甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,MR)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。     

Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用

目的：通过巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris）表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H（ endo-beta-N-acetyl-glucosaminidase H ,Endo-H）,并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌（ Strepto-myces plicatus） Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P．pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P．pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可＞95％。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳（ DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohy-drate electrophoresis,DSA-FACE）分析核糖核酸酶B（ribonuclease B,RNaseB）的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F（peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F）的糖基切割功能。结果利用P．pastoris表达制备Endo-H,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSA-FACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5 GlcNAc-Man9 GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5 GlcNAc2-Man9 GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P．pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。     

带荧光标签的产气荚膜梭菌ε毒素融合蛋白纯化及特性鉴定

目的 表达纯化带eGFP和mScarlet标签的产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）ε毒素（ETX）,鉴定ETX的毒素特性。方法 在大肠杆菌中表达带eGFP和mScarlet标签的ETX融合蛋白,镍柱纯化蛋白;用MTS法测定带不同标签ETX的毒性;用共聚焦显微镜观察mScarlet-ETX与HaCaT细胞、HEKa细胞和不同物种红细胞的结合情况。结果 成功表达带eGFP和mScarlet标签的ETX融合蛋白,纯化后得到纯度较高的eGFP-ETX和mScarlet-ETX融合蛋白。通过细胞毒实验,证实eGFP-ETX毒素与未加荧光标签的His-ETX相比毒性减弱,mScarlet-ETX毒素与His-ETX毒性基本一致,确定了eGFP-ETX和mScarlet-ETX的最佳荧光值。将mScarlet-ETX应用于HaCaT细胞和HEKa细胞,观察到mScarlet-ETX与HaCaT细胞、HEKa细胞结合,证实HaCaT细胞、HEKa细胞对ETX敏感。将mScarlet-ETX应用于人、小鼠和兔红细胞,mScarlet-ETX只与人红细胞结合。结论 mScarl...     

耐辐射奇球菌PprI蛋白质在毕赤酵母菌中的高效表达及纯化

目的 利用真核毕赤酵母高效表达原核的耐辐射奇球菌pprI基因,建立高效表达及纯化PprI蛋白质的技术路线。方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性,改造耐辐射奇球菌pprI基因的编码序列,利用PCR技术全合成改造过的pprI基因,并在其N末端添加一个6×His标签。PCR产物经纯化后克隆到毕赤酵母表达载体pHBM-905A中,利用Cop I和Not I双酶切并回收线性化的目的片段后,转化毕赤酵母GS115菌株。将获得的毕赤酵母转化子诱导表达,SDS-PAGE、Western blot和质谱检测培养上清液,用Ni-NTA柱纯化目的蛋白,BCA法测定蛋白浓度。结果 新合成的耐辐射奇球菌pprI基因编码序列正确,毕赤酵母转化菌株的培养上清液经SDS-PAGE和Western blot均可检测到相对分子质量为43000的目的蛋白条带,经质谱检测证实该目的蛋白为耐辐射奇球菌PprI蛋白。选用Ni-NTA柱获得了大量纯化的PprI蛋白,应用浓度为250 mmol/L的咪唑淋洗时,PprI蛋白洗脱率最高。BCA法测得纯化蛋白浓度为0.35 mg/ml。结论 建立了一种新的适于毕赤酵母表达的耐辐射奇球菌pprI基因,成功构建了分泌表达PprI蛋白质的重组毕赤酵母工程菌株,建立了高效表达目的蛋白的技术路线,并获得了高效表达和纯化的PprI蛋白。     

长链胰岛素样生长因子1在毕赤酵母中的表达、纯化及活性分析

目的:在毕赤酵母KM71中分泌表达长链-Arg3-胰岛素样生长因子1(LR3IGF-1),并探讨其体外生物活性.方法:人工合成LR3IGF-1基因,构建表达载体pCαA-LR3IGF-1,转化毕赤酵母KM71.筛选重组工程菌株,经诱导表达并从上清中纯化目的蛋白,鉴定其生物活性.结果:诱导上清中存在一8×103 左右的条带,经初步鉴定为目的蛋白条带.每升培养基经纯化后能得到40 mg目的蛋白.纯化后的目的蛋白具有明显的体外刺激NIH 3T3细胞增殖的作用.结论:建立了LR3IGF-1在毕赤酵母 KM71中表达及纯化方法,该方法能获得具有生物学活性的高纯度LR3IGF-1,为LR3IGF-1的后续研究及临床应用奠定了基础.     

