大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

小鼠胚胎神经干细胞体外培养及鉴定的实验研究

目的:探讨小鼠胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法:分离孕13～15d的小鼠胚胎脑组织,在加入碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的B27无血清培养基中克隆培养,并用10%的胎牛血清诱导其贴壁分化,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白(Nestin),β-微管蛋白(β-tublin),胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色,对神经干细胞(NSCs)及其分化的细胞进行鉴定。结果:分离培养的细胞可形成典型的神经球,并传代。细胞表达神经巢蛋白,并可诱导分化为神经细胞和神经胶质细胞。结论:小鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下大量增殖,并且具有多向分化潜能。     

胎鼠大脑皮层神经干细胞的分离培养、分化及鉴定

目的:建立胎鼠大脑皮层神经干细胞体外分离、培养、分化及鉴定的方法,探讨神经干细胞的基本生物学特性.方法:取孕14 d胎鼠大脑皮层,吸管吹打机械分离制成单细胞悬液,采用无血清培养和胎牛血清诱导分化,应用免疫荧光技术鉴定神经干细胞及其分化的子代细胞.结果:从胎鼠大脑皮层分离的细胞呈神经巢蛋白(Nestin)免疫阳性并能在体外传代培养,血清诱导分化后的细胞可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白,诱导分化成的神经元能表达突触的特异性标志Synatophymin.结论:分离和培养的细胞能表达神经干细胞的特异性标志物Nestin,并且具有很强的增殖能力和多向分化潜能,属于中枢神经系统的神经干细胞.     

人类神经干细胞的长期培养和传代

【目的】探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。【方法】采用机械方法从胎脑中分离神经细胞 ,应用N2培养基进行培养 ,碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮生长因子 (EGF)刺激细胞扩增 ;传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养 ;应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。【结果】从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞 ,培养条件下呈悬浮状态生长 ,形成神经球 ,绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物 ;这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞 ,早期的培养有少量的少突胶质细胞 ;在这种培养条件下 ,神经干细胞生长速度较慢 ,而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系 ,神经干细胞可获得较大的扩增速度。【结论】体外的培养条件下 ,可从胎脑组织中培养出神经干细胞 ,它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

新生大鼠海马神经干细胞的体外培养及鉴定

目的探讨新生大鼠海马神经干细胞（NSC）的体外培养和诱导分化的条件和特点。方法分离出生1d大鼠海马,在表皮生长因子、碱性成纤维生成因子和B27联合作用下使其稳定增殖,用5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记处于增殖状态的神经干细胞,应用免疫荧光染色方法行巢蛋白（Nestin）、5-溴脱氧尿苷（BrdU）、β-Ⅲ型微管蛋白（Tuj-1）、波形蛋白（Vimentin）和Galc-C免疫荧光染色,对NSC的增殖及其分化的细胞进行鉴定。结果体外培养的NSC增殖成神经干细胞球并传代,鉴定为Nestin染色阳性细胞和5．溴脱氧尿苷（B枷）标记染色阳性细胞,并可诱导分化为神经元细胞（Tuj-1染色阳性细胞）、神经胶质细胞（Vimentin染色阳性细胞）和少突胶质细胞（Galc-C染色阳性细胞）。结论采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的新生大鼠海马NSC。     

人胎脑神经干细胞的体外分离、培养与鉴定

目的探索人胎脑神经干细胞的体外分离培养条件,从而在体外大量增殖神经干细胞,并观察神经干细胞增殖和分化的特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮细胞生长因子（EGF）的无血清培养技术,从14周自愿水囊引产人胎脑海马皮质中分离出神经干细胞,并进行培养、传代、分化观察,应用免疫荧光细胞化学技术对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果从14周人胎脑皮质中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续增殖能力,可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞和胶质细胞的特异性抗原。结论在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,从人胎脑能分离培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞,并能在体外扩增,可进一步用于基础及临床研究。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养和分化

探索大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和传代等方法,并用血清促使分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞。方法从胚胎大鼠脑组织中分离得到神经干细胞;在无血清条件下,对神经干细胞进行培养、传代;用神经上皮干细胞蛋白（Nestin）对神经干细胞进行箍定;用免疫荧光方法对分化后神经干细胞进行神经纤维丝蛋白（NF68）、神经胶质酸性蛋白（GFAP）和半乳糖脑苷脂（Gale）染色。结果成功得到神经干细胞,并且进行多次传代培养。血清能促使其分化成为神经元细胞、星形胶质细胞和少枝胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外适宜的条件下能大量增生,并且具有多向分化潜能。     

大鼠胚胎脊髓源性神经干细胞的培养和分化

目的探讨大鼠脊髓源性胚胎神经干细胞体外分离培养增殖及分化,为进一步的实验研究提供基础。方法取孕14~16 d的SD大鼠胚胎脊髓在条件培养基中培养增殖传代分化,用神经干细胞特异性抗体—巢蛋白(Nestin)鉴定克隆细胞,用特异性的单克隆抗体鉴定克隆球诱导分化后的细胞。用Brdu免疫荧光对神经干细胞传代能力检测。结果获得了大量能自我增殖并分化的神经干细胞,分化后主要产生神经元特异性微管相关蛋白染色阳性的神经元质纤维酸性蛋白阳性的星型胶质细胞和少突胶质细胞三种神经组织细胞。Brdu免疫荧光显示神经球中绝大多数细胞为Brdu阳性细胞,其细胞核中可见荧光标记物。结论大鼠胚胎脊髓能分离、培养出神经干细胞,并能诱导分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶细胞。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

