部分纯化的牛心细胞质提取物对心肌细胞膜“run-down”L-型钙通道活性的恢复作用

目的研究牛心细胞质部分纯化提取物及钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)对大鼠心肌细胞膜L-型钙通道活性的调节作用。方法采用常规的蛋白提取方法制备牛心细胞质提取物,离子交换方法进行部分纯化。应用膜片钳制技术的细胞贴附和膜内向外记录模式记录大鼠心室肌细胞单通道钙电流,观察牛心细胞质部分纯化提取物和CaMKⅡ对"run-down"L-型钙通道活性的恢复作用。Western blot方法验证活性蛋白。结果膜内向外记录模式下,L-型钙通道出现"run-down"现象,活性下降至细胞贴附记录模式的(0.46±0.15)%;牛心细胞质部分纯化提取物使"run-down"的通道活性恢复至细胞贴附记录模式的(44.29±13.51)%(P<0.01),加入CaMKⅡ抑制剂KN-62(1μmol/L)后活性仅恢复至(1.30±0.94)%,与未加抑制剂组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot方法验证牛心细胞质部分纯化提取物中含有CaMKⅡ;基因重组融合蛋白法制备的CaMKⅡ也可将"run-down"后的钙通道活性恢复至细胞贴附记录模式的(71.59±14.76)%(P<0.05)。结论牛心细胞质部分纯化提取物对"run-down"钙通道活性具有恢复作用,该作用可能与CaMKⅡ密切相关。     

ISO通过CaMKⅡ和PKA激活RyR2诱发心肌细胞凋亡

目的：探讨异丙肾上腺素（ISO）持续激活Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）和蛋白激酶A (PKA)后对心肌细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：将H9C2心肌细胞分为Control组、ISO组、ISO+KN93 (CaMKⅡ抑制剂)组、ISO+H-89 (PKA抑制剂)组，经不同药物干预后，通过CCK-8法检测心肌细胞活力，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒和流式细胞术检测心肌细胞凋亡，Western blot法检测CaMKⅡ、PKA、兰尼碱受体2 (RyR2)及凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3、Bax、Bcl-2的表达情况，荧光显微镜观察细胞形态变化和钙荧光强度。结果：与Control组比较，ISO组细胞活性降低，CaMKⅡ、PKA和RyR2的磷酸化水平增加，凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Bax/Bcl-2表达增加，胞内钙含量增多，细胞凋亡率增多，差异均有统计学意义（P<0.01）；与ISO组比较，ISO+KN93和ISO+H-89组细胞活性增高，CaMKⅡ、PKA和RyR2的磷酸化水平降低，凋亡蛋白Cleaved-Caspase...     

亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因的原核表达和免疫学分析

【目的】对亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因（CaN）进行克隆、表达和免疫学初步研究。【方法】将亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因克隆到原核表达质粒pET-30a（＋）中,在大肠杆菌BL-21／DE3中用诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析。【结果】PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-30a（＋）-TaCaN构建成功。SDS—PAGE结果表明目的基因能在大肠杆菌BL．21／DE3中表达,经亲和层析得到了纯化重组蛋白。重组蛋白能被感染了亚洲牛带绦虫的猪和患者的血清识别。[结论]亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达。为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

钙调蛋白的制备及活性测定

本文介绍了一个高度敏感的CaM活性测定法,该测定法以在Ca存在下CaM能刺激磷酸二酯酶的活性为基础。磷酸二酯酶从牛心肌提取,经过DEAE-cellulose柱层析纯化,用Lowry法测定蛋白含量为5mg/ml,2μl相当于1个活性单位。CaM从大鼠睾丸匀浆液中提取,经Fluphenazine-Sepharose亲和层析柱分离提纯。纯化CaM在SDS-凝胶电泳上显示为一个单一的蛋白带,分子量为16～17K道尔顿,0.5ng为一个活性单位。本文介绍的CaM活性测定法,敏感度为0.1ng,方法简便、可靠,重复性好。     

