川楝素水解与氢化还原产物的结构鉴定及其对肉毒毒素解毒作用研究

目的鉴定川楝素水解及氢化还原产物的结构,并测定其对肉毒毒素的解毒效果。方法用一定比例的稀氨水水解川楝素,用氢化铝锂还原川楝素的环氧键,然后用高效液相色谱纯化各产物,用质谱、核磁共振氢谱鉴定产物结构;解毒活性测定中,小鼠用2LD50的A型肉毒毒素攻毒,腹腔注射不同剂量的川楝素水解及氢化产物后,4 d内观察小鼠死亡情况。结果与结论除全脱乙酰基产物外,获得2个川楝素单脱乙酰基产物及全脱乙酰基并环氧键还原的新产物,这些产物的毒性及对肉毒毒素的解毒活性降低。该工作为川楝素的体内药代产物鉴定及应用奠定了一定的基础。     

异川楝素和苦楝素-4对A、B和E三型肉毒毒素中毒小鼠的疗效

自发现川楝皮的驱蛔有效成分川楝素对肉毒毒素中毒动物有疗效后,我们又从苦楝皮分离出异川楝素和苦楝素-4两种新的呋喃三萜化合物,对A、B和E三型肉毒中毒小鼠均有疗效,特别是对E型毒素中毒小鼠疗效优于川楝素.文中分析了川楝素结构上的C_(14)桥氧变成异川楝素C_(15)的五元环酮后,抗肉毒的有效剂量提高了,对小鼠的毒性比川楝素小得多.     

川楝素对B,E型肉毒中毒小鼠和猴的疗效

川楝素(toosendanin)对A型肉毒中毒动物显示较好的治疗作用,为观察川楝素的抗毒效应是否具有型别特异性,我们又用B,E型肉毒中毒动物进行了实验研究。所用动物均由本院动物场供应。小鼠,上海杂交种,体重18～22g,雌雄兼用;恒河猴,体重3～6kg,雌雄适当搭配。川楝素以60%丙二醇蒸馏水制成注射剂,5mg/ml,由本所化学室供应。B型(批号752)、E型(批号719)肉毒毒素由兰州生物制品所提供,以0.2%明胶缓冲液(pH6.5)稀释成所需浓度。     

SNAP-25基因克隆及其在大肠杆菌中的表达与鉴定

目的：构建SNAP-25基因的原核表达载体pET22b—SNAP-25,对表达产物活性进行初步鉴定。方法：根据GenBank中已报道的SNAP-25基因序列,设计特异引物,通过RT—PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到基因。将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中,重组质粒转化大肠杆菌E.coli如BL21感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni—NTA亲和层析进行纯化。通过SDS-PAGE和免疫印迹对其进行鉴定,并对该蛋白进行活性的初步分析。结果与结论：成功构建了原核表达载体pET22b—SNAP-25,Western印迹证实重组蛋白获得表达。表达的重组蛋白与A型肉毒毒素混合反应,经SDS—PAGE验证,重组蛋白具有被毒素特异性切割的活性。     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

人工改造的A型肉毒毒素重链Hc段基因在大肠杆菌中的可溶性表达研究

目的 人工合成A型肉毒毒素Hc段基因,并在大肠杆菌中进行高效表达.方法 人工合成Hc段基因,选择宿主细胞偏爱的同义密码子替换其原有稀有密码子,使AT含量降至57.3%,然后将其克隆入pQE-60表达载体,在大肠杆菌中进行可溶性表达.结果 可溶性表达产物占细菌可溶性蛋白的11.5%左右,表达产物可被A型肉毒毒素马血清抗毒素识别.结论 成功地表达并鉴定了A型肉毒毒素Hc蛋白,为进一步进行A型肉毒毒素的疫苗或抗体研究奠定了基础.     

