深圳地区人乳头瘤病毒18型E6E7基因的克隆、序列分析及E6/E7融合基因的构建

目的克隆人乳头瘤病毒18型E6E7基因序列,构建E6/E7融合基因,为HPV治疗性疫苗的研制打下基础。方法采用PCR技术扩增1例HPV18阳性患者组织中HPV18 E6E7基因。将PCR产物回收,插入pSC-A质粒载体构建pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒并进行核酸限制性内切酶鉴定及DNA测序分析;通过点突变方法使HPV18 E6、E7基因的开放读码框(ORF)融合以简化后续的基因表达问题。结果成功构建了pSC-A/HPV18 E6E7重组质粒,测序分析表明克隆的HPV18 E6E7基因与GenBank收录的德国株(AY262282)完全一致,点突变成功使E6基因的终止密码子突变,使HPV18 E6、E7基因融合。结论本研究获得了正确的HPV18 E6E7基因,为其重组表达及其相关研究奠定了良好基础。     

中国山东地区妇女宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16E6E7基因 …

目的 分析中国山东地区宫颈癌患者ＨＰＶ１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点。方法 从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标准中感染ＨＰＶ型别,选感染ＨＰＶ１６型的标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因,将其重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。结果 构建了含中国山东地区宫颈癌患者组织中ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７的重组质粒,命名为ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７－ＳＤ。     

人乳头瘤病毒16型湖北株E7基因的克隆、表达及其抗原性研究

目的：克隆、表达ＨＰＶ１６湖北株Ｅ７基因并探讨Ｅ７蛋白的免疫学性质。方法：应用基因克隆技术克隆、表达ＨＰＶ１６Ｅ７基因,纯化Ｅ７蛋白并免疫动物,用ＥＬＩＳＡ检测动物血清中的特异性Ｅ７抗体,进而评估Ｅ７蛋白的抗原性。结果：融合型的Ｅ７蛋白产量可达细胞总蛋白量的３０％;ＥＬＩＳＡ检测表明动物体内产生了特异性Ｅ７抗体。结论：ＨＰＶ１６湖北株Ｅ７蛋白可通过基因克隆方法制备,并保留了标准Ｅ７蛋白的抗原性。     

潮州地区人乳头瘤病毒52型E6多态性分析

目的:明确潮州地区人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)52型E6编码区的基因多态性.方法:提取101例HPV 52单纯感染者宫颈脱落细胞DNA,通过特异性引物扩增HPV 52-E6编码区全序列,成功获得83份HPV 52-E6 PCR扩增阳性产物,进行测序及BLAST多态性分析.结果:成功获得76条HPV 52-E6基因全序列(447 bp).该序列与参考株(GQ472848)的一致性为99％.在潮州地区发现11种E6编码区多态性,9种为同义突变,2种有义突变,引起所编码氨基酸改变.根据基因多态性分亚洲群和欧美群2群.亚洲群有7组,第1组,也是最为常见组(50/76     

高危型人乳头瘤病毒E6、E7mRNA检测筛检宫颈癌的临床评价

目的:探究高危型人乳头瘤病毒(HPV) E6、E7mRNA检测筛检宫颈癌的临床应用价值。方法:选取2016年3月—2017年3月因宫颈疾病于我院就诊的83例患者为观察对象,采集其宫颈样本后,对宫颈液基薄层细胞学检查(TCT)常规筛检异常的患者阴道镜下取活检组织送病理学检查,以病理学检查结果为金标准,比较高危型HPV E6、E7mRNA与HPV-DNA分型检出率、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及检测费用、患者满意度。结果:高危型HPV E6、E7mRNA检出率57. 83%与HPV-DNA分型检出率62. 65%比较,差异无统计学意义(P> 0. 05),且慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的检出率比较,差异无统计学意义(P> 0. 05);高危型HPV E6、E7mRNA与HPV-DNA分型检测敏感性、阳性预测值、阴性预测值比较,差异无统计学意义(P> 0. 05);高危型HPV E6、E7mRNA检测特异性显著高于HPV-DNA分型(P <0. 05);与HPV-DNA分型检测比较,高危型HPV E6、E7mRNA检测费用显著较低,患者满意度显著较高,差异具统计学意义(P <0. 05)。结论:高危型HPV E6、E7mRNA筛检宫颈癌特异性更高,能减少因误诊造成的过度检测及治疗,提高患者满意度,减轻其经济负担。     

人乳头瘤病毒18型E7蛋白基因的克隆研究

根据人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８的核苷酸序列，设计扩增其Ｅ７基因的特定引物，并使引物进５′端引入ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ酶切位点，用聚合酶反应扩增ＨＰＶ１８Ｅ７片段，通过ｐＵＣ１８质粒载体多聚接头的ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与Ｅ７基因片段连接，构建一新的重组体，转化到大肠杆菌ＪＭ１０９，经筛选，快提质粒等鉴定，初步证实获得了ＨＰＶ１８Ｅ７基因的重组体。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测宫颈癌筛查中的应用研究

目的 探讨人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测宫颈癌筛查中的应用价值.方法 方便选取2018年6月—2020年4月在该院进行宫颈疾病筛查的180名女性为研究对象,同时对研究对象进行液基细胞学、HPV-DNA和HPV E6/E7mRNA检测,根据TCT检测结果将研究对象分为NILM、ASC-US、LSIL、HSIL、SCC...     

