云南省傣、彝、汉族人FⅧ基因BclⅠ限制性片段长度多态性的研究

为探讨FⅧ基因BcⅠ限制性内切酶多态性位点在云南省人群中的诊断价值,应用PCR技术及PAGE分离技术获得云南省傣、彝、汉族人群的多态信息量(polymorphic informative con-tent,PIC),其中傣族人的PIC为0.6435,明显高于汉族人的PIC 0.4190,显著高于彝族人PIC0.3641,这充分显示了FⅧBclⅠ多态现象的民族差异性及该分子遗传标志的应用价值。     

云南省傣,彝,汉族人凝血因子ⅧST14（DXS52）VNTR的研究

甲型血友病是凝血因子Ⅷ（ＦⅧ）基因缺陷导致的一种遗传性出血性疾病。近年来已发现大量甲型血友病的基因缺陷。我们应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，分析了云南省傣、彝、汉族人ＳＴ１４（ＤＸＳ５２）可变数目串联重复序列（ＶＮＴＲ）的多态性特点，现报道如下。对象...     

云南省傣、彝、汉族人FⅧ基因BclⅠ限制性片段长度多态性研究

为确定凝血因子Ⅷ (ＦⅧ )基因ＢｃｌⅠ多态性位点在云南省人群中的多态信息量 (ＰＩＣ)及其在血友病Ａ家系携带者检测及产前诊断中的价值 ,我们应用聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术对云南省傣、彝、汉族人群进行了ＦⅧ基因ＢｃｌⅠ限制性片段长度多态性 (ＲＦＬＰ)分析。对象和方法1　研究对象　标本来自云南省三代纯傣族、彝族和汉族不相关正常个体各 5 0名。傣族男 2 0名 ,女 30名 ,共检测 80条Ｘ染色体 ;彝族男 2 2名 ,女 2 8名 ,共检测 78条Ｘ染色体 ;汉族男 2 2名 ,女 2 8名 ,共检测 78条Ｘ染色体。2　基因扩增　参照常规方法稍改进 ,从外…     

凝血因子Ⅷ基因内二核苷酸重复序列在云南省傣、彝和汉族人群中的多态性研究

研究云南省傣、彝和汉族人凝血因子Ⅷ基因内含子22(CA)n二核苷酸重复序列的多态性,获取高多态信息量的分子遗传标志.应用聚合酶链反应(PCR)和DNA序列分析技术及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对该位点的基因频率及多态信息量进行调查.结果发现,傣族和彝族中至少有(CA)n拷贝数为24,25和26的3种等位基因片段,两民族中的频率分布分别为1.2%-57.5%和16.43%-63.00%;汉族人群中至少有5种等位基因片段,(CA)n拷贝数分别为24,25,26,27和28,频率分布在8.97%-32.00%.在上述三种民族人群中均未发现FⅧ基因内含子22二核苷酸重复序列的杂合子.本研究的结果提示,目前至少可认为该位点不宜作为云南省傣、彝和汉族人群的DNA遗传标志.     

