可视化基因芯片技术检测肠道病毒方法的建立

目的建立一种能同时检测10种肠道病毒的可视化基因芯片法。方法根据公开发表的10种常见肠道病毒的序列,设计病毒引物和探针,制备肠道病毒检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的病毒靶片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、可视化显色后进行结果分析。在优化的RT-PCR体系、杂交反应和可视化检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度和重复性。结果本研究共筛选出2对通用引物、3对特异性引物和1条肠道病毒属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片具有较好的特异性和重复性,可检测出不低于102拷贝/μl的体外转录RNA。30例临床标本的芯片检测结果与荧光PCR法一致。结论本研究所建立的方法具有高通量、高特异性、高灵敏度等特点,因此在临床上具有潜在的应用前景,可以为肠道病毒诊断提供实验室依据。     

7种立克次体甄别检测基因芯片方法的建立

目的：建立一种能同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片法。方法根据NCBI公开发表的7种立克次体的序列设计引物和探针,制备立克次体甄别检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增立克次体靶基因片段,标记的产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏度、重复性。用实时荧光PCR法与芯片法分别检测莫氏立克次体梯度稀释的核酸,比较两种方法的灵敏度。制备双盲模拟样本,进一步评价芯片方法的准确性。结果该研究共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条立克次体属通用探针、9条特异性检测探针。该芯片检测质粒DNA的灵敏度为1．5×102～3×103拷贝／反应,检测模拟样本的灵敏度为103～104拷贝／μl。实时荧光PCR法与芯片法检测结果一致,实时荧光PCR法比芯片法灵敏度高10倍。双盲模拟样本检测符合率为100％。结论成功建立了可同时检测7种立克次体的化学发光基因芯片检测方法,为立克次体病的临床诊断和流行病学调查提供了一种新的高通量检测手段。     

肠道病毒71型血清学检测方法的建立及应用

目的 在原核表达系统中对肠道病毒71型(EV71)基因进行克隆、表达、纯化,建立血清IgM抗体的检测方法,用于EV71感染的早期诊断.方法 检索EV71 VP1基因序列,设计合成引物,并在引物两端插入酶切位点,采用RT-PCR分离EV71 VP1全基因序列.PCR产物回收、纯化,插入T载体进行序列同源性测定.再插入表达质粒载体pRSET,构建pRSFT-EV71重组质粒.利用纯化后的表达产物,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测EV71 IgM抗体.共收集31例临床诊断为手足口病患儿及36例健康儿童的血清标本进行检测.结果 PCR产物片段大小约890bp,与预期VP1全基因序列长度一致,并且克隆入T载体后序列测定与GenBank公布序列的同源性达100%;重组蛋白大小约为890bp,与预期蛋白片段一致.ELISA检测结果显示,在手足口病患儿中IgM抗体阳性7例,健康儿童中则未发现阳性,差异有统计学意义.结论 成功建立了针对EV71 IgM抗体的检测方法.     

耐万古霉素肠球菌检测基因芯片方法的建立和验证

目的：基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据GenBank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列（ ddl）及万古霉素耐药基因（ vanA,vanB）序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌（VRE）检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103 CFU／ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致（8／10）。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。     

腹泻病毒化学发光基因芯片检测方法的建立和验证

目的 建立一种化学发光基因芯片检测方法,实现7种腹泻病毒,A组轮状病毒、B组轮状病毒、Ⅰ型诺如病毒、Ⅱ型诺如病毒、札如病毒、星状病毒和肠道腺病毒的快速、准确检测.方法 选择7种病毒特异性基因的保守区,设计引物与探针,制备寡核苷酸基因芯片.将多重实时荧光PCR(RT-PCR)扩增产物与带有特异性探针的芯片杂交,经洗涤、化学发光检测后进行结果分析.在优化的RT-PCR体系、杂交条件和化学发光检测条件下,评价芯片的灵敏度、重复性和特异性.结果 研制的基因芯片具有良好的特异性和灵敏度,检测体外转录RNA参考品的最低检测限为3×103拷贝/反应,检测临床样本的灵敏度为95.2％、特异性为92.1％、符合率为95.1％.结论 建立了一种基于化学发光基因芯片的腹泻病毒检测方法,此法能快速、灵敏、特异地检测和鉴别7种腹泻病毒,具有较好的应用前景.     