目的：探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。方法：采用机械方法从胎脑中分离神经细胞，应用N2培养基进行培养，碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子(EGF)刺激细胞扩增；传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果：从流产胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashi1两种神经干细胞的标志物；这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞，早期的培养有少量的少突胶卷质细胞；在这种培养条件下，神经干细胞生长速度较慢，而采用切割神经球的方法保持了细胞间的联系，神经干细胞可获得较大的扩增速度。结论：体外的培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

bFGF、EGF对新生大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的　观察碱性成纤维生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)对新生大鼠海马神经干细胞生长和分化的影响。方法　从新生大鼠海马分离培养神经干细胞 ,采用免疫荧光法检测神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)的表达 ,使用bFGF、EGF作为诱导因子 ,通过免疫荧光染色和流式细胞仪分选细胞的方法检测神经干细胞分化为 3种神经细胞的状况。结果　取材细胞大部分为Nestin免疫阳性细胞 ,各实验组均可促进培养细胞的生长和分化 ,bFGF能明显增加神经元特异性烯醇化酶 (NSE)的表达 (P <0 .0 5 ) ,EGF能明显增加胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达(P <0 .0 5 )。结论　bFGF倾向于诱导干细胞增殖并向神经元方向分化 ,EGF则倾向于诱导干细胞向胶质细胞分化 (P <0 .0 5 )。     

躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

目的探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上立体培养后复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究。方法采用孕10．5dWistar大鼠的胚胎神经管分离培养躯干神经嵴干细胞,将体外培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性。应用黏附有躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管桥接了缺损的大鼠坐骨神经,术后进行电生理、组织学检测,观察了周围神经再生及神经通路重建的状况。结果从神经管取材的躯干神经嵴干细胞在无血清培养基内可以大量扩增;将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维支架材料上行扫描电镜观察,可见躯干神经嵴干细胞贴附在壳聚糖纤维表面,存活良好,表明躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维支架材料有良好的相容性;桥接手术后,电生理检测结果显示,含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖一硅胶管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯硅胶管桥接组（均P〈0．01）;甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示含躯干神经嵴千细胞的壳聚糖一硅胶管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显,再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯硅胶管桥接组（均P〈0．01）。结论壳聚糖纤维支架材料与躯干神经嵴干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性,其中躯干神经嵴干细胞可分化为施万细胞,以此桥接缺损的周围神经,可促进其再生和修复。     

大鼠胚胎大脑皮层源性神经干细胞体外培养及增殖分化特点

目的 建立大鼠胚脑皮层神经干细胞体外培养及鉴定技术,探讨其增殖分化特性,为应用神经干细胞移植治疗神经疾病提供基础。方法 采用含有丝分裂源表皮生长因子(EGF)的无血清培养基培养SD大鼠孕14．5d的胚胎大脑皮层神经干细胞,应用免疫细胞化学方法了解其增殖分化特性;以单细胞克隆实验及BrdU免疫标记证实神经干细胞自我增殖能力。结果 培养细胞在EGF作用下可分裂增殖,并表达神经干细胞特异性抗原nestin,分化细胞MAP2及GFAP抗原表达阳性。结论 SD大鼠胚脑皮层可分离培养出神经干细胞;并具有增殖、自我更新能力和多向分化潜能特性。     

ICR胎鼠原代神经元细胞培养及鉴定

目的 建立较理想的胎鼠神经元细胞体外原代培养方法。方法 取13.5 d ICR胎鼠的大脑皮层,经剪碎消化得到单细胞悬液进行培养,观察细胞形态并作PCR及Western blotting等进行神经元相关的基因及蛋白Tuj1和Map2的鉴定。结果 细胞生长状态良好,细胞胞体明显,周围有明亮光晕,细胞突触交错形成网络样,通过PCR及Western blotting验证证明所分离培养的细胞是神经元细胞。结论 本培养方法简单易行,可获得典型和纯度较高的ICR胎鼠大脑皮层神经元细胞。     

鼠胚心肌细胞体外培养模型的建立

目的建立经济适用的小鼠胚胎心肌细胞的分离、培养和鉴定方法。方法取不同胚龄小鼠心脏,采用不同方法进行消化、接种、体外增生、鉴定。结果用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA混合消化液,短时间、分步消化孕12 d鼠胚的心脏。将获得的细胞悬液接种于胎牛血清包被的培养皿中,采用pH值为7.2~7.4的HAM’S F12加20%胎牛血清培养液进行培养,所获得的细胞经PAS反应及免疫组化鉴定显示约80%的细胞为心肌细胞。结论建立的鼠胚心肌细胞培养模型可进行胚胎心脏发育毒性的体外研究。     