RyR2磷酸化在心力衰竭中的作用

 心力衰竭在细胞水平主要表现为心肌以兴奋 收缩耦联(excitement contraction coupling,ECC)为基础的收缩功能障碍,而Ca2+信号转导在此过程中起着非常重要的作用。肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)兰尼碱受体(ryanodine receptor type 2,RyR2)是心肌最重要的钙释放通道,RyR2磷酸化是肌浆网钙释放的基础,而RyR2磷酸化主要受蛋白激酶A (protein kinase A ,PKA)和钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ (calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的调控。目前对RyR2磷酸化的研究已经非常广泛,但对其涉及心力衰竭的具体发病机制仍有争议,本综述主要针此问题进行阐述。     

用亲和层析法纯化牛精浆蛋白

目的：从牛精浆中纯化牛精浆（BSP）蛋白。方法：利用盐析及亲和层析等方法对BSP蛋白进行纯化。结果：用Gelatin-Sephorase4B亲和胶纯化出一个蛋白峰,经电泳及氮基础测序证实为BSP－A1／－A2蛋白。结论：用市售Gelatin-Sephorase4B亲和胶可方便的纯化出BSP－A1／A2蛋白。     

双羟基黄酮醇抑制心衰后CaMKⅡ磷酸化降低室性心律失常易感性

目的:研究双羟基黄酮醇(DiOHF)通过抑制心衰(HF)后钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的磷酸化水平来降低心衰后室性心律失常的易感性。方法:采用主动脉缩窄术(TAC)构建压力负荷性心衰小鼠模型,用小动物超声机确认模型构建成功。假手术组小鼠分为Control组和Control+DiOHF组,心衰小鼠分为HF组和HF+DiOHF组。采用心内程序性电刺激(PES)分别检测4组小鼠的心室起搏阈值和心室不应期,诱导室性心律失常并进行心律失常评分。采用Western Blot分析各组心脏蛋白中的CaMKⅡ及其磷酸化水平。结果:与Control组相比,HF组小鼠的心室起搏阈值减小,不应期缩短,室性心律失常评分显著增高。而HF+DiOHF组相比HF组起搏阈值增大,心室不应期增长,室性心律失常评分显著降低。同时Western Blot显示HF组相比Control组,CaMKⅡ磷酸化水平显著升高,而HF+DiOHF组CaMKⅡ磷酸化水平相比HF组明显下降。结论:CaMKⅡ的过度激活引起心衰后的室性心律失常,而DiOHF可通过抑制心衰后CaMKⅡ的磷酸化水平来减少室性心律失常。     

CaMKⅡ在前列腺癌发生发展中的作用研究进展

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其活性被钙/钙调蛋白复合物（Ca²⁺/CaM）所调节,研究表明CaMKⅡ活化包括离子通道、激酶、转录因子在内的约40种蛋白质从而在多种肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、转移中发挥重要作用。CaMKⅡ是一个由α、β、γ、δ4种基因编码不同亚型的多聚酶,各亚型在不同肿瘤中的表达各异,笔者就CaMKⅡ的结构、功能及其各亚型在不同肿瘤中的表现及在前列腺癌发生、发展中的作用进行综述。     