多重生物检测技术研究进展

多重生物检测因其快速、耗费少、所需样品量少等优点,被广泛用于细菌、病毒、真菌、寄生虫及自身免疫相关抗体等抗原或抗体的快速筛查诊断。多重核酸检测的新技术包括巢式PCR(nPCR)、多重串联PCR、基于毛细管电泳的GeXP平台和luminex xMAP多重分析技术平台,多重免疫检测的新技术包括基于上转换发光、多线点、表面等离子共振技术的多重生物检测及基于蛋白芯片的阵列array-ELISA检测。本文综述了近年来多重生物检测新技术在呼吸道感染、腹泻、自身免疫性缺陷和肿瘤等疾病中的应用进展。     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157:H7和霍乱弧菌O139

目的：建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性.方法：选择EHEC O157：H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因（uidA）;霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位（ctxA）、毒力协调菌毛A亚单位（tcpA）、糖基转移酶（glycosotransferase LPSgt）基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰.在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针.随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本.结果：PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏.结论：所研制的同时定性检测EHEC O157：H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法.     

基因芯片技术鉴定出血性大肠杆菌O157∶H7和霍乱弧菌O139

目的:建立一种同时快速检测肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片,并验证该芯片的特异性和敏感性。方法:选择EHEC O157∶H7的产志贺样毒素基因stx1、stx2和β-葡糖醛酸糖苷酶基因(u idA);霍乱弧菌O139的肠毒素A亚单位(ctxA)、毒力协调菌毛A亚单位(tcpA)、糖基转移酶(glycosotransferaseLPSgt)基因序列分别设计引物和探针,反向引物用荧光素Cy3标记,探针在3′端氨基修饰。在优化的PCR和杂交反应条件下,分别进行三重PCR扩增,产物混合后与芯片进行杂交,产生特异性荧光信号,进一步筛选探针。随后将筛选出的探针制备芯片用于检测临床样本。结果:PCR产物在相应探针处均产生特异性杂交信号,临床样本检测结果表明,此芯片比常规细菌学检测方法灵敏。结论:所研制的同时定性检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌O139的基因芯片是特异、灵敏而且快速的,为这两种肠道致病菌感染的快速诊断提供了新的方法。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值<15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

基于随机聚合酶链反应的病原菌基因芯片检测技术

目的建立一种基于随机聚合酶链反应的病原细菌基因芯片筛查检测技术。方法用生物学软件分析7种病原菌特异性基因序列的保守性区域,利用Oligo 6.0软件设计针对靶细菌的一系列探针,制备检测用基因芯片。细菌基因组DNA在随机引物扩增中掺入氨基丙烯-dUTP,产物偶联荧光染料后与芯片上探针杂交,通过芯片扫描仪和图像分析软件对结果进行判断。选取19种病原菌基因组DNA进行芯片特异性验证和灵敏度评价,使用问号钩端螺旋体对应靶探针进行基因芯片检测方法重复性验证,并制备问号钩端螺旋体模拟水污染样本进行芯片检测。结果在均一的杂交条件下4种靶细菌均能得到相应特异性杂交图谱,其他非目的细菌均为阴性结果,3种靶细菌基因组DNA最低检测浓度为14.43～363.4 pg/μl,芯片重复性变异系数CV值〈15%,最低可检测含问号钩端螺旋体7×105条/ml模拟水污染样本。结论初步建立的随机聚合酶链反应结合芯片技术的检测方法可用于多种病原菌筛查检测,为细菌高通量筛查与鉴定技术提供了新的思路和实验依据。     

志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌多重PCR快速检测体系的建立

目的 建立快速检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR方法.方法 根据志贺菌ipaH基因、沙门菌ipaB基因及霍乱弧菌EPSM基因设计特异性PCR引物,加热煮沸法制备DNA模板,进行PCR扩增及琼脂糖电泳检测.结果 应用所建立的多重PCR方法能分别或同时快速、特异地检测出志贺菌606bp、沙门菌314bp和霍乱弧菌482bp的目的基因.结论 初步建立了灵敏、特异的一步法检测志贺菌、沙门菌和霍乱弧菌的多重PCR体系,可用于高危腹泻致病菌的早期快速诊断.     

Sequential multiplex amplification (SMA) of genetic loci: A method for recovering template DNA for subsequent analyses of additional loci

A method called Sequential Multiplex Amplification (SMA) has been developed whereby a limited amount of DNA extracted from a sample can be reutilized for several single polymerase chain reaction (PCR) amplifications. The method involves recovery of genomic template DNA by microfiltration of PCR-amplified samples. Up to 5 different loci have been typed, each in a single system PCR-based assay, beginning with a test quantity of 5 ng template DNA. Genotypes of the DNA donors were compared with those obtained from individual amplifications and shown to be identical. This could be a useful technique for typing a number of loci from a limited amount of DNa and to recover template DNA from samples previously subjected to PCR. Obviously, when small quantities of template DNA are available, this technique can prove quite useful.     