小鼠烧伤早期巨噬细胞糖皮质激素受体及细胞因子蛋白表达的变化

目的　探讨小鼠烧伤后早期巨噬细胞糖皮质激素受体 (GR)、核转录因子 (NF kB)、肿瘤坏死因子 α(TNF α)和白介素 1β(IL 1β)蛋白表达的变化。 方法　将培养的巨噬细胞株ANA 1注入小鼠腹腔内 ,小鼠行 15 %TBSAⅢ度烧伤 ,收集腹腔巨噬细胞 ,应用免疫组化和Westernblot方法 ,观察烧伤后 2、6小时巨噬细胞GR、NF kB、TNF α和IL 1β蛋白表达的变化。 结果　烧伤后巨噬细胞免疫组化染色GR、NF kB阳性表达减弱 ,TNF α和IL 1β阳性反应增强。Westernblot分析表明烧伤后GR、NF kB蛋白含量降低。 结论　烧伤后巨噬细胞GR、NF kB蛋白减少 ,TNF α和IL 1β增加 ,说明巨噬细胞激活在烧伤后炎症反应中发挥重要作用     

人巨噬细胞刺激蛋白在哺乳动物细胞中的表达及对CFU—GM的刺激活性

人巨噬细胞刺激蛋白在哺乳动物细胞中的表达及对ＣＦＵ－ＧＭ的刺激活性①１００８５０北京军事医学科学院放射医学研究所宫锋胡志远陈家佩吴祖泽贺福初关键词巨噬细胞；干细胞中国图书资料分类号Ｑ３４３人巨噬细胞刺激蛋白（ＭＳＰ）是新近发现的一种分子量为７９．３６...     

重组人α-半乳糖苷酶A在巴氏毕赤酵母中的表达及鉴定

目的：克隆人α-半乳糖苷酶A（α-GalA）cDNA，并在毕赤酵母中表达重组的人α-GalA。方法：利用RT-PCR方法从人肝癌细胞中克隆人α-半乳糖苷酶AcDNA并构建到可用甲醇诱导的分泌型巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαA中。将重组质粒导入毕赤酵母并用Zeion抗生素筛选转化细胞。在甲醇诱导后。利用SDS-PAGE、Western印迹及酶活测定方法在酵母上清中鉴定重组的人α-GalA。结果：获得人α-GalA cDNA，构建酵母表达质粒pHGCZα-A，将重组表达载体导入到酵母细胞，并在上清中检测到人α-GalA蛋白。结论：获得了人α-GalA cDNA及具有生物活性的重组人α-GalA，为临床应用于法布莱氏病的治疗奠定了基础。     

人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白在糖基工程化毕赤酵母中的表达

目的在糖基工程化毕赤酵母中表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-免疫球蛋白G1 Fc融合蛋白（tumor necrosis factor receptor-immunoglobulin G1 Fc fusion,TNFR-Fc）,考察糖基工程化过程对其活性的影响。方法将编码TNFR-Fc的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPIC6αA中,构建重组表达质粒pPIC6-TF。用表达质粒转染N-糖基化工程改造的毕赤酵母菌株GSB,在含有杀稻瘟菌素的YPD平板上进行筛选。然后再使用HRP标记的羊抗人IgG在醋酸-硝酸纤维素双层膜上进行斑点印迹（dot-blot）筛选。选择表达量较高的工程菌株TNFR-Fc/GSB57进行高密度培养,通过Protein A亲和层析从发酵上清中纯化融合蛋白,利用鼠L929细胞对融合蛋白的抗TNFα活性进行分析。结果通过筛选获得了表达人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的表达菌株,纯化后的TNFR-Fc融合蛋白拮抗TNFα的EC50高于野生型毕赤酵母表达产物,而低于哺乳动物细胞的表达产物。结论糖基化改造改善了人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白的抗TNFα活性,但必须进行进一步的改造才可能获得与哺乳动物细胞表达产物相似的活性。     

