弗氏志贺菌ΔlysA突变株的构建及SILAC技术的应用尝试

目的构建弗氏2a志贺菌301株赖氨酸营养缺陷型突变株,为将细胞培养条件下稳定同位素标记(SILAC)技术应用于志贺菌蛋白质组学研究奠定基础。方法采用λ-Red重组系统对弗氏2a志贺菌301株lysA基因进行缺失,对野生株和突变株进行基本的表型测评和毒力评价,并利用双向电泳技术比较二者在全菌蛋白表达谱上的差异,最后将突变株分别在含有12C6-赖氨酸和13C6-赖氨酸的培养基中培养,根据双向电泳胶图取对应蛋白点进行胶内酶切及MALDI-TOF/TOF分析。结果成功构建了301 lysA基因缺失突变株,蛋白鉴定结果显示所取对应蛋白点为同一蛋白,在质谱图上轻重同位素峰位移为6 amu。结论本研究所构建的赖氨酸营养缺陷型突变株适合进行SILAC分析。     

志贺菌rfbA基因突变体的构建

目的构建弗氏2a志贺菌301 rfbA基因缺失突变株,初步探究志贺菌脂多糖合成与糖蛋白合成通路是否相关。方法首先用PCR扩增出rfbA基因上下游同源臂,构建含有kan基因的打靶片段,采用λ-Red重组系统对rfbA基因进行缺失,用PCR进行初步验证,然后通过LPS的银染方法进行进一步验证。随后,制备野生株、rfbA缺失突变株的全菌蛋白样品,进行双向电泳后比较野生株301和rfbA缺失株的蛋白表达谱。结果成功构建了301 rfbA缺失突变株。在LPS的银染实验中,rfbA突变株在凝胶中未形成一长串的梯状条带。在双向电泳实验中,野生株和突变株没有明显的蛋白差异点。结论获得了301 rfbA基因缺失突变体,初步认为志贺菌中不存在与脂多糖O-抗原合成相关的蛋白糖基化途径。     

弗氏志贺菌2a GadB蛋白的功能研究

目的探究gadB基因的潜在功能及其对弗氏志贺菌2a 301株致病能力的影响。方法利用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株的gadB缺失突变株,随后进行基本的表型实验测评,并初步评价其毒力,最后制备突变株和野生株全菌蛋白样品,利用双向电泳技术比较二者在蛋白表达谱上的差异。结果成功获得gadB基因缺失株;生化实验发现缺失株不能利用甘油发酵;而豚鼠角膜实验发现突变株炎症反应稍轻于野生株;全菌蛋白表达谱中发现10个差异蛋白。结论利用双向电泳鉴定到一些可能与GadB有关的蛋白,为gadB潜在功能的研究提供了线索。     

弗氏志贺菌2aphoNl基因功能的初步研究

目的：初步探讨phoN1基因在志贺菌属中的功能。方法使用λ-Red重组系统构建弗氏志贺菌2a 301株phoN1缺失突变株,通过比较蛋白质组学方法研究突变株与野生株的蛋白表达谱差异,并利用豚鼠角膜炎模型、HeLa细胞竞争侵袭实验评价两者之间的毒力差异。结果成功构建了phoN1缺失突变株,蛋白质学研究发现, phoN1缺失对其他胞内蛋白无显著影响,豚鼠角膜实验和HeLa细胞竞争侵袭实验证实,phoN1缺失不影响志贺菌属的侵袭能力。结论 phoN1在体外生存、侵袭宿主细胞过程中未发挥显著作用,其功能有待进一步研究。     