Sex determination of forensic samples: co-amplification and simultaneous detection of a Y-specific and an X-specific DNA sequence

Summary The detection of restriction fragment length polymorphisms (RFLP) (1) in DNA extracted from forensic samples remains impossible in a significant number of cases due to deterioration and contamination of the biological material and the extremely low quantities of DNA isolated. The polymerase chain reaction (PCR) is a recent and particularly convenient method for analysing and typing very small amounts (10–20ng) of degraded human DNA (2, 3). DNA analysis at the level of a few cells present in forensic samples such as bloodstains, semen stains, vaginal swabs and head hair bulbs now appears possible using DNA amplification. A PCR protocol [4, 5] was adapted to simultaneously amplifiy a Y-specific DNA repeat sequence from the DYZ1 locus [6] and an X-specific DNA repeat sequence from the DXS424 locus [7]. The co-amplified Y-specific DNA fragment (102 bp) and X-specific DNA fragments (181–199 bp) were visualized on an ethidium bromide-stained 4% agarose gel. The male or female type of the amplified DNA extracted from blood samples, bloodstains, semen stains, vaginal swabs, brain tissue and 1, 2, 5, or 10 head hair bulbs was determined.     

5种虫媒病毒悬浮芯片检测方法的建立

目的建立同时检测1~4型登革病毒、乙型脑炎病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒和黄热病病毒等5种虫媒病毒的悬浮芯片检测方法。方法根据GenBank发表的上述病毒的序列,通过生物信息学分析和参考相关文献,在黄病毒属高度保守的NS5区设计属通用引物和种特异检测探针。将探针共价交联到不同的Luminex色标微球上,利用属通用引物进行RT-PCR扩增,与混合微球杂交,最后利用Luminex200仪器分析荧光强度值。结果将平均荧光强度的判定阈值定为背景对照的两倍可以对这5种共8型病毒进行有效鉴定。通过多批次的实验,均能准确鉴定出上述5种病毒,没有出现交叉反应,且批次间的平均荧光值偏离不大,变异系数(CV)均小于8%,表明本方法的特异性和稳定性均较好。在空斑滴定病毒的基础上,对本方法的检测敏感性进行了验证,结果表明对乙脑和黄热病病毒的检测敏感性可达到1.4个PFU,对西尼罗病毒可达14个PFU。进而将本方法用于检测55份临床标本和传代标本,其检测结果和种特异RT-PCR方法相比,具有很高的一致性,而且其在混合样本的快速检测中具有显著的优势。结论通过设计合适的引物和探针,成功建立了可同时检测和分型5种虫媒病毒的悬浮芯片方法,为疾病的诊断和预防以及流行病学调查提供了新的手段。     

人类致病病毒属水平基因筛查芯片的制备及其在黄病毒属检测中的初步应用

目的：制备人类致病病毒属水平高通量筛查用基因芯片，并通过检测黄病毒属病毒初步验证其筛查效果。方法：利用Clustal W和BLAST软件设计针对人类致病病毒的属特异性寡核苷酸探针，对探针浓度、杂交温度、杂交时间、不同杂交液及杂交后芯片的洗涤方法进行优化。分别用特异或随机PCR方法从病毒感染的细胞培养上清中扩增病毒核酸，在扩增过程中掺入aa-dUTP并进一步偶联cy5或cy3荧光素进行标记，随后与基因芯片进行杂交，并通过荧光扫描仪对杂交结果进行分析，然后分析检测的特异性和敏感性验证基因芯片的筛查效果。结果：共设计了针对人类医学病毒的1090条寡核苷酸探针及其他阳性、阴性对照探针，其中黄病毒属共46条探针，Tm值为77，67～83．53℃，通过随机或特异PCR扩增8株黄病毒属病毒核酸，在42℃、过夜杂交的条件下，通过基因芯片方法均获得了黄病毒属特异性杂交信号，与其他属病毒之间没有非特异性交叉反应。结论：所制备的基因芯片可用于黄病毒属病毒的快速筛查，本研究为进一步建立大规模病毒性病原体的高通量筛查与鉴定技术平台提供了实验依据。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

基因芯片技术在航空航天医学研究中的应用前景

基因芯片技术是20世纪90年代初期建立的一种高通量、大规模分析技术,已广泛应用于疾病诊断、新药研发、食品安全检测、环境科学和军事医学等领域。本文就基因芯片技术在航空航天医学研究中的应用及前景进行综述。