分泌抗B型肉毒毒素单克隆抗体的产生与特性鉴定

以B型肉毒类毒素免疫BALB/C小鼠,取脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞进行细胞融合。用ELISA方法筛选有杂交细胞生长孔的上清液,其中有66.7％的孔可分泌肉毒毒素特异性抗体。用有限稀释法进行克隆化培养后,获得4株稳定的杂交瘤细胞系(3B10、3B11、3G12和4A5),在体外培养中均持续分泌抗体,培养液抗体效价达10~(-3)～10~(-5);注入BALB/C小鼠腹腔制备出富含抗体的腹水,抗体效价达10~(-6)～10~(-8)。经用A型和B型类毒素作特异性鉴定,表明抗体3G12及4A5与A型无交叉反应,为B型特异性的。抗体3B10及3B11与A型有弱交叉反应。Ig种类鉴定表明抗体3B10及3G12为IgG_1;抗体3B11及4A5为IgG_2。染色体检查证明4株细胞均为杂交瘤细胞。小白鼠体内进行中和保护力测定表明4种单克隆抗体对肉毒毒素均无保护作用。     

A型肉毒毒素轻链抑制剂苯并硒唑衍生物的合成及活性评价

目的 合成一系列含芳香基、直链取代基苯并硒唑,抑制A型肉毒毒素(BoNT/A)轻链活性,获得A型肉毒毒素(BoNT/A)的解毒剂.方法 以邻氨基苯甲酸甲酯为起始原料,经重氮化、酰氯化合成中间产物2?硒化苯甲酰氯,再与含不同取代基的芳香胺、直链胺反应合成一系列依布硒啉(ebselen)类及其他苯并硒唑衍生物.采用荧光共振能量转移法(FRET)测定各苯并硒唑衍生物对BoNT/A轻链的抑制活性,测定它们与谷胱甘肽(GSH)的反应性,以考察其与体内其他蛋白或含巯基分子的反应性,最后测定各抑制剂的体内解毒活性.结果 4?甲酸基、4?乙酸基取代依布硒啉的抑制轻链活性(IC50分别为0.81、0.42μmol/L)高于依布硒啉(IC50=1.31μmol/L)1～2倍;含丙酸基、甲基、乙基、氟、氯、溴、胺基、甲氧基、3,5?二甲氧基依布硒啉硒唑衍生物以及喹啉基、直链丁酸基及己酸基苯并硒唑活性降低(IC50为4.16～7.18μmol/L);而依布硒啉邻羧基衍生物、苯并咪唑硒唑的抑制剂活性显著下降(IC50>10μmol/L).GSH与含苯并咪唑硒唑、依布硒啉邻羧基衍生物反应较慢,其余均较快.2LD50的BoNT/A给毒1 h后,单次或多次给予20 mg/kg依布硒啉或其他苯并硒唑衍生物,苯并咪唑硒唑组可显著提高小鼠在72 h内的生存率.结论 在依布硒啉右侧苯环上连接甲酸基和乙酸基后能提升其对BoNT/A轻链抑制活性,并增加了水溶性,但不能提高体内活性,苯并咪唑硒唑可显著提高小鼠在72 h内的生存率.     

A型肉毒毒素在瘢痕治疗中的研究进展

A型肉毒毒素是由肉毒杆菌分泌的高分子蛋白神经毒素,可通过抑制乙酰胆碱释放而松弛肌肉,常被用于解除肌肉痉挛、除皱美容等神经疾病治疗及皮肤美容领域。近年来研究证实,A型肉毒毒素能够通过抑制瘢痕组织内成纤维细胞增殖、促进瘢痕组织内胶原纤维降解、降低转化生长因子β活性及创面周围组织张力达到促进瘢痕消退、减轻瘢痕瘙痒及疼痛、预防瘢痕复发等目的,被广泛应用于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗。鉴于此,本研究对A型肉毒毒素治疗瘢痕的研究进展进行了综述,以期为A型肉毒毒素的临床治疗提供帮助。     

鸡血藤活性化合物儿茶素结构修饰及抗辐射作用研究

目的 对儿茶素进行结构修饰,制备系列衍生物,观察其抗辐射效果.方法 通过乙酸酐,丙酸酐,苯甲酰氯在碱性溶剂下与儿茶素反应,合成产物再利用硅胶层析进行分离纯化,得到纯化合物后进行结构鉴定;60Coγ射线(剂量为6Gy)照射小鼠造成辐射模型,照后给予3,5,7,3',4'-O-五乙酰基儿茶素和儿茶素灌胃;并于照前、后1、3、7、10、14、21 d取鼠尾静脉血,测外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、血小板数值(PLT).结果 合成并鉴定得到3种化合物,分别为3,5,7,3',4'-O-五乙酰基儿茶素;5,7,3',4'-O-四苯甲酰基儿茶素;3,5,7,3',4'-O-五丙酰基儿茶素;全乙酰化儿茶素对于辐射小鼠WBC,HGB,RBC,PLT的升高均有一定作用,但作用强度均不及儿茶素.结论 经过结构改造后的3,5,7,3',4'-O-五乙酰基儿茶素有一定的抗辐射作用,但作用效果较儿茶素弱.     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