凝血因子V、Ⅷ和组织因子与2型糖尿病合并冠心病的关系

目的探讨凝血因子V活性（FV：C）、凝血因子Ⅷ活性（FⅧ：C）和组织因子（TF）在2型糖尿病（T2DM）合并冠心病（HD）诊断中的应用价值。方法测定85例T2DM合并CHD患者[T2DM合并CHD组,根据CHD不同类型再分为T2DM合并急性心肌梗死（AMI）组（19例）、T2DM合并陈旧性心肌梗死（OMI）组（23例）、T2DM合并不稳定型心绞痛（UAP）组（25例）、T2DM合并稳定型心绞痛（SAP）组（18例）]、29例无合并症的单纯T2DM患者（单纯T2DM组）和24名健康对照者（正常对照组）FV：C、FⅧ：C、血浆TF和血管性血友病因子（VwF）活性及血小板聚集率（PAR）,并分析FV：C、FⅧ：C、TF与VwF、PAR的相关性。结果T2DM合并CHD组和单纯T2DM组FV：C、FVIU：C和TF水平均明显高于正常对照组（P〈0．001）,且T2DM合并CHD组明显高于单纯T2DM组（P〈0．01）。T2DM合并CHD组中,T2DM合并AMI组和T2DM合并UAP组FV：C、FⅧ：C和TF水平均明显高于单纯T2DM组（P〈0．001）,且T2DM合并AMI组明显高于T2DM合并UAP组（P〈0．01）;T2DM合并OMI组和T2DM合并SAP组TF水平明显高于单纯T2DM组（P〈0．01）,但FV：C和FⅧ：C水平3组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。FV：C、Fvm：C、TF与VwF、PAR均呈明显正相关（P〈0．01）。结论FV：C和FVIH：C及TF水平可作为T2DM患者并发CHD的诊断指标。TF对判断T2DM合并CHD患者病情的进展有重要价值。     

聚酰胺-胺型树枝状聚合物介导人凝血因子Ⅷ的体外高效稳定表达

目的 应用纳米材料聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物／逆病毒基础的质粒载体复合体，在表达水平、持续时间和细胞毒性三方面进行血友病A基因治疗的体外研究。方法 PAMAM树枝状聚合物与含B区缺失(760aa～1639aa)人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)的以逆病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅦBD形成复合体后，转染NIH3T3细胞系，于转染后第2，5，10，15，30d留取细胞培养上清，分别采用一期法和ELISA法检测其中人FⅧ的凝血活性(FⅧ：C)和抗原含量(FⅧ：Ag)，并应用RTPCR方法检测细胞中FⅧBD cDNA的转录，以细胞生长抑制率来表示PAMAM的细胞毒性。结果 PAMAM载体介导的人FⅧ的体外表达可持续30d，24h内每ml细胞上清中10^6细胞表达FⅧ：C平均为0．929U，FⅧ：Ag平均为0．188μg，期间FⅧ表达未见降低；PAMAM的细胞生长抑制率为5．32％。结论 PAMAM能够有效介导逆病毒基础的质粒载体pLNC-FⅧBD转染靶细胞，并维持高效稳定表达，且PAMAM的细胞毒性较低。     

L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ基因表达的影响

目的研究L-精氨酸对人凝血因子Ⅷ（FⅧ）基因转录及表达的影响。方法将B结构域（氨基酸760～1639）缺失的人FⅧcDNA（BDDhFⅧcDNA）插入至质粒载体pcDNA6／V5-HisA，构建重组载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ，转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC），加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h后，用ELISA方法检测细胞上清液中的人FⅧ抗原（FⅧ：Ag），一期凝血酶法检测FⅧ的促凝活性（FⅧ：C）。用Northern blot检测HUVEC中人FⅧ基因的转录。用PCR扩增BDDhFⅧcDNA的A1、A2、A3、C1和C2结构域基因，分别插入至pcDNA6／V5-HisA，构建五种载体pcDNA6／V5-HisA-BDDhFⅧ-A1、pcDNA6／V5-BDDhF Ⅷ-A2、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-A3、pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C1和pcDNA6／V5-HisA-BDDhF Ⅷ-C2，分别转染HUVEC后，加入L-精氨酸（终浓度10mmol／L）培养72h。膨胀裂解法分离细胞核，进行细胞核连缀（Run-on）反应，狭线印迹杂交检测A1、A2、A3、C1和C2结构域基因的转录。结果经L-精氨酸诱导后，HUVEC中人FⅧ基因表达明显增强[FⅧ：Ag为（146．08±4．78）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．752±0．009）U／ml]，约是未经L-精氨酸诱导[FⅧ：Ag为（34．66±3．98）ng／ml，10^6细胞诱导24h后FⅧ：C为（0．171±0．006）U／ml]的4倍（P〈0．01）。Northern blot检测显示，加L-精氨酸培养之后，HUVEC中人BDDFⅧ mRNA的转录也较未加L-精氨酸显著增强，而只转染pcDNA6／V5-HisA的HUVEC中无人BDDFⅧ mRNA的转录存在。Run-on及狭线印迹杂交显示，加L-精氨酸培养后，A1和A2结构域基因的转录均较未经L-精氨酸诱导者明显增强，也显著强于A3、C1和C2结构域基因的转录，而A3、C1和C2结构域基因的转录在L-精氨酸诱导前后均无明显变化。结论L-精氨酸通过促进人FⅧ的A1和A2结构域基因的转录进而增强FⅧ在体外的转录和表达，因而在血友病A的基因治疗研究中，L-精氨酸是一个很有前途的诱导FⅧ转录和表达的物质。     

