分离扩增肋软骨细胞在三维支架上的种植与培养

背景:外科长段气管切除后,需要应用气管替代物,理想的替代材料需具有相当的强度、可弯曲性以及内面覆盖的上皮。合适的种子细胞、性质优良的载体、良好的生长媒介是组织工程化气管构建中最重要的组成部分。目的:寻找分离培养肋软骨细胞的最佳方法,构建软骨-支架模型。方法:将取出的兔第5,6肋软骨切成组织片,经胰酶、蛋白酶消化或酶处理后贴壁,分离肋软骨细胞并扩增。传代2次后种植于聚乳酸羟基乙酸或涤纶支架上,继续载体外环境下培养。观察单层培养扩增中软骨细胞的形态、结构,及在支架上培养时的细胞生长状态、外分泌基质。结果与结论:酶消化法和组织块培养法所获细胞均为原代肋软骨细胞,单次传代时间为5d,但组织块培养法分离细胞较慢,且存在成纤维细胞污染情况,提示酶消化法适合用于肋软骨细胞的分离。肋软骨细胞种植于支架后贴附良好,第2周时可见基质分泌,获得软骨-支架模型,可用于构建组织工程化气管。     

小鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养及生物学特性

 目的：探讨一种高效、稳定的从小鼠心肌组织中分离培养心肌微血管内皮细胞的方法并观察细胞的生物学特性。方法：以多聚赖氨酸对培养皿作预包被, 采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁分离法，结合内皮细胞专用培养基，分离培养微血管内皮细胞并进行扩增。利用倒置显微镜观察细胞生长情况；台盼蓝法、绘制生长曲线和MTT法分别测定心肌微血管内皮细胞传代成活率、不同代生长及增殖特征；以DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1荧光双标，结合CD31、vWF和CD34 免疫荧光鉴定细胞表面特异性抗原；体外血管形成实验检测心肌微血管内皮细胞的功能。结果：酶消化、差速贴壁法分离培养2 d后，细胞呈散在的、小簇状聚集性生长，4~5 d迅速生长呈单层排列，细胞为梭形、三角形或多角形，7～8 d后呈铺路石样即可传代；传代细胞经台盼蓝法检测成活率均为95%以上；第1、3代细胞生长曲线近似“S”形，MTT法显示第1、3代细胞在第2～4 d吸光度变化较明显（P<0.05）；随传代次数的增加，第5代细胞生长曲线近似平缓，吸光度无明显变化，细胞逐渐衰老； DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1 荧光双标阳性率为(89.2±3.5)%，相关特异性抗原CD31、vWF和CD34 免疫荧光鉴定阳性率为(56.7±3.7)%、(78.5±2.6)%和(67.8±4.2)%；体外血管形成实验显示，6～12 h后出现明显的管腔结构。结论：以多聚赖氨酸作预包被，采用Ⅱ型胶原酶消化、差速贴壁法并结合内皮细胞专用培养基，可获得纯度较高的小鼠心肌微血管内皮细胞，为心脏疾病的研究提供种子细胞。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。 目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。 方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5~7 d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。 结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P > 0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。     

兔颈静脉内皮细胞的原位消化、体外获取及培养

目的 建立兔颈静脉内皮细胞原位消化、体外获取及培养的方法.方法 仅解剖游离单侧兔颈静脉,并保留在原位,对侧颈静脉不进行解剖游离.阻断该静脉段的两端并插管,向该静脉段内灌注Ⅰ型胶原酶进行原位消化.切取该颈静脉段,离体状态下获取兔颈静脉内皮细胞,使用EGM-2培养基培养并传代.倒置显微镜、透射电镜观察获取的兔颈静脉内皮细胞,免疫组化法检测Ⅷ因子.结果 获取的兔颈静脉内皮细胞原代培养7～10d左右可达到80％融合.光镜下细胞为短梭形或多角形,呈“鹅卵石”样排列.透射电镜可见内皮细胞特征性的Weibel-Palade小体.兔Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测阳性.获取的兔颈静脉内皮细胞进行冻存、复苏和传代后均可以正常生长.结论 成功建立了兔颈静脉内皮细胞原位消化、体外获取及培养的方法.     