小鼠胚胎干细胞体外分化为神经前体细胞的研究

目的 探索小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cell,ES cell）体外分化为神经前体细胞（Neural precursor cells,NPC）的无血清培养条件,比较人胚胎成纤维细胞（Human embryonic fibroblasts,HEF）与小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts,MEF）对小鼠ES细胞生长的作用。方法 在MEF或HEF饲养层上培养ES细胞,培养液中含白血病抑制因子。采用无血清方法培养NPC,免疫组化方法检测巢蛋白（Nestin）,用硝基四氮啖蓝/5-溴-4-氯-吲哚基磷酸（NBT/BCIP）显色检测碱性磷酸酶。结果 无血清培养可以获得86%的NPC。HEF与MEF-样能维持ES未分化状态。结论 无血清培养方法有利于ES细胞向NPC分化,HEF可用于小鼠ES细胞的培养,而且比MEF优越。     

躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维组织相容性的研究

目的 探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维的相容性.方法 采用神经管植块法培养躯干神经嵴干细胞,并行免疫荧光细胞化学双重染色鉴定,将培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性.结果 采用神经管植块法培养的神经嵴干细胞,免疫细胞化学染色呈现neatin及P75双阳性,将其接种在壳聚糖纤维支架材料上,可见神经嵴干细胞贴附于壳聚糖纤维上生长;S-100免疫细胞化学染色显示,S-100阳性细胞突起的末端呈扁平状膨大;扫描电镜显示,壳聚糖纤维上的躯干神经嵴干细胞为梭形,呈现"端对端"、"肩并肩"排列,伸出爪形伪足贴附于壳聚糖纤维上.结论 躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维有良好的组织相容性,并可分化为Schwann细胞.     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成GABA能神经元

目的探讨小鼠胚胎干细胞在体外培养向GABA能神经元定向诱导分化的可能性。方法将小鼠胚胎干细胞以"无血清"方法培养,用DMEM/F12、N2、B27及NT4作为诱导分化剂定向诱导分化,分化好的细胞利用免疫荧光技术、流式细胞技术和RT-PCR鉴定。结果在胚胎干细胞诱导分化成神经元后期,免疫荧光显示有GABA能神经元存在;RT-PCR结果证实有GABA能神经元正确分化的重要调控基因Viaat、Gad1和Gad2基因表达;流式细胞仪计数结果显示GABA阳性细胞约占总细胞数的(11.49±6.86)%。结论小鼠胚胎干细胞经体外培养可以定向诱导分化成GABA能神经元,可作为神经移植的新来源。     

人胚胎生殖系细胞分离与体外培养的初步研究

目的:初步探讨人胚胎生殖系细胞的分离与体外培养.方法:体外分离人胚胎生殖嵴和肠系膜组织,按单纯机械分离、酶消化分离、二者结合法及是否有饲养层将组织分为5种不同的方式培养后,用碱性磷酸酶标记,计数阳性克隆并进行比较.结果:酶消化法培养所获得的克隆较单纯机械分离方法多,原代培养时种植到饲养层上效果较好.将分离到的组织用0.25％胰酶消化3 min,种植到丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞上培养3 d,挑取克隆传代,在第10天形成30.7 个阳性克隆,显著高于其他方法获得的阳性克隆数.用碱性磷酸酶标记的细胞(克隆)具有多样性,细胞胞体为圆形,分为有突起和无突起两种;阳性细胞克隆呈圆球形、条带形和块形,与周围细胞分界清楚.结论:人胚胎体内的微环境限制生殖系细胞的体外扩增培养,原代培养需要在饲养层上进行且宜用酶消化法尽早传代.     

两种来源小鼠胚胎干细胞的分离与培养

从小鼠早期胚胎和原始生殖细胞中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:取小鼠3.5天胚龄的囊胚,培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,3 ～4天后分离出内细胞团再培养;取13.5天胚龄胚胎的生殖嵴组织,分离出原始生殖细胞,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养;观察两种来源的细胞集落生长行为,并用AK P染色鉴定细胞集落.结果:两种来源的细胞集落均具有ES细胞鸟巢状典型特征,AKP染色阳性.结论:两种来源的小鼠胚胎干细胞均可分离和培养.     

体外培养人胚晶状体上皮细胞生长特性的研究

目的观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法组织块贴壁法培养人胚晶状体上皮细胞,通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜,采用免疫细胞化学法分析人胚晶状体上皮细胞的生长特性。结果体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48～72 h后从组织块边缘长出,具有上皮细胞的形态特点,第10天达到融合。第二代人胚晶状体上皮生长曲线近＂S＂形,经过1～2 d的潜伏期后进入对数生长期,需10 d左右达到融合,细胞形态呈六角形或椭圆形、超微结构保持正常,免疫细胞化学SABC法染色结果显示细胞浆内α-晶状体蛋白染色阳性。结论人胚晶状体上皮细胞具有增殖能力,第二代人胚晶状体上皮细胞是进行白内障相关研究的合适实验对象。