炎症标志物及凝血因子与深静脉血栓形成的相关性研究

本研究分析下肢深静脉血栓形成（deep vein thrombosis,DVT）与c反应蛋白（C—reactiveprotein,CRP）,血浆纤维蛋白原（fibrinogen,Fg）、凝血因子Ⅷ（coagulation factorⅧ,FⅧ）和凝血因子Ⅸ（coagulation factorIX,FIX）之间的相关性,探讨炎症反应和凝血异常及其二者之间相互影响在下肢DVT中的作用和机制。采用免疫散射速率比浊法检测血浆CRP浓度,一期法测定FⅧ：C和FⅨ：C水平,凝血法检测血浆融合量,将上述指标进行病例组和对照组组间比较,并分析CRP与FⅧ：C、FⅨ：C及Fg之间的相关关系。结果表明：病例组CRP、Vg、FⅧ：C和FⅨ：C水平均显著高于对照组[CRP（2．67±0．91）：（0．14±0．08）mg／dl;Fg（4．73±1．36）：（2．79±0．66）g／L;FⅧ：C（126．71±28．10）：（81．35±20．77）％;FIX：c（81．01±23．60）：（70．71±11．3）％],P值均小于0．01。病例组CRP与Fg、FⅧ：C和FⅨ：C之间均具有相关关系,相关系数分别为0．432、0．571和0．544,P值均小于0．01。结论：炎症与DVT密切相关,血浆CRP水平升高可能是DVT发生的一个预测指标;血浆Fg、FⅧ：C和FⅨ：C水平升高是DVT的重要危险因素;炎症反应与凝血因子相互作用发挥促凝作用,是下肢DVT发生的可能发病机制之     

人凝血因子Ⅷ活性测定中2种APTT试剂的比较

目的：比较进口与自制APTT试剂，在FⅧ：C检测中的应用，方法：人凝血因子Ⅷ活性测定一期法。结果：自制APTT试剂在性能上与进口APTT试剂差异无显著性，相关系数(r)均值分别为0．994，0．995；样品重复测定变异系数（CV％）均值为4．22，4．84；样品稳定性CV（％）均值为1．36，1．46，结论：自制APTT试剂亦能用于FⅧ制品生产的质量监控以及止血与血栓的研究。     

4℃保存过夜全血制备FFP的质量

背景此研究的目的是评估4℃保存过夜全血制备FFP的质量是否能满足预期的要求。研究设计与方法比较60份4℃保存过夜去白细胞（LD）全血制备的FFP（采血后18小时～24小时，1日FFP）与采血后8小时内LD全血制备的FFP（0日FFP，当前标准方法）的质量。结果95％以上的1日FFP单位中，FⅡ、FⅤ、FⅦ、FⅧ、FⅨ、FⅩ、FⅪ和FⅫ因子浓度高于0．50U／ml；92％和87％的FFP单位的VWF抗原和FⅧ因子含量高于0．50IU／ml。     

倒位PCR技术在血友病A基因诊断中的应用及改进

目的 对倒位PCR(I-PCR)技术进行改进并应用于血友病A凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因倒位突变的检测,探讨其产前诊断价值.方法 选取了8个无血缘关系的血友病A家系,应片j已改进的I-PCR技术直接检测FVS基因第22内含子倒位.对2名孕妇分别于妊娠22及26周抽取胎儿脐静脉血,在检测脐血血浆FⅧ活性的同时应用I-PCR技术进行产前FⅧ基因突变检测.结果 8个家系中检出4个家系为FⅧ基因倒位;根据FⅧ活性及基因突变检测结果 ,2名胎儿均诊断为正常胎儿.1名已出生.经随访与产前诊断结果 相符合.结论 应用I-PCR技术可以快速有效地进行血友病A FⅧ基因倒位突变的检测并可作为产前诊断的辅助手段.     