游离血红蛋白浓度的定量检测方法及其在失血性休克复苏中的应用

目的研究全血和血液制品中游离血红蛋白（free hemoglobin,FHb）浓度的定量检测方法及其在大鼠失血性休克模型输血复苏时红细胞溶血的评价。方法通过检测血浆本底比色反应后的吸收光谱和制备系列浓度FHb标准液与光密度值的标准曲线,进行FHb检测的方法学验证;建立Wistar大鼠的失血性休克模型,随机分为5组,失血40%后,A组仅输血液,B、C、D、E组根据动物体质量分别输注含不同浓度FHb（10,20,30,40 mg/kg）的血液;在基线水平和复苏后1 h抽取动物股动脉血液,测定对照组和实验组动物血液的FHb浓度值,并进行血气分析。结果 FHb检测装置及方法的浓度范围为0～2 g/L,日内和日间精密度分别小于3.6%和6%。将该方法应用于复苏前后血液中FHb浓度的定量检测,结果显示,各组动物FHb的检测结果在复苏前后均有统计学意义（P〈0.01）,含不同浓度FHb的血液与液体进入体内后1 h,pH水平得到了纠正,并发现复苏前后FHb测定结果与pH的变化呈线性相关（R2=0.905,P〈0.01）。结论建立一种FHb定量检测的方法,可用于院前输血治疗时全血或血液制品质量安全的快速评估。     

Comparison of immunostrips with mouse bioassay and bacterial culture in detecting botulinum toxins in bottles from suspected Taiwan high-speed rail bomber

In April 2013, a bomb-threat incident occurred on the Taiwan high-speed railway. Two suspects claimed to have placed explosive devices on a high-speed train and outside a lawmaker’s office. Afterward, the Criminal Investigation Bureau also found several bottles in the main suspect’s apartment labeled “botulinum toxin.” The Institute of Preventive Medicine was entrusted by the Institute of Forensic Medicine, Ministry of Justice, to verify whether the bottles contained botulinum neurotoxin (BoNT). Three different analyses, including rapid detection strips, toxin neutralization tests, and bacterial culture, were processed. The results provided conclusive evidence that botulinum neurotoxin type A (BoNT/A) was present in the samples. This study demonstrated that the BoNT/A strip assay is an excellent method for BoNT/A detection, and has potential use as an early warning tool in screening of food products for botulinum toxins.     

CXCR4 HIV-1抑制剂的设计合成及活性研究

目的设计、合成一系列新型四氢喹啉-苄基或苯并咪唑多胺类化合物,作为潜在的靶向CXCR4辅助受体的新型抑制剂,并测定其抗HIV-1活性。方法组合HIV-1辅助受体CXCR4抑制剂三氮构效团与CCR5部分药效团,设计并合成一系列新化合物并经1H-NMR、MS表征,用HIV-1ⅢB病毒测定化合物抑制活性。结果与结论设计合成的10个目标化合物未见文献报道。活性测试结果显示,四氢喹啉-苯并咪唑多胺类化合物具有较好的抗HIV活性（IC50〈1μmol/L）,四氢喹啉-苄基多胺类化合物活性较差（IC50〉8μmol/L）。     

低剂量γ射线辐照对血清抗氧化系统的兴奋效应

目的：探讨低剂量γ射线辐照人全血对血清抗氧化酶活性的影响。方法：20份人全血,以剂量为1Gy的γ射线进行辐照,吸收剂量率为17Gy/min,分别于照射前及照射后1、2h取样检测血清中总抗氧化能力（T—AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—Px）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）活力及还原性谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量。结果：离体全血在剂量为1Gy γ射线照射后1h,可见血清中GSH含量升高,MDA含量降低及T—AOC、SOD、GR、GSH—Px、CAT活性升高,且均与照射前比较有显著差异（P〈0．01）。经γ射线照射2h后,除SOD活性与照射后1h差异无显著性外,MDA含量进一步降低,GSH含量及T—AOC、GR、GSH—Px及CAT活性进一步升高,与照射后1h比较有显著差异（P〈0．01）。结论：低剂量γ射线辐照能明显提高血清抗氧化能力,即可诱导抗氧化系统的兴奋效应。     