人MD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达

构建人髓样分化蛋白－2（human myeloid differentiation proterin-2,hMD-2)与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferase,GST)的融合蛋白（hMD-2/GST)表达载体PGEX－4T－1／hMD-2，在大肠杆菌中融合表达hMD-2/GST。以真核表达载体PEF－BOS／hMD-2为模板，用PCR法在MD－2编码序列上下游引入酶切位点和终止密码子，将hMD-2编码序列克隆入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，用PCR和酶切筛选，鉴定重组质粒PGEX－4T－1/hMD-2，并对插入基因片断测序，重组质粒PGEX－4T－1／hMD-2转化大肠杆菌，经IPTG诱导后用SDS－PAGE分析表达产物。结果PCR，酶切鉴定和序列测实MD－2编码序列正向插入原核表达载体PGEX－4T－1的相应酶切位点，片断与PCR扩增产物大小相同，序列无误，阅读框架正确，SDS－PAGE证实hMD-2/GST在大肠杆菌中表达，表达量约占菌体总蛋白的30％，说明成功构建了PEGX－4T－1／hMD-2载体，hMD-2/GST融合蛋白在大肠杆菌中得到初步表达，为MD－2后续研究作了必要的准备。     

EBOV三聚体糖蛋白在新型糖基工程酵母中的表达与纯化

目的 用新型糖基工程酵母表达并纯化得到具有类似哺乳动物细胞糖基化修饰的埃博拉病毒三聚体糖蛋白(EBOV-GP),为其亚单位疫苗研究提供基础.方法 人工合成EBOV-GP基因,将编码全长EBOV-GP基因和编码缺失黏蛋白样域(MLD)与穿膜区的EBOV-GPΔMLDΔTM基因分别克隆到pPICZ-αA载体上,电转化糖基工程酵母,与在HEK-293T细胞中表达的EBOV-GP进行比较,利用PNGaseF和EndoH酶切分析其糖基化修饰,利用亲和层析与离子交换层析纯化目的蛋白,蛋白质N端测序分析其在蛋白翻译修饰过程中是否正确切除了信号肽,同时利用凝胶柱分析是否能形成三聚体结构.结果 PNGaseF酶切结果显示,用糖基工程酵母和HEK-293T细胞表达的EBOV-GP糖蛋白相对分子质量大小与N-糖基化程度均一致,EndoH酶切显示EBOV-GPΔMLDΔTM的N-糖基化修饰是非高甘露糖形式的复杂型糖基化修饰;经三步纯化得到的目的蛋白,N端测序显示为GP蛋白成熟肽序列,其自身信号肽被正确切除;凝胶柱分析显示纯化得到的目的蛋白以三聚体形式存在.结论 用糖基工程酵母表达制备了具有复杂型糖基化修饰的EBOV-GP.     

人ω干扰素在巴斯德毕赤酵母中的表达及纯化

目的 :在巴斯德毕赤酵母中表达及纯化人ω干扰素 (interferonω ,IFN_ω)以对其功能进行深入研究。方法 :用PCR方法扩增人IFN_ω基因 ,与分泌型酵母表达载体pMEX9K重组 ,经酶切、PCR和序列测定证实重组表达载体pMEX9Kω构建正确。将重组载体pMEX9Kω用SalⅠ酶切后 ,转化毕赤酵母GS115。得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中有人IFN_ω的表达 ,表达量为 4× 10 9U L。经过ButylSepharose 4FF疏水层析柱 ,SPSepharoseFF离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤三步层析纯化 ,利用反相HPLC分析纯化的重组蛋白。结果 :得到了纯度 >99%的重组IFN_ω。N端氨基酸序列测定表明重组人IFN_ω具有正确的N端氨基酸残基顺序 ,相对分子质量为 2 2 0 0 0 ,并具有同天然蛋白相似的比活性。结论 :在毕赤酵母中成功地表达并纯化得到了同天然蛋白具有相似的比活性的人IFN_ω。     

抑瘤素M在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

目的：构建抑瘤素M（oncostatinM,OSM)的酵母表达体系,方法：将人OSM cDNA连入pPIC9K酵母表达载体,转染毕赤酵母（Pichia pastoris),用MD和MM营养缺陷型培养基筛选具有正确表型的重组转化子,用RNA印迹法和蛋白质印迹法鉴定母转化菌株中OSMmRNA转录和OSM相对分子质量。MTT法鉴定OSM蛋白对人黑素瘤细胞生长的抑制活性。结果：构建的毕赤酵母体系可实现人OSM分泌表达,表达量占外分泌蛋白的70％以上,表达蛋白相对分子质量约30000,对黑素瘤细胞生长可产生明显抑制作用。结论：OSM的酵母分泌表达体系表达量可观,表达蛋白集中于培养液上清,便于纯化,是日后进行OSM大规模制备的可行途径。     

毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析

目的：通过毕赤酵母（Pichia pastoris）表达制备重组人凝血酶原2（prothrombin-2）,并利用锯鳞蝰（Echis carinatus）凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据GenBank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体pPICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3．1（＋）,瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺（pNA）,且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。     

利用基因敲除技术缺失毕赤酵母羧肽酶Y基因的初步研究

目的通过基因敲除技术缺失毕赤酵母编码的羧肽酶Y（carboxypeptidase Y,CPY）基因cpy,观察其对毕赤酵母生长和外源蛋白表达的影响。方法通过PCR方法扩增出内部含有潮霉素B抗性基因的cpy同源序列;通过电转法将同源序列转入GS115-EH感受态细胞中,并用潮霉素B筛选出阳性克隆。用平板显色法测定阳性克隆菌的羧肽酶活性,同时用PCR法鉴定阳性克隆菌的cpy基因是否缺失。对cpy基因缺失的GS115-EH△cpy菌,分别用YPD和BMGY-BMMY培养研究其生长特性;用BMMY培养基进行甲醇诱导表达外源蛋白,观察其蛋白表达的特性。结果 GS115-EH△cpy的羧肽酶基因cpy被成功敲除,羧肽酶活性丧失。YPD培养条件下,GS115-EH△cpy生长后期的D600明显低于GS115-EH,而用BMMY诱导培养基,GS115-EH△cpy的生长明显改善,但仍然低于对照菌。蛋白电泳结果显示甲醇诱导GS115-EH△cpy的蛋白表达量也低于对照菌。结论 GS115-EH△cpy的cpy基因被成功敲除,在YPD培养条件下,其生长低于对照菌,在BMMY培养条件下,其生长明显改善,但仍然较对照菌差,而且其外源蛋白的表达也低于对照菌。     

大鼠羧肽酶原B在毕赤酵母中的表达与培养条件优化

目的:利用毕赤酵母表达系统,表达大鼠羧肽酶原B(procarboxypeptidaseB,proCPB)蛋白,同时探讨最优表达条件,为规模化发酵生产羧肽酶B奠定基础。方法:以RTPCR法从SD大鼠胰腺细胞中克隆了proCPB基因,将其插入pPIC9载体,转入毕赤酵母Gs115细胞,在甲醇的诱导下表达目的蛋白。结果与结论:首次实现了proCPB在毕赤酵母中的成功表达;通过表达条件的优化,使用BMGY(pH6.0)培养基,添加0.5%(体积比体积)的酪蛋白水解物和3mmol/L的PMSF,于28℃,每隔12h补加0.5%(体积比体积)的甲醇,重组酵母Gs115proCPB表达的重组蛋白可达500mg/L,表达的目的蛋白占总蛋白的94%,活化后的重组CPB相对分子质量为35.1×103,与理论值(35.2×103)极相近。活性测定表明,重组proCPB活化后的CPB的比活力可达110U/mg(CPB参照品为180U/mg)。     

重组毕赤酵母菌高密度表达人源抗-HBs Fab抗体的研究

目的探讨抗-HBsFab抗体发酵工程菌GS115／Fab的高密度发酵及对发酵产物的纯化与活性鉴定方法。方法采用补料分批培养方法,在5L发酵罐中对发酵工程菌GS115／Fab进行高密度发酵,发酵温度28～30℃,pH值范围为5．0～5．5,溶氧范围20％以上;3次发酵分别于OD600值达到400～450、200～250、300～350时开始诱导,甲醇诱导浓度为0．5％～1％,经96h左右的诱导后终止发酵,对发酵上清进行亲和纯化,并通过ELISA法对纯化产物进行活性鉴定。结果在OD600为300～350时开始诱导有利于发酵过程条件的控制和目的蛋白的表达,目的蛋白表达量为245mg／L。发酵上清通过亲和层析纯化,获得纯度为98％的重组Fab抗体,该抗体经ELISA分析具有较高的HBsAg抗原亲和力及特异性。结论Fab酵母菌工程菌在5L发酵罐高密度发酵成功,为抗-HBsFab抗体的产业化生产及临床研究奠定了基础。