人凝血因子ⅧcDNA在小鼠体内的转染与表达

本研究观察逆转录病毒载体和聚酰胺-胺型(PAMAM)树枝状聚合物介导的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因在小鼠体内的转染和表达，并与体外转染方法作比较。应用含B区缺失(760aa-1639aa)人FⅧcDNA(FⅧBD cDNA)的以逆转录病毒为框架的重组表达质粒载体pLNC-FⅧBD包装成为逆转录病毒LNC-FⅧBD，ex vivo转染小鼠骨髓基质细胞，同时将pLNC-FⅧ BD与PAMAM树枝状聚合物按照1：15混合以形成复合体PAMAM-pLNC-FⅧBD进行小鼠in vivo转染。分别于注射后第24，48小时，第1，2，3，4周取血，分离血浆，采用一期法测定人FⅧ活性(FⅧc)，ELISA法测定人FⅧ抗原(FⅧAg)，并采用Bethesda inhibitor assay测定人FⅧ抗体；同时取脏器肝、脾、肺、肾提取RNA，进行RT-PCR，观察各组织的转录，并用苏木素-伊红染色法观察各组织的形态学改变。结果表明，逆转录病毒转染人FⅧ基因的骨髓基质细胞输入体内后，可以在体内继续表达人FⅧ，并且能有效地分泌至血液中。宿主小鼠体内可检测到的人FⅧ表达持续3周以上，注射后第24小时表达最高水平，人FⅧAg平均为8．6ng/ml，此后人FⅧ抗体逐渐生成，人FⅧ Ag水平渐低，于注射后第4周不再能测出人FⅧ Ag。注射复合体PAMAM-pLNC-FⅧ BD在体内转染后，获得了短暂的人FⅧ生理水平的表达，在注射后第48小时表达水平最高，人FⅧc和FⅧ Ag的平均水平分别为0．62U／ml和115．5ng／ml；注射后第3周平均水平降至0．042U／ml。RT-PCR结果表明，各脏器表达人FⅧ的水平不一，脾脏和肺脏表达水平高，且时间长，注射后各个时间点的小鼠血浆均未见人FⅧ抗体产生。组织病理学检查未发现小鼠各器官组织有病理改变。结论：经逆转录病毒介导的人FⅧ经ex vivo转染于BALB/C小鼠体内，其表达人FⅧ水平较低且该小鼠免疫原性增强，容易产生抗体；C57BL/6J小鼠在注射复合体PAMAM-pLNC-hFⅧ BD(即体内转染)后可获得短暂的人FⅧ生理水平的表达，在注射后第48小时表达水平最高，至少可持续表达2周以上。     

凝血酶生成试验在血友病患者中的应用

目的：探讨凝血酶生成试验在血友病患者中的应用。方法：收集134例血友病患者[其中血友病A（HA）114例，血友病B（HB）20例1的临床资料，根据FⅧ：C／FIX：C不同，将无FⅧ／FⅨ抑制物的132例HA／HB患者分成重型（FⅧ：C／FIX：C〈1％）、中型（FVIU：C／FIX：C1％～5％）及轻型（FⅧ：C／FIX：C6％～25％）3组，检测凝血酶生成、FⅧ：C／FIX：C及其抑制物。结果：重型HA／HB患者与轻型者比较，出血频度及凝血酶生成各指标差异均有统计学意义（P〈0．01）；而重型者与中型者比较，除延迟时间和达峰时间差异有统计学意义外（P〈0．01），其余指标差异均无统计学意义；中型者与轻型者比较，除延迟时间和达峰时间差异无统计学意义外，其余指标差异均有统计学意义（P〈0．01）。HA／HB患者的出血频度与FⅧ：C或FIX：C无关（P=0．16），而与凝血酶生成潜力（ETP）密切相关（P=0．0001）：结论：凝血酶生成试验可作为预测HA／HB患者出血风险的有效手段。     