弗氏2a志贺菌CobB和GtrⅡ蛋白水平及毒力相关性的初步研究

目的研究翻译后修饰基因cobB和gtrⅡ对志贺菌致病能力的影响。方法采用λ-Red重组系统构建福氏2a志贺菌2457T的cobB,gtrⅡ缺失突变株,进行初步的毒力评价,随后制备野生株,cobB,gtrⅡ缺失突变株的全菌蛋白样品,并进行双向电泳比较野生株和缺失株在蛋白表达谱上的差异。结果成功构建cobB、gtrⅡ基因的缺失突变株,豚鼠角膜实验发现cobB、gtrⅡ缺失株症状稍弱于野生株,但在全菌蛋白表达谱中野生株和突变株并无明显差异。结论双向电泳难以有效地呈现CobB和GtrⅡ的翻译后修饰能力。     

弗氏志贺菌2a 2457T株蛋白复合体BN/SDS-PAGE电泳方法的建立

目的建立分离弗氏志贺菌2a2457T株胞内可溶性复合物的BN/SDS-PAGE电泳方法 ,并优化分离条件。方法分别比较了不同配胶方式、配胶长度以及胶条平衡方法。结果成功建立了分离弗氏志贺菌2a2457T株胞内可溶性复合物的方法。结论本实验所建立及优化的方法 ,可以有效地分离蛋白复合体,为进一步研究志贺菌属蛋白复合体奠定了基础,并对以后的实验具有一定的参考价值。     

口服福氏2a志贺氏菌T32菌苗株减毒基础分析

福氏2a志贺氏菌(下简称F2a)T32菌苗株,其质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳表明,具有志贺氏菌属共有的约120～140Mdal大小的质粒.DNA探针杂交试验证明,T32株与志贺氏菌属侵入有关的17kb或4.1kbDNA探针没有同源性.免疫印迹技术显示,T32株不表达侵袭性4种外膜蛋白(a,b,c和d).当将宋内氏志贺氏菌毒株I相大质粒诱动转移到T32株时,它又回复了侵入上皮细胞并引起豚鼠眼角膜结膜炎的能力.上述事实揭示,T32株的减毒基础在于140Mdal大质粒上与侵入有关的某些基因片段的缺失突变,而与毒力有关的染色体上的基因片段并未发生改变.     

弗氏志贺菌2aT32株asd基因缺失突变体的构建

目的：构建痢疾弗氏志贺菌２ａＴ３２的ａｓｄ基因全缺失突变体。方法；采用全菌Ｐ座痢疾弗氏２ａ Ｔ３２株染色体扩增了ａｓｄ基因及其上下游各约５００ｂｐ的染色体例 ＤＮＡ序列，并将其克隆至ｐＵＣ１８，测定其核苷酸序列，在体外用ｃｔｘＢ基因置换了ａｓｄ基因，然后将其克隆至自杀载体ｐＸＬ２７５。通过细菌酱和人同源重组，用ｃｔｘＢ基因完全取代痢疾弗氏２ａ Ｔ３２株染色体上的ａｓｄ基因。结果与结论：构建成ａｓｄ     

志贺氏菌的接触性溶血试验

本文研究了接触性溶血试验的最适条件,并应用于检测志贺氏菌的毒力.绵羊红细胞(SRBC)和福氏2a志贺氏菌(F2a)的合适浓度分别在2～6×10~9/ml和1～4×10~(10)/ml范围内;细菌在贺氏肉汤内振荡培养8～12h溶血能力最强.比较强毒肠道菌及其无毒突变株的溶血能力与毒力相符;除侵袭性大肠菌以外,志贺氏菌的溶血活性都依赖温度.实验结果表明,接触性溶血试验与志贺氏菌及EIEC大质粒编码的"侵袭相关蛋白"的表达具有相关性.该法具有简便行易、省时、结果较为稳定和客观等特点.可作为检测志贺氏菌毒力的方法之一.     