湿热环境暴露对氰化钠毒性和组织氧化应激反应的影响

目的探讨湿热环境下氰化物毒性作用变化规律及其对组织氧化应激反应的影响。方法以小动物湿热环境试验箱模拟高温高湿环境,测定不同温、湿度[温度（Ta）（20±0.5）℃、相对湿度（50±5）%,温度36℃及38℃、相对湿度（RH）（60±3）%]条件下氰化钠经腹腔注射KM小鼠的LD50。另将30只SD大鼠随机分为常温对照、常温中毒、湿热对照、湿热中毒及药物预防组,各组受试动物分别按以下因素单一或联合处理：（1）湿热应激：模拟箱内[温度（38±0.5）℃,相对湿度（60±3）%]60 min;（2）氰中毒：动物腹腔注射氰化钠3.6 mg/kg;（3）药物预防：给予谷胱甘肽、维生素C灌胃5 d。各组受试动物于热应激后60 min和（或）中毒30 min后测定脑、肝组织匀浆超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。结果与20℃,RH50%时KM小鼠氰化钠中毒LD50（4.77 mg/kg）相比,（36±0.5）℃或（38±0.5）℃,RH 60%湿热环境中毒动物的LD50分别下降至4.66 mg/kg（P〉0.05）及4.17 mg/kg（P〈0.05）。20℃RH 50%条件下NaCN中毒后肝、脑组织SOD活力下降（P〈0.01）,MDA含量增加（P〈0.01）,而38℃RH 60%环境下NaCN中毒所致氧化应激改变更明显（P〈0.01）。药物预防可缓解相同条件下上述指标的改变（P〈0.01）。结论暴露于湿热环境下,小鼠氰化纳中毒的LD50可随环境温度的升高而降低。湿热环境和（或）氰化钠中毒两因素均可导致氧化应激指标的明显改变,二者同时作用可能具有联合效应。服用抗氧化药物可提高组织抗氧化应激能力。     

分化型甲状腺癌患者^131I治疗后体内残留放射性活度的评估

目的 评估分化型甲状腺癌（DTC）患者^131I治疗后体内残留放射性活度.方法 本研究共纳入了35例DTC患者,分为“清甲”（20例）与“清灶”（15例）组,分别于服^13I后2、6、24、48、72 h进行^131I全身显像及1m处当量剂量率的测定,以2h时显像计数和活度作为总计数和总活度.根据各时间点显像计数与2h的显像计数比值间接估算体内残留放射性活度,并估算患者体内残留放射性活度达到400 MBq时的1m处当量剂量率.统计学分析采用直线相关与回归分析.结果 “清甲”组服^131I后2、6、24、48、72 h体内残留^131I活度占服^131I总活度的百分比分别为99％±4％、86％±6％、35％±10％、12％±8％、7％±8％, “清灶”组分别为99％±1％、91％±7％、47％±17％、11％±9％、4％±6％. “清甲”组服^131I后2、6、24、48、72 h的1m处当量剂量率分别为（157±37）、（120±36）、（35±13）、（11±9）、（9±11）μSv/h,“清灶”组分别为（234±43）、（186±51）、（49±20）、（12±11）、（4±6）μSv/h.体内残留的放射性活度与1m处当量剂量率呈正相关（r=0.87,P＜0.001）.“清甲”与“清灶”组服^131I后48、72 h体内残留放射性活度分别为（432±292）、（265±281） MBq及（731±701）、（277±470） MBq,对应的1m处当量剂量率为8～ 11 μSv/h.结论 DTC患者服^131I后48～72 h体内残留放射性活度达到国家标准规定的400 MBq时,即DTC患者1m处当量剂量率达到8～11 μSv/h时方可出院.     

交错融合脂质体的制备

目的研究交错融合脂质体（IFVs）的制备。方法采用改良方法制备交错融合脂质体（IFVs）,应用激光散射粒度分析仪（PCS）对其粒径大小及分布情况进行测定,利用高压液相色谱仪测定其包封率。结果 IFVs脂质体粒径为100 nm左右。包封率为（69.0±5.4）%,远高于其他类型脂质体,并且性质稳定。结论 IFVs是一种大单层脂质体,其特点是粒径均匀（100 nm）,包封容积大,可达20~25μl/μmol脂质,可以携带足够量药物。