凝血因子Ⅷ基因内二核苷酸重复序列的云南省傣,彝和汉族 …

研究云南省傣、彝和汉族人凝血因子Ⅷ基因内含子２２（ＣＡ）ｎ二核苷酸重复序列的多态性,获取高多态信息量的分子遗传标志。应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＤＮＡ序列分析技术及聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）对该位点的基因频率及多态信息量进行调查。结果发现,傣族和彝族中至少有（ＣＡ）ｎ拷贝数为２４,２５和２６的３种等位基因片段,两民族中的频率分布分别为１．２％－５７．５％和１６．４３％－６３．００％;汉族人群中     

凝血因子Ⅴ、Ⅷ和组织因子与2型糖尿病合并冠心病的关系

目的探讨凝血因子Ⅴ活性(FⅤ:C)、凝血因子Ⅷ活性(FⅧ:C)和组织因子(TF)在2型糖尿病(T2DM)合并冠心病(HD)诊断中的应用价值。方法测定85例T2DM合并CHD患者[T2DM合并CHD组,根据CHD不同类型再分为T2DM合并急性心肌梗死(AMI)组(19例)、T2DM合并陈旧性心肌梗死(OMI)组(23例)、T2DM合并不稳定型心绞痛(UAP)组(25例)、T2DM合并稳定型心绞痛(SAP)组(18例)]、29例无合并症的单纯T2DM患者(单纯T2DM组)和24名健康对照者(正常对照组)FⅤ:C、FⅧ:C、血浆TF和血管性血友病因子(VWF)活性及血小板聚集率(PAR),并分析FⅤ:C、FⅧ:C、TF与VWF、PAR的相关性。结果 T2DM合并CHD组和单纯T2DM组FⅤ:C、FⅧ:C和TF水平均明显高于正常对照组(P0.001),且T2DM合并CHD组明显高于单纯T2DM组(P0.01)。T2DM合并CHD组中,T2DM合并AMI组和T2DM合并UAP组FⅤ:C、FⅧ:C和TF水平均明显高于单纯T2DM组(P0.001),且T2DM合并AMI组明显高于T2DM合并UAP组(P0.01);T2DM合并OMI组和T2DM合并SAP组TF水平明显高于单纯T2DM组(P0.01),但FⅤ:C和FⅧ:C水平3组之间差异无统计学意义(P0.05)。FⅤ:C、FⅧ:C、TF与VWF、PAR均呈明显正相关(P0.01)。结论FⅤ:C和FⅧ:C及TF水平可作为T2DM患者并发CHD的诊断指标。TF对判断T2DM合并CHD患者病情的进展有重要价值。     

新鲜冰冻血浆中凝血因子于-30℃、-80℃保存的动态变化

目的分析新鲜冰冻血浆(FFP)于两种温度下保存1年其凝血因子活性的动态变化,为制定FFP的有效保存温度和保存时间提供依据.方法 FFP分别于-30℃、-80℃保存,于0、90、180、270、360 d分别采用一期法测定FⅧ:C、FⅤ:C、FⅨ:C及FⅪ:C,用免疫比浊法测定vWF和FⅧ:CAg.结果 FFP在-30℃保存1年的FⅧ:C、FⅤ:C、FⅨ:C、FⅪ:C,vWF和FⅧ:CAg均符合质量标准,其中FⅨ:C及FⅪ:C,vWF和FⅧ:CAg与初期相比差异无显著性;FⅧ:C与FⅤ:C显著降低,但高于70%;上述各凝血因子在-80℃保存1年其活性与保存初期相比差异无显著性.结论 FFP于-30℃保存1年,其凝血因子具有较好的临床止血效果,-80℃有利于不稳定凝血因子的保存.     