CaMKⅡ活性抑制降低内质网应激诱导的大鼠心肌细胞死亡

目的探讨钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK）Ⅱ与内质网应激诱导的大鼠心肌细胞死亡的相关性。方法以成年SD大鼠心肌细胞为研究对象,使用毒胡萝卜素、衣霉素和brefeldin A诱导心肌细胞内质网应激,用碘化丙啶染色评价心肌细胞存活率,观察心肌细胞死亡情况。Western blot检测葡萄糖调节蛋白（GRP）78和DNA核苷酸序列CCAAT增强子结合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP）的表达。通过GRP78和CHOP上调评价内质网应激反应。结果毒胡萝卜素、衣霉素和brefeldin A呈时间和剂量依赖方式诱导内质网应激反应和心肌细胞的死亡（P〈0.01）,使GRP78和CHOP蛋白表达上调（P〈0.05）,KN93和AIP阻断CaMKⅡ活性后,GRP78和CHOP蛋白表达与各自的未阻断对照组相比下调（P〈0.05）,内质网应激反应减弱,内质网应激诱导的细胞死亡减少（P〈0.05）。结论毒胡萝卜素、衣霉素和brefeldin A诱导的内质网应激可能是通过CaMKⅡ依赖途径介导大鼠心肌细胞死亡。CaMKⅡ可能是治疗心肌梗死或防治心衰的新靶点。     

亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因的原核表达 和免疫学分析

 【目的】 对亚洲牛带绦虫钙调神经磷酸酶B基因(CaN)进行克隆&#65380;表达和免疫学初步研究&#65377;【方法】 将亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因克隆到原核表达质粒pET*9鄄30a(+)中,在大肠杆菌BL*9鄄21/DE3中用诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠*9鄄聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS*9鄄PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹进行免疫学分析&#65377;【结果】 PCR&#65380;双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET*9鄄30a(+)*9鄄Ta CaN构建成功&#65377;SDS*9鄄PAGE结果表明目的基因能在大肠杆菌BL*9鄄21/DE3中表达,经亲和层析得到了纯化重组蛋白&#65377;重组蛋白能被感染了亚洲牛带绦虫的猪和患者的血清识别&#65377;【结论】 亚洲牛带绦虫成虫钙调神经磷酸酶B基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达&#65377;为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础&#65377;     

愈痫灵对致痫大鼠海马神经元CaM和CaMKⅡα表达的影响

目的研究愈痫灵颗粒对致痫大鼠海马组织钙调蛋白(CaM)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)表达的影响。方法采用腹腔注射戊四氮(PTZ)造成慢性癫痫大鼠模型,以半定量RT-PCR技术检测不同药物干预后大鼠海马组织CaM和CaMKⅡα的mRNA表达水平;图像自动分析系统进行其吸光度扫描。结果愈痫灵颗粒可降低海马神经元CaMmRNA的表达,升高CaMKⅡαmRNA的表达。结论通过调控Ca2 信号转导途径中的某些靶位点,影响Ca2 -CaM-CaMKⅡα信息链是愈痫灵颗粒抗癫痫的重要途径之一。     

CaMKⅡ对多囊卵巢综合征模型小鼠颗粒细胞中Caspase-3表达的影响

目的：探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在正常小鼠卵巢和多囊卵巢综合征(PCOS)小鼠卵巢组织中的差异表达,阐明CaMKⅡ对PCOS小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法：用蓖麻油溶解脱氢表雄酮(DHEA)皮下注射诱导PCOS小鼠模型(PCOS组),对照组小鼠注射等体积蓖麻油,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测2组小鼠血清中睾酮水平,阴道涂片监测2组小鼠发情周期变化,HE染色观察2组小鼠卵巢组织病理形态表现,免疫荧光染色法检测2组小鼠卵巢组织中CaMKⅡ蛋白定位和荧光强度,Western blotting法检测2组小鼠卵巢组织中CaMKⅡ和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (Caspase-3)蛋白表达水平。采用短发夹RNA (sh-RNA)-CaMKⅡ慢病毒转染人卵巢颗粒细胞(KGN细胞)建立稳转体系,分为空白对照组、 sh-CaMKⅡ-1组和sh-CaMKⅡ-2组,Western blotting法检测各组KGN细胞中CaMKⅡ和Caspase-3蛋白表达水平。结果：与对照组比较,PCOS组小鼠血清中总睾酮和游离睾酮水平明显升高(P<0.01),发情周期紊乱,停滞于发...     

