基于MS2衣壳蛋白系统的活细胞内JunmRNA定位初探

目的检测细胞中JunmRNA在活细胞内的定位。方法设计引物，构建融合MS2茎环结构串联重复的Jun表达载体（pcDNA3．1-Jun-MS2-48X）。转染细胞后，绿色荧光蛋白（GFP）-MS2融合蛋白可与MS2茎环串联重复结构结合，通过荧光显微镜观察GFP的细胞定位，能够间接确定JunmRNA在细胞内的定位。结果成功构建了pcDNA3．1-Jun-MS2-48X表达载体，经荧光显微镜观察，能够看到明显的绿色荧光，并且在细胞内聚集。结论实现了在细胞内实时观察JunmRNA，为在单细胞水平上JunmRNA的定位提供了新的技术方法。     

非编码基因MEG3稳定表达细胞株建立及其对p53转录活性的影响

目的构建人类长链非编码RNA母系表达基因3（MEG3）的真核表达载体,筛选MEG3稳定高表达的肝癌细胞株,分析MEG3过表达对p53转录活性的影响。方法根据GenBank中MEG3的基因序列设计合成特异引物,从肝癌细胞中扩增MEG3的cDNA序列,将其构建入pcDNA3.0真核表达载体中,得到pcDNA3.0-MEG3表达载体,转染肝癌细胞SK-Hep-1,用G418筛选稳定株,采用RT-PCR技术检测转染细胞中MEG3基因表达,采用荧光素酶报告基因技术分析MEG3过表达细胞中对p53介导的基因转录活性的影响。结果成功构建了MEG3真核表达质粒pcDNA3.0-MEG3,筛选获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,双荧光报告实验结果显示MEG3过表达能增强p53介导的转录激活作用。结论本研究获得了稳定高表达MEG3基因的SK-Hep-1肝癌细胞株,为深入分析MEG3的功能及其作用机制奠定了基础。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

C反应蛋白真核表达载体的构建与表达

目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

融合His标签的HCV包膜糖蛋白E2的真核表达及意义

目的 构建HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合的真核表达载体并在CHO细胞中表达,为研究HCV包膜糖蛋白的功能奠定基础。方法 利用PCR技术从HCV基因组序列中扩增出编码HCV包膜糖蛋白E2的基因,将其插入原核表达载体pET28(a)载体中,构建pET28(a)-HCVE2,从pET28(a)-HCVE2上获得His-HCVE2融合基因,插入pcDNA3．1,构建表达HCV包膜糖蛋白E2与His标签融合蛋白的真核表达载体pcDNA3．1-His-E2。用脂质体介导法将pcDNA3．1-His-E2转染CHO细胞,通过间接免疫荧光、Western blot检测融合蛋白在CHO细胞内的表达。结果 转染HCVE2与His融合基因的真核表达载体的CHO细胞内声融合蛋白的表达。结论 与His标签融合的HCV包膜糖蛋白E2能够在CHO细胞内表达。     

嵌合分子CblN/Grb2构建及其原核表达

目的 构建CblN／Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN／Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN／Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性。方法 提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长CblcDNA的质粒pEFHACbl作为模板扩增Cbl基因№端（cblN）;用重叠延伸PCR方法,在CblN内部SH2两端引入BamHⅠ和EcoRⅤ酶切位点并克隆入pcDNA3．1（＋）。再以Grb2基因的SH2置换CblN的SH2即成为pcDNA3．1（＋）-CblN／Grb2;以其为模板,通过PCR方法扩增CblN／Grb2并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST-CblN／Grb2融合蛋白并用Glutathione Sephamse 4B进行纯化;通过体外泛素化实验检测GST-CblN／Grb2是否具有泛素连接酶活性。结果 成功构建了pGEX-4T-2-CblN／Grb2融合表达载体;在大肠杆菌DH5α中表达了GST-CblN／Grb2融合蛋白并获得了纯化蛋白;体外泛素化实验表明GST-CblN／Grb2具有泛素连接酶活性。结论 GST-CblN／Grb2的表达、纯化及其体外活性的鉴定为进一步研究该嵌合泛素连接酶对HER2阳性肿瘤细胞生长的影响奠定了基础。     