血浆凝血因子Ⅷ抗原及活性的测定

目的建立血浆FⅧ抗原及活性定量测定的方法.方法对46例正常人及两个遗传性FⅧ缺陷症家系部分成员采用双抗体夹心法检测FⅧ抗原,生物素化戊胺测定FⅧ活性,以FⅧ标准品建立标准曲线.结果 3例患者FⅧAAg均为0%,FⅧBAg分别为正常人的78.46%、66.43%、57.29%.46例正常人血浆FⅧ活性FⅧC平均值为86.34%±17.98%,范围在56.5%～165.17%之间,3例患者为0%,家系中杂合子范围为29.60%～104.86%.结论 双抗体夹心法和生物素标记法均为简捷、灵敏而且特异的FⅧ测定方法.     

ABO血型、性别和年龄对血浆成分中Ⅷ因子和纤维蛋白原含量的影响

目的探讨ABO血型、性别、年龄对血浆成分中Ⅷ因子活性(FⅧ)和纤维蛋白原含量(FIB)的影响。方法采用离心法制备冷沉淀凝血因子和去冷沉淀血浆,检测献血者ABO血型、冷沉淀凝血因子与去冷沉淀血浆中Ⅷ因子活性和纤维蛋白原含量,并采用t检验,LSD法及多元线性逐步回归对各组数据进行分析。结果冷沉淀凝血因子中FⅧ水平以A型、B型组明显高于O型组(P 0.001),去冷沉淀血浆中FⅧ水平以A型、O型组明显低于B型组(P 0.01)。冷沉淀凝血因子中FI B水平以女性组明显高于男性组(P 0. 005),去冷沉淀血浆中FI B水平以女性组明显高于男性组(P 0. 05)。去冷沉淀血浆中FⅧ水平以30岁人群明显高于≤30岁人群(P 0.05),去冷沉淀血浆中FIB水平以30岁人群明显高于≤30岁人群(P 0.001)。结论血型是冷沉淀凝血因子和去冷沉淀血浆中FⅧ水平的影响因素,B型含量均是最高。ABO血型对冷沉淀凝血因子和去冷沉淀血浆中FIB水平无影响。性别是冷沉淀凝血因子中FⅧ和FIB水平的影响因素,也是去冷沉淀血浆中FIB水平的影响因素,且女性组高于男性组。年龄是去冷沉淀血浆中FⅧ和FIB水平的影响因素,适龄献血人群中30岁组明显高于≤30岁组。     

血浆凝血因子XⅢ抗原及活性的测定

目的:建立血浆FⅧ抗原及活性定量测定的方法.方法对46例正常人及两个遗传性FⅧ缺陷症家系部分成员采用双抗体夹心法检测FⅧ抗原,生物素化戊胺测定FⅧ活性,以FⅧ标准品建立标准曲线.结果 3例患者FⅧA:Ag均为0%,FⅧB:Ag分别为正常人的78.46%、66.43%、57.29%.46例正常人血浆FⅧ活性FⅧ:C平均值为86.34%±17.98%,范围在56.5%～165.17%之间,3例患者为0%,家系中杂合子范围为29.60%～104.86%.结论: 双抗体夹心法和生物素标记法均为简捷、灵敏而且特异的FⅧ测定方法.     

凝血因子Ⅷ、Ⅸ同时缺乏1例

凝血因子Ⅷ和Ⅸ(FⅧ：C、FⅨ：C)主要在肝脏中合成．参与机体内源性凝血机制。当FⅧ：C、FⅨ：C缺乏时会引起一系列出血症状。临床上常见单一的FⅧ：C或FⅨ：C缺乏．而两者同时缺乏极为罕见。近期笔者发现1例FⅧ：C、FⅨ：C同时缺乏患者。报告如下。