铜绿假单胞菌成孔毒素ExlA编码基因无痕缺失突变株的构建及其基本特性研究

目的 构建铜绿假单胞菌NY8755 exlA基因无痕缺失突变株(NY8755ΔexlA),研究成孔毒素ExlA的基本特性。方法 利用二次同源重组的方法构建铜绿假单胞菌exlA基因无痕缺失突变株。选取6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠,经气溶胶肺递送途径分别感染铜绿假单胞菌NY8755和NY8755ΔexlA,记录感染后7 d小鼠的生存状况和体重变化,检测小鼠肺泡灌洗液中的促炎因子。结果 经过测序验证,成功构建铜绿假单胞菌成孔毒素ExlA编码基因无痕缺失突变株。利用气溶胶肺递送途径感染小鼠(1×10⁷CFU)后,野生株组小鼠48 h内全部死亡,突变株组48 h后开始死亡且7 d后仍有40%存活;突变株组存活小鼠体重先下降,后逐渐恢复;感染12 h后野生株组小鼠肺泡灌洗液明显比突变株组血性渗出物更多(颜色更红),肺泡灌洗液中促炎因子白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-17A(IL-17A)含量有显著差异。结论 铜绿假单胞菌成孔毒素ExlA是exlA阳性的新型铜绿假单胞菌的关键毒力因子,可显著影响小鼠的生存状况,引起小鼠体内明显的炎症反应。当前关于外毒素ExlA...     

福氏与宋内氏痢疾菌双价菌苗候选株安全和免疫效果的进一步观察

给恒河猴灌服福氏和宋内氏痢疾菌双价菌苗候选株Fs-18后无任何不良反应.用粪便中分离的该株培养物进行豚鼠Sereny试验,未见有毒力回复突变.Fs-18株经口免疫的恒河猴,对宋内氏毒株和福氏2a(F2a)毒株经口感染具有明显的双重保护效果.用Fs-18株经耳静脉免疫的家兔产生高滴度的抗宋内氏菌和F2a菌的二价血清抗体.DNA探针杂交试验表明,Fs-18株与宋内氏菌侵入质粒的4.1kb Hind Ⅲ片段无同源性.     

应力作用下成骨细胞的差异蛋白质组学研究

目的 探讨应力作用下鼠成骨细胞蛋白质表达谱的变化.方法 将鼠成骨细胞分为加载组和对照组,采用四点弯曲细胞力学加载装置,以频率为0.5 Hz,应变水平2000 με条件下加载6 h后,运用双向凝胶电泳分离蛋白样品、分析差异表达蛋白点.结果 加载组和对照组分别得到（533±14）和（512±11）个蛋白点,其中有9种蛋白质表达出现明显差异,7种在应变作用后表达增高,2种降低.结论 应力作用下鼠成骨细胞的蛋白表达发生了显著变化,这些差异蛋白可能参与成骨细胞力学反应机制的不同过程.     

炭疽芽孢杆菌A16R株无菌培养滤液的蛋白质组学分析

目的：初步分析由我国炭疽疫苗株A16R所生产的无菌培养滤液中的主要成分。方法：运用免疫蛋白质组学的手段,从炭疽A16R疫苗株无菌培养滤液的二维凝胶电泳中选择与保护性抗体结合和不与该血清结合但丰度高的蛋白质点,进行质谱鉴定和信号肽分析。结果：共选择73个点,从炭疽芽孢杆菌数据库中鉴定出66个。在66个点中,有43个点与保护性血清结合;23个为高丰度蛋白,不与该血清结合。在与保护性血清结合的43个点中,13个点为不同大小的PA分子,其中相对分子质量83×10^3和63×10^3占主导,相对分子质量较小的片段仅4个。其余成分包括炭疽表面蛋白EA1、Sap、胶原黏附蛋白、伴侣分子DnaK等。结论：我们制备的炭疽无菌培养滤液中含有PA成分,PA是炭疽疫苗的重要保护性抗原。但PA以外的其他成分在抗炭疽免疫中起何种作用,是否参与诱发机体免疫应答有待进一步研究。     