钙/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ与阿尔茨海默病

钙／钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ(calcium/calmodulin—dependent protein kinase-Ⅱ，CaMKⅡ)是一种多功能蛋白激酶，存在于多种动物细胞内，尤其在神经组织中含量丰富。研究表明：CaMKⅡ广泛参与基因转录调节、骨架蛋白磷酸化，其活性异常可能是阿尔茨海默病的发病机制之一。     

心肌细胞核Ca~(2+)-ATP酶活性特征的研究

目的：观察心肌细胞核钙泵活性特征及核蛋白磷酸化对其活性的影响。方法：在密度梯度离心纯化的离体家兔心肌细胞核上进行实验，采用酶学方法测定Ca2+ATP酶活性。结果：心肌细胞核上存在Ca2+－ATPase，其活性具有〔Ca2+〕和〔ATP〕依赖性。蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶M（PKM）依赖的核蛋白磷酸化能显著抑制心肌细胞核Ca2+－ATPase活性，Vmax分别降低46％和44％，而Km分别降低47％和78％（P＜0.01）。结论：家兔心肌细胞核上存在高亲和力的钙泵，其活性受蛋白磷酸化调节，其生理和病理意义有待进一步探讨。     

牛心肌肌钙蛋白Ⅰ的纯化及鉴定

目的：提取和纯化牛心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)。方法：心室肌经匀浆、离心、盐析提取、CM Sephadex C-50柱层析、DEAE SephadexA-50柱层析，获得牛cTnⅠ。结果：从100g湿重牛心肌中获得15mg牛cTnⅠ，SDS—PAGE示牛cTnⅠ相对分子质量约为27ku，纯度约为90％，Western印迹证实纯化的牛cTnⅠ可被抗人cTnⅠ单克隆抗体识别。结论：实验从牛心肌中成功制备cTnⅠ。     

CaMKⅡ信号通路在神经肽Y诱导心肌细胞肥大中的作用

目的：探讨钙离子／钙调蛋白（Ca^2＋／CaM）依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号通路在神经肽Y（NPY）诱导下心肌细胞肥大的作用。方法：原代培养SD乳鼠心肌细胞，将细胞分为5组，NPY组：培养液中加入终浓度为100nmol／L的NPY：KN-931组、KN-935组和KN-9310组除加入100nmol／L的NPY外，分别加入CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93，终浓度为1μmol／L、5μmol／L和10μmol／L；对照组：培养液中不加任何刺激药品。加药24h后采用 ^3H-亮氨酸（Leu）掺入法测定各组心肌细胞蛋白质合成速率，Western blotting测定对照组与NPY组心肌细胞的CaMKⅡδ蛋白表达。结果：经100nmol／L NPY刺激24h后，可明显增加心肌细胞^3H-Leu掺入量（p〈0．05），KN-93（1-10μmol／L）可以抑制NPY刺激的心肌细胞^3H-Leu掺入量的增加，并呈剂量依赖性（P均〈0．05）；100nmol／L NPY明显增加心肌细胞内CaMKⅡδ蛋白的表达（P〈（0．05）。结论：Ca^2＋／CaM依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信号途径参与NPY诱导的大鼠心肌细胞肥大反应。     

CaMKⅡ翻译后修饰在心血管疾病中的作用研究进展

钙离子(Ca~(2+))信号转导途径对维持心血管系统稳态及功能有重要作用。Ca~(2+)-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)功能繁多且在心血管系统表达丰富,参与调控多种病理生理过程,包括兴奋收缩偶联、兴奋转录偶联、心力衰竭及心律失常等。CaMKⅡ活化可分为经典的Ca~(2+)-钙调蛋白依赖性活化及翻译后修饰(PTMs)。目前已发现的PTMs主要包括氧化应激、亚硝基化、O-连接糖基化、相互作用蛋白等,不同PTMs在急性冠状动脉综合征、缺血再灌注损伤、心力衰竭、心律失常等心血管模型中均发挥重要作用。     

