化反应的主要因素进行了分析,确定了环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶的反应条件。将琼脂糖凝胶活化实验结果与动力学公式计算结果相比较,发现二者基本一致。