人LDLR基因的克隆及在Hepal-6细胞中的表达

目的：从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因，构建其真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞Hepal-6中进行表达。方法：从HepG2中提取总RNA，采取逆转录PCR(RT-PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中，进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3-hLDLR和空载体转入Hepal-6，G418筛选，并用RT-PCR和FAcs检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果：人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3-hLDLR，双酶切和测序表明，克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性，但编码的氨基酸序列完全一致，该序列的GenBank登录号为gil21629647｜gb｜IAYll4155．1，并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepal-6后，用RT-PCR和FACS检测表明，细胞可表达人LDLR。结论：成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-hLDLR，为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

HDAC1对ERα和ERβ蛋白水平的调控

目的：构建带编码HA标签的hdac1基因真核表达载体，研究组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）对雌激素受体α和β（ERα和ERβ）蛋白水平的影响。方法：用提取的RNA产物进行逆转录合成cDNA，利用PCR技术扩增出hdac1基因完整编码区序列，通过DNA重组技术构建含编码hdac1 DNA片段的真核表达载体pcDNA3-HA—hdac1；利用GST沉降（pull-down）实验观察HDAC1是否能特异结合ERα或ERβ；又将pcDNA3—HA—hdac1重组质粒分别和ERα表达载体或ERβ表达载体质粒共转染293T细胞，观察HDAC1对ERα和ERβ蛋白水平的影响。结果：转染pcDNA3—HA—hdac1重组质粒的哺乳动物细胞表达了与预期相对分子质量大小一致的HDAC1蛋白；GST沉降实验表明，HDAC1蛋白与ERα和ERβ均结合；共转染实验观察到HDAC1可使ERα蛋白水平降低，而对ERβ没有影响。结论：HDAC1与ERα和ERβ均结合，但其对ERs的作用具有亚型特异性，ERα和ERβ蛋白水平可能受不同类型的组蛋白去乙酰化酶（HDACs）的调控。     

小鼠固醇载体蛋白2原核表达载体的构建与表达纯化

目的 构建小鼠固醇载体蛋白2(SCP-2)融合蛋白表达载体,并在原核细胞内表达及纯化获得具有活性的融合蛋白,为进一步研究SCP-2的生物学功能提供基础.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR扩增得到鼠SCP-2编码序列,然后将该编码序列克隆到带有His标记的载体pET14b上,重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌BL21(DE3),用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性,然后切取分子量正确的条带用SDS-PAGE及质谱技术进行鉴定.结果 重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定证明载体构建正确.融合蛋白表达纯化后获得了分子量约59kD的融合蛋白,符合预期大小,并经质谱分析证明该融合蛋白的表达正确.结论 成功构建了带His标签的SCP-2原核表达载体,并成功表达及纯化出该融合蛋白,为深入研究SCP-2的相关生物学功能提供了一个重要的工具.     

应用微阵列技术筛选HBV前-S1蛋白的反式调节基因谱

目的 阐明前-S1蛋白的表达对乙型肝炎病毒(HBV)感染肝细胞基因表达谱的影响。方法 以含有HBV全基因组的质粒G376-7(GenBank号：AF384371)作为模板,应用PCR扩增前-S1蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS1,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果 在1152个基因表达谱的筛选中,发现有30个基因表达水平显著上调,38个基因表达水平显著下调。结论 前-S1基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。DNA芯片技术是分析反式调节靶基因的有效技术途径。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

人血管生成素-1基因的克隆及原核、真核表达载体的构建

血管生成素（angiopoietin）是近年来发现的与血管生成、抑制密切相关的分子。为研究其在肿瘤血管生成及转移中的作用，利用PCR技术从人胎盘组织中得到血管生成素-1基因，并亚克隆至pRSET C原核表达载体及pcDNA3.1-V5-HisC真核表达载体，成功地构建了原核及正反义真核表达载体，为下一步研究其对消化道肿瘤血管生成的影响打下了基础。     