分次胶原酶消化法分离、培养成人肺微小动脉平滑肌细胞

目的：建立一种简便、高效分离和培养成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法并鉴定该方法培养的传代细胞生物学特性。方法：分次胶原酶消化法与传统胶原酶消化法进行细胞获得率、细胞存活率及培养成功率比较;绘制生长曲线对原代与传代细胞的生长特性进行分析;细胞形态学观察、平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）测定及细胞免疫荧光化学法进行细胞鉴定及纯度计算;比较原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、染色体数量及形态。结果：分次胶原酶消化法优于传统胶原酶消化法,细胞获得率（3.10±0.29 vs 1.20±0.35）×108 cells/L、细胞存活率(69% vs 21%)及培养成功率（61.5% vs 16.7%）（P＜0.01);传代细胞长至融合时间7 d快于原代细胞21 d;细胞显典型的“峰-谷”状生长,胞浆内表达SMα-actin,细胞纯度达98%以上;原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、二倍体数量（78.13% vs 76.47%）及形态无明显差别（P＞0.05）。结论：分次胶原酶消化法是一种简便、可行,获得高纯度、功能良好的成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法。经过此方法分离、培养的细胞在10代以内传代培养细胞生物学及遗传学特性稳定,可用于实验。     

乳兔成骨细胞原代培养与鉴定:改良胶原酶与胰酶的分段消化

背景:成骨细胞获取的方法较多,如何简便而迅速的获得高纯度的成骨细胞成为研究的热点。目的:比较组织块法、胶原酶消化法、改良胶原酶和胰酶分段消化法体外培养纯化乳兔颅骨来源的成骨细胞结果及其细胞的生物学特点。方法:取新生24 h内新西兰大白兔乳兔颅盖骨,采用组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶和胰酶分段消化法分离获取兔原代成骨细胞,并进行传代培养。通过倒置显微镜下形态学观察、锥虫蓝排斥法计数活细胞率及MTT法绘制细胞生长曲线、茜素红染色、细胞培养上清液碱性磷酸酶和骨钙素检测、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学法和RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达等对成骨细胞进行鉴定。结果与结论:分离培养的成骨细胞均一性好、增殖能力强,具备成骨细胞的典型特征,茜素红染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅲ型胶原免疫组织化学染色阴性,细胞培养上清液碱性磷酸酶、骨钙素均有表达,PT-PCR结果有Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素mRNA表达。改良胶原酶和胰酶分段消化法较传统胶原酶消化法有更高的细胞获取率,更好的细胞活性,且比传统胶原酶消化法耗时短(P0.05);组织块法操作方法最为简单,细胞活性最高,但是细胞产出率最低、耗时最长,不适合用于成骨细胞大规模培养。用改良的胶原酶和胰酶分段消化法可获得数量较多且纯度较高的成骨细胞,可以成为一种相对可靠、有效的原代成骨细胞的体外培养方法。     

小鼠肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

目的 建立小鼠肾小管上皮细胞(mRTECs)原代培养、传代及鉴定的方法.方法 采用肾小管节段贴块培养法与3种消化培养法(胰蛋白酶、胰蛋白酶 EDTA、胶原酶Ⅰ)进行小鼠肾小管上皮细胞原代培养,锥虫蓝染色后镜下观察消化后细胞成活率、细胞形态和数量.胰蛋白酶消化传代,以免疫细胞化学方法鉴定细胞种类.结果 贴块法和胶原酶Ⅰ消化培养法均能成功培养小鼠肾小管上皮细胞,两者相比,胶原酶Ⅰ消化培养法培养的细胞生长更快.结论 胶原酶Ⅰ消化培养法是小鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法.     

三种分离大鼠主动脉内皮细胞方法的比较研究

目的:建立一种有效的、重复性好的大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)分离方法。方法:采用外翻胶原酶消化法、瞬间热处理植环法和植块法分离RAEC,并进行培养、纯化和传代,观察细胞生长和形态,用免疫组织化学法检验Von Villebrand Factor/Ⅷ因子相关抗原进行内皮细胞鉴定。结果:采用植块法分离RAEC,5~7天后可见细胞贴壁生长,14天呈单层铺路石样分布,Ⅷ因子相关抗原阳性细胞(胞浆呈棕黄色)比率为52.3±10.6%,其他两种方法分离后未见上皮细胞贴壁生长。结论:比较外翻胶原酶消化法、瞬间热处理植环法,植块法分离RAEC能培养获得较多内皮细胞,且方法较简便,细胞污染和损伤较少,重复性好。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。