人乳头瘤病毒16型早期基因E7的克隆及其在原核细胞中的表达

目的 进一步研究与宫颈癌密切相关的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｅ７基因的生物学活性。方法 采用ＰＣＲ法从妇女宫颈癌标本中扩增ＨＰＶ１６早期基因Ｅ７,测人ＤＮＡ诉序列,结果 克隆的ＨＰＶ１６Ｅ７基因与标准型进行比较表明,前者无核苷酸突变。将此基因装入原核表达载体,能在Ｅ．Ｃｏｌｉ中高效表达出谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）－Ｅ７蛋白,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析表明,此融合蛋白能在Ｅ７抗体特异地结合。结论     

人乳头瘤病毒18型E7蛋白基因的克隆研究

根据人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８的核苷酸序列，设计扩增其Ｅ７基因的特定引物，并使引物的５′端引入ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ酶切位点，用聚合酶链反应扩增ＨＰＶ１８Ｅ７片段，通过ｐＵＣ１８质粒载体多聚接头的ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与Ｅ７基因片段连接，构建一新的重组体，转化到大肠杆菌ＪＭ１０９，经筛选，快提质粒等鉴定，初步证实获得了ＨＰＶ１８Ｅ７基因的重组体。     

人乳头瘤病毒18型晚期基因L1的克隆及测序

人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要致病因素，其中ＨＰＶ１８致病进程晚具侵袭性，其晚期基因Ｌ１现被有竽疫苗学研究。本实验从ＨＰＶ１８－ＰＢＲ３２２质粒中克隆ＨＰＶ１８Ｌ１片段，构建了ＨＰＶ１８Ｌ１－ＰＧＥＭ重组质粒。对Ｌ１片段峡谷端测序时发现，原始报道序列在５７０１和６８４２位置的碱基为Ｃ，而实际测序结果均为Ｇ，推断其相应三联密码子编码的氨基酸变化分别为Ｐｒｏ→Ａｒｇ，Ｐｒｏ→Ｐｒｏ。     

肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及其与HPV感染的关系

目的探讨肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中的蛋白表达以及人乳头瘤病毒(HPV)16E6、E7和HPV18E6/E7感染对其表达的影响。方法采用免疫组化SP法检测70例浸润性宫颈癌、15例原位癌、20例正常宫颈组织中KAI1蛋白的表达,采用PCR扩增-琼脂糖凝胶电泳法检测浸润性宫颈癌组织中HPV16E6、E7和HPV18E6/E7的DNA状况。结果宫颈浸润癌及原位癌组织中的KAI1蛋白表达与正常宫颈上皮中的表达相比明显下调(P<0.05),原位癌与浸润癌中的表达差异无统计学意义;HPV16E6、E7和HPV18E6/E7在浸润性宫颈癌中的阳性率分别为67.1%、54.3%和12.9%,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染与宫颈癌中的KAI1蛋白表达无相关性。结论肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌中呈下调表达,HPV16E6、E7和HPV18E6/E7感染不影响其表达。     

融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7的构建及其免疫学特性研究

目的 构建融合DNA疫苗CRT180/HPV6E7,并评价其体外实验和动物模型上的免疫学特性,尤其是抗病毒致病基因的特异性细胞免疫反应.方法 分别构建DNA重组体pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7,pcDNA3.1-CRT180,pcDNA3.1-HPV6E7.将pcDNA3.1-HPV6E7质粒经脂质体介导转染B16细胞,以G418筛选阳性细胞集落,荧光显微镜观察和RT-PCR鉴定表达HPV6E7的阳性细胞株.将质粒DNA肌注免疫C57BL/6小鼠,3次后取全血经流式细胞仪检测T细胞亚群的变化,LDH法检测小鼠的脾细胞和淋巴细胞与靶细胞B16/HPV6E7孵育后的CTL活性以及ELISA法检测共孵育上清中IL-2和IFN-γ浓度的变化.结果 各组质粒经鉴定表明构建正确.转染后细胞株稳定表达HPV6E7.DNA疫苗免疫小鼠后,pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7免疫组较pcDNA3.1-HPV6E7免疫组的外周血CD8 T细胞和TCRγδT细胞的比例显著增加,脾细胞和淋巴细胞针对靶细胞B16/HPV6E7的CTL杀伤活性更明显,分泌IL-2和IFN-γ的水平升高(P＜0.05).结论 CRT180与HPV致病基因6E7相连的重组质粒疫苗pcDNA3.1-CRT180/HPV6E7能引发小鼠T细胞亚群CD8 分化并诱导出显著的特异性CTL反应.推测CRT180/HPV6E7 DNA疫苗在动物模型上可以有效激活抗HPV特异性细胞免疫,有利于病毒感染的清除.     