海洋来源放线菌无活性野生株的链霉素抗性抗肿瘤活性突变株新产代谢产物研究

目的研究阐明无活性放线菌野生株L35-1来源硫酸二乙酯（DES）诱变链霉素抗性抗肿瘤活性突变株D2s4-1新产代谢产物及其抗肿瘤活性。方法组合利用活性跟踪与微量预试先导-放大实验制备的实验模式,通过与原始菌样品直接对照,在快速确定差异活性斑点基础上,组合利用各种色谱技术,分离纯化突变株新产代谢产物。根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。采用MTT法测定抗肿瘤活性。结果从突变株D2s4-1发酵物中分离鉴定了6个该突变株新产代谢产物,即1,9-二甲酯吩嗪（1）、2-羟基苯乙酰胺（2）、2-吡咯甲酸（3）、大豆黄素（4）、环（4-羟基-脯氨酸-亮氨酸）二肽（5）和尿嘧啶（6）。其中1、3、5和6有一定抗肿瘤活性,浓度为100μg/ml时对K562细胞的抑制率分别为33.3%、16.3%、33.3%和21.1%。结论阐明了抗肿瘤活性突变株D2s4-1的6个新产物,其中4个为活性产物。化合物1为新天然产物,其抗肿瘤活性亦属首次筛选发现。用化学诱变组合抗性筛选技术从无活性放线菌野生株转化获取的活性突变株可供筛选新产活性产物,从而拓展放线菌药源活性新菌株资源。     

产紫青霉G59的超声诱变活性突变株新产抗肿瘤活性产物

目的阐明无活性真菌野生株产紫青霉G59的超声诱变活性突变株N3001d1-1新产抗肿瘤活性产物。方法采用活性跟踪与高效硅胶薄层检测分析相结合的实验方法,组合利用各种色谱技术,通过将突变株样品与原始菌直接比对分离纯化突变株新产活性产物。根据理化性质和波谱数据鉴定化合物结构。用MTT法测试抗肿瘤活性。结果从突变株N3001d1-1发酵物中分离鉴定了2个突变株新产抗肿瘤活性产物,即橘霉素（citrinin）（1）和fructigenine A（2）。化合物1和2对K562细胞均呈抗肿瘤活性,抑制K562细胞的IC50分别为50.6μg/ml和69.1μg/ml。结论化合物1和2均为原始真菌产紫青霉G59所不生产的突变株N3001d1-1新产抗肿瘤活性次级代谢产物。研究结果表明,超声诱变技术可用于改造真菌无活性野生株的次级代谢功能并从中筛选获取活性突变株,从而拓展真菌药源活性新菌株资源。     

芍甘胶囊质量控制标准的研究

目的制定芍甘胶囊的质量控制标准。方法采用TLC法在同一薄层板上同时鉴别芍甘胶囊中芍药苷、甘草酸铵;采用HPLC测定芍甘胶囊中芍药苷含量,色谱条件：C18色谱柱,流动相为乙腈-乙酸-三乙胺-水（15：0．3：0．3：85）,检测波长为230nm;采用HPLC测定芍甘胶囊中甘草酸铵含量,色谱条件：C18色谱柱,流动相为乙腈-0．017mol·L^-1磷酸水溶液-三乙胺（35：65：0．3）,检测波长为250nm。结果薄层鉴别试验中,芍药苷和甘草酸铵的色斑能完全分开且样品中其他成分对鉴别没有干扰。芍药苷和甘草酸铵分别在0．4-2μg和1．44-4．32μg范围内均呈良好的线性关系,芍药苷和甘草酸铵的平均回收率为97．53％和98．64％,RSD分别为1．05％和1．16％。3批样品的芍药苷含量分别是40．28、40．32、40．35mg/粒;甘草酸铵含量分别是20．27、20．06,20．72mg/粒。结论本文所制定芍甘胶囊的定性和定量方法简便,重复性好,结果可靠,可作为芍甘胶囊的质量控制标准。