侧脑室注射神经节苷脂钠对脑瘫模型大鼠学习记忆能力的影响

目的 探讨神经节苷脂钠(GM)侧脑室注射对脑瘫模型大鼠学习记忆能力的机制,为临床治疗脑瘫提供理论依据.方法 将36只SPF级SD大鼠随机分为对照组、模型组和GM组.模型组和GM组大鼠通过切除大脑皮质及部分脑组织建模.成模后1d、10d、20 d、30 d用大鼠脑定位仪经大鼠侧脑室注射GM给药.在成模后和未次给药后用水迷宫仪进行空间探索实验、定位航行、悬吊、斜坡等实验,比较大鼠学习记忆能力及运动能力改变,并采用ELISA测定脑海马区乙酰胆碱(Ach)及眶静脉血乙酰胆碱脂酶(AChE)活性;脑组织液钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)及钙调蛋白(CaM).结果 与模型组比较,GM组大鼠治疗后找到平台时间及斜坡实验时间显著缩短;悬吊时间、第一象限和中环停留时间明显延长;定位航行中潜伏期、游泳距离缩短,脑海马区Ach含量降低、AChE活性增强;脑组织液CaMKⅡ及CaM增高(P＜0.05).结论 GM可明显抑制脑瘫模型大鼠脑组织液CaMKⅡ和CaM合成,降低神经细胞钙蛋白水解和钙内流,并通过阻断CaMKⅡ这一信号传导通路,提高AChE活性,抑制Ach释放来降低大鼠因脑缺血缺氧对中枢神经造成的损伤,使受损脑神经纤维修复和再生,进而促进中枢神经纤维功能恢复来提高学习记忆能力.     

慢性心房颤动对人心房肌钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ表达的影响

目的探讨慢性心房颤动对人心房肌细胞内游离Ca2 浓度、心房肌组织钙调蛋白(calmodulin,CaM)及钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)表达的影响。方法用激光共聚焦显微镜技术,对急性分离的慢性风湿性心脏病伴慢性房颤或窦性心律患者的心房肌细胞内游离Ca2 浓度进行测定,同时用West-ern blot法检测心房肌组织CaM及CaMKⅡ表达的变化。结果慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌细胞内游离Ca2 浓度显著高于窦性心律患者[(276.38±38.12)nmol/Lvs(122.28±45.63)nmol/L,(P<0.05)]。慢性风湿性心脏病伴慢性房颤患者心房肌CaM及CaMKⅡ的表达明显强于窦性心律患者。结论慢性房颤患者心房肌细胞内存在钙超载,Ca2 /CaMKⅡ通路可能是慢性房颤心房肌的信号转导途径之一。     

有机磷类杀虫剂存在其他作用靶分子

目的：研究有机磷类杀虫剂对大鼠脑G蛋白偶联受体激酶2介导的毒蕈碱乙酰胆碱m2受体磷酸化的影响,揭示有机磷类杀虫剂存在的其他作用靶分子或作用途径.方法：制备亲和层析柱;利用亲和层析方法从大鼠脑中纯化毒蕈碱乙酰胆碱m2受体;将纯化的毒蕈碱乙酰胆碱m2受体或β-肾上腺素受体,G蛋白偶联受体激酶-2,[γ-p32]ATP与对氧磷（PO）、氧毒死蜱（CPO）共同保温,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,放射性自显影检测m2受体磷酸化结果.结果：氧毒死蜱完全抑制大鼠脑m2受体的磷酸化,其半数抑制浓度为（IC50）70μmol/L;对氧磷不抑制m2受体的磷酸化;氧毒死蜱和对氧磷都不抑制β-肾上腺素受体的磷酸化.结论：氧毒死蜱有选择性地抑制大鼠脑m2受体的磷酸化,说明某些有机磷杀虫剂的毒性作用存在其他靶分子或作用途径.