人乳头瘤病毒E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值研究

目的 探索HPV E6/E7mRNA检测在宫颈病变中的诊断价值。方法 收集2016年12月~2017年10月在笔者医院妇科行细胞学和HPV DNA基因分型联合筛查发现疑似宫颈病变并转阴道镜活检的女性病例262例,活检同期均行HPV E6/E7mRNA检测,以宫颈组织病理活检为标准对照。对比3种方法检测宫颈病变HSIL的敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比、阴性似然比及受试者工作特征曲线下面积（AUC）,及3种方法在不同病理级别中的检出情况,并分析HPV E6/E7mRNA病毒载量与病变关系。结果 HPV E6/E7mRNA检测宫颈病变≥HSIL的敏感度与HPV DNA基因分型和细胞学相似,特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比均高于细胞学和HPV DNA基因分型;HPV E6/E7mRNA的受试者工作特征曲线下面积（AUC=0.80, P<0.01）高于细胞学（AUC=0.65, P<0.01）和HPV DNA分型（AUC=0.54,P>0.05）的曲线下面积;HPV mRNA和细胞学在不同病理级别中的检出率比较,差异有统计学意义（P<0.01）,HPV DNA基因分型在不同病理级别中的检出率比较差异无统计学意义（P>0.05）;HPV E6/E7 mRNA表达水平与组织病理分级之间的相关关系有统计学意义（P<0.01）,且HPV E6/E7mRNA表达水平与宫颈病理分级间呈正相关（r=0.467）。结论 HPV E6/E7mRNA检测对宫颈病变诊断准确性优于细胞学和HPV DNA分型,在宫颈病变及癌变的筛查中具有一定的临床价值,临床医生应给予关注。     

人乳头瘤病毒58型E7基因重组真核表达质粒的构建与序列分析

目的:构建含人乳头瘤病毒58型(HPV58)E7基因的真核表达质粒,获得HPV58感染人后病毒基因结构的基本信息。方法:用HPV型特异性引物扩增出HPV58型E7 DNA,将HPV58 E7 DNA与PBS-T载体连接,获得克隆重组体HPV58 E7-PBS-T,经双酶切鉴定后,将E7基因与真核表达载体PCDNA3.1连接,然后经双酶切、测序鉴定,通过GenBank的数据库分析软件对HPV58型E7基因进行同源性分析。结果:双酶切重组DNA结果显示,重组体中HPV58型E7基因片段和载体DNA大小与预期计算一致,经BLAST比对,与GenBank数据库中的HPV58型E7基因序列具有高度的同源性,其中与1991年日本学者最早报道HPV58型E7基因相比,仅125位一个碱基的差异,即C-T的突变;推导相应的氨基酸由脯氨酸(pro)变为亮氨酸(leu)。结论:构建了含HPV58型E7基因的真核表达质粒,其基因序列与报道的基因序列高度同源,其微小差异对功能有无影响有待探讨。该重组质粒的构建为HPV58型E7基因及表达蛋白的功能研究奠定基础。     

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.     

人表皮生长因子cDNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

应用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR法）从人脐静内皮细胞RNA中扩增了表皮生长因子（EGF）的cDNA，采用基因重组技术克隆到pGEM－3zf（＋）载体中，经全自动荧光测序仪测定了其序列。在PCR扩增引物上分别加有起始密码子（ATG）和终止密码子（TGA），以利于原核表达。经亚克隆，EGFcDNA克隆到表达载体pBV220的EcoRI、SmaⅠ位或上，在大肠杆菌DH5α中进行表达。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳表明其表过量约占菌体总蛋白的10％。     

HPV16 E_7基因克隆及其特异性鉴定

根据已报导的ＨＰＶ１６Ｅ_７基因序列，设计了两个寡核苷酸引物，在引物的５′端分别引入了ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点，采用多聚酶链反应（ＰＣＲ）扩增了ＨＰＶ１６Ｅ_７基因片段。通过ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切位点与ｐＵＣ１８载体连接，重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９，在含Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ的平板上直接筛选，斑点杂交，ＰＣＲ扩增鉴定和酶切分析证明得到了含ＨＰＶ１６Ｅ_７完整的编码序列的重组克隆。     

人白细胞介素18cDNA的克隆及序列测定

目的获取人IL-18cDNA克隆.方法用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中获取人IL-18cDNA,将其克隆至天然蛋白表达载体PBV220中,并进一步亚克隆至融合蛋白表达载体PGEX-4T-3中,对其进行酶切分析及序列测定.结果测序结果表明克隆至PBV220中的IL-18cDNA包含成熟IL-18蛋白的全部编码序列,酶切分析表明一约470 bp的基因片段克隆至PGEX-4T-3中,与理论预计的一致.结论获得了编码人IL-18成熟活性蛋白的cDNA克隆.