凋亡相关斑点样蛋白ASC真核表达质粒的构建及表达

目的构建凋亡相关的斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）真核表达质粒。方法从人胚肾细胞系HEK293T细胞的总RNA中经过逆转录和PCR获得ASC的全长cDNA双链片段,经过酶切后连接到真核表达载体pcDNA3/flag中,挑选出转化生成的阳性克隆测序,将序列正确的重组质粒命名为pcDNA3/flag-ASC。脂质体转染pcDNA3/flag-ASC质粒到HEK293T细胞中,用Western印迹检测目的蛋白的表达。同时用免疫沉淀和免疫印迹方法检测ASC蛋白与前半胱天冬酶（pro-caspase）-1的相互作用,并用ELISA方法检测ASC蛋白对IL-1β分泌的影响。结果 Western印迹实验证明pcDNA3/flag-ASC可以在HEK293T细胞中表达ASC,并且可以与pro-caspase-1结合,使IL-1β分泌明显降低。结论构建了重组质粒pcDNA3/flag-ASC,在细胞中表达ASC后具有与pro-caspase-1结合的能力,并具有降低IL-1β分泌的生物活性。     

小鼠膜联蛋白A1真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠膜联蛋白A1(annexin-A1,ANXA1)真核表达载体,并检测其在NIH3T3细胞中的表达和定位.方法 采用PCR法从小鼠肝cDNA文库扩增ANXA1基因编码序列,并将其克隆至带有血凝素(HA)标记的真核表达载体pcDNA3-HA上,经PCR、酶切和测序鉴定后,将重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1瞬时转染NIH3T3细胞,采用细胞免疫荧光法检测目的 基因表达情况.结果 菌液PCR、双酶切和DNA测序结果均表明重组质粒pcDNA3-HA-ANXA1构建正确,并可在NIH3T3细胞的胞质、胞核和胞膜中广泛表达.结论 成功构建了pcDNA3-HA-ANXA1真核表达载体,该载体中的HA-ANXA1融合基因能在哺乳动物中有效表达并正确定位,为下一步深入研究ANXAl相关的信号通路奠定了基础.     

鼠NF～IL～6反义真核表达载体的构建和鉴定

目的构建包含鼠细胞转录因子白介素6(NF～IL6)反义基因的部分功能区的重组反义真核表达载体pcDNA3.0/NF～IL6,为进一步研究鼠巨噬细胞中NF～IL6的功能奠定基础。方法 Trizol试剂法提取体外分离培养的鼠巨噬细胞总RNA,经逆转录聚合酶链式反应(RT～PCR)扩增NF～IL6基因目的片段,PCR产物及真核表达载体pcD-NA3.0分别双酶切并进行连接,转化入大肠杆菌Ecoli Dh5α扩增后获得重组载体。结果 RT～PCR获得预期大小的特异性NF～IL6 DNA片段,经PCR、双酶切及测序分析证实已将鼠NF～IL6 cDNA片段正确的反向插入真核表达载体中。结论成功获得反义pcDNA3.0/NF～IL6重组质粒。     

天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达.方法 采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆.用Western blot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达.结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确.Western blot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达.结论 天然溶瘤型NDV Italien株的HN cDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达.     

ErbB4基因miRNA干扰质粒的构建和有效性鉴定

目的构建ErbB4基因特异性miRNA表达载体并检测其有效性。方法设计合成大鼠ErbB4基因特异性miRNA前体寡核苷酸,构建ErbB4基因特异性的重组miRNA干扰质粒。从大鼠脑分离提取总RNA,经RT-PCR构建靶序列质粒,并将其与miRNA干扰质粒共转染HEK293T细胞,经实时定量RT-PCR技术鉴定其干扰有效性。结果与结论针对ErbB4基因的miRNA干扰质粒构建成功,并能够有效抑制其靶基因的表达。该质粒为后续ErbB4基因特异性miRNA慢病毒表达载体的构建及ErbB4的相关功能研究奠定了基础。