从T7 噬菌体展示cDNA 文库筛选生殖支原体黏附蛋白的互作蛋白

目的：从人尿道上皮细胞（SV-HUC-1）T7噬菌体展示cDNA文库筛选生殖支原体黏附蛋白（MgPa）的互作蛋白。方法：以原核表达、纯化的重组生殖支原体黏附蛋白（rMgPa）为靶分子，对人尿道上皮细胞T7噬菌体展示cDNA文库进行4轮生物淘选，采用T7特异性引物扩增阳性克隆的插入片段，PCR产物测序后进行BLAST分析，间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot检测阳性噬菌体与rMgPa的特异结合。结果：经过4轮生物淘选，噬菌体克隆富集明显；DNA测序后经BLAST比对分析，结果表明随机挑取的32个阳性克隆包括7种不同序列，其中以RPL35重复次数最多；间接ELISA、斑点免疫印迹和Far-western blot结果表明7个代表性噬菌体均能与rMgPa特异结合。结论：60S核糖体蛋白L35（RPL35）可能是MgPa的互作蛋白，为深入了解MgPa的生物学功能以及生殖支原体的致病机制奠定了实验基础。     

基于人HMGB1-B box的抑制性小肽筛选及其抗炎功能分析

目的 从噬菌体构象型7肽库中筛选人HMGB1-B box的抑制性小肽.方法 以重组人HMGB1-B box为靶分子对噬菌体构象型7肽库进行6轮亲和筛选,获得B box结合的克隆,并经ELISA验证.选取亲和力高的克隆进行DNA测序,并推导出呈现的多肽序列,通过IL-6 ELISA检测噬菌体呈现的小肽对人HMGB1-B box致炎功能的抑制作用.结果 经过6轮亲和筛选,噬菌体的回收率增加,阳性克隆得到富集.挑选15个结合力强的克隆进行测序,推导出2个多肽序列.所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制人HMGB1-B box刺激THP-1细胞产生炎症因子的能力.结论 获得了噬菌体呈现的能够抑制人HMGB1-B box的两个小肽.     

结核分枝杆菌抗原模拟肽的筛选和鉴定

目的 应用噬菌体随机12肽库免疫淘筛结核分枝杆菌抗原模拟肽.方法 以结核患者血清IgG为靶分子,3轮淘筛噬菌体随机12肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆,并进行测序分析.选择高频出现的阳性克隆用ELISA法初步分析其诊断能力.结果 经3轮免疫筛选,噬菌体得到有效富集,12个阳性噬菌体克隆经测序分析获得6种短肽序列.高频出现的两个阳性克隆诊断结核病的敏感性分别为71.4％ (A2)和55.4％ (A7).结论 结核患者血清IgG筛选噬菌体随机12肽库获得了能结合抗结核抗体的噬菌体展示短肽.     

EB病毒潜伏膜蛋白1羧基端活化区域2蛋白特异性结合短肽的筛选

目的 利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒潜伏膜蛋白1(LMPl)羧基端活化区域(CTAR)2蛋白特异性结合的短肽.方法 用纯化的CTAR2蛋白筛选噬菌体12肽库.通过夹心ELISA方法分析噬菌体克隆与CTAR2蛋白的亲和力.利用硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析.结果 CTAR2蛋白对噬菌体12肽库进行3轮筛选,第3轮的产率是第1轮的143倍[(3.0×10-6)/(2.1×10-8)],噬菌体克隆得到较好的富集.ELISA方法提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR2蛋白高效结合.硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％.测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列:GLKHHSPGLLLY.结论 筛选出与CTAR2蛋白特异性结合的短肽序列GLKHHSPGLLLY,为研究LMP1致瘤机制和开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物提供实验依据.     

麻痹性贝类毒素GTX2,3模拟表位的初步研究

目的:利用噬菌体展示随机肽库筛选可模拟麻痹性贝类毒素GTX2,3抗原表位的噬菌体,初步鉴定人工合成的GTX2,3抗原表位肽的特异性。方法:以抗麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体(mAb)为靶分子,对噬菌体随机12肽库进行3轮免疫亲和筛选,以夹心ELISA方法鉴定噬菌体克隆,竞争ELISA鉴定阳性噬菌体克隆的特异性。对阳性克隆进行DNA测序并推导噬菌体所展示的氨基酸序列。竞争ELISA鉴定模拟GTX2,3表位的合成肽的特异性。结果:经过3轮筛选获得20株能与靶分子高亲和力结合的阳性噬菌体克隆。序列分析表明DXLXPP为保守序列(X为任意氨基酸)。竞争ELISA检测表明,麻痹性贝类毒素GTX2,3可抑制阳性噬菌体克隆phage2与抗GTX2,3mAb结合。根据阳性序列合成的短肽可以抑制phage2与抗GTX2,3mAb的结合(IC50=13μg/mL)。结论:通过噬菌体肽库筛选技术,成功地获得麻痹性贝类毒素GTX2,3的模拟表位,并初步证实以此为基础合成的短肽能够准确和特异的模拟GTX2,3的表位。     

利用人源化噬菌体抗体库筛选骨唾液酸蛋白的单链抗体

目的:从人源化噬菌体抗体库中筛选高亲和、特异结合人骨唾液酸蛋白(BsP)的人源可变区单链抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示系统,以重组的BSP蛋白为包被抗原,从噬菌体可变区scFv中筛选特异性结合BSP的小分子scFv,经过3轮亲和富集筛选后,再用ELISA方法进一步鉴定与抗原BSP有特异结合活性的scFv阳性克隆,PCR扩增鉴定阳性克隆的插入轻、重链基因片段,并对阳性scFv分子测序和序列分析.结果:筛选得到的scFv片段可以特异地结合BSP蛋白,PCR扩增都得到了长为368 bp、527 bp和935bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段,测序结果分析发现上述scFv片段在轻链有11处的氨基酸组成不同,在重链区域氨基酸组成则有3处不同.基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征.结论:利用噬菌体抗体库技术成功获得BSP蛋白的特异性人源单链可变区抗体.     

噬菌体随机肽库筛选动脉粥样硬化相关多肽

目的 利用噬菌体展示技术筛选动脉粥样硬化疾病相关多肽,并验证所筛选的阳性噬菌体以及合成蛋白片段结合活性.方法 以动脉粥样硬化患者血清为靶分子,噬菌体12肽库亲和筛选与之结合的阳性噬菌体.经过3轮筛选,从滴度测定平板上随机挑取10个阳性克隆,ELISA鉴定其亲和性.提取阳性噬菌体单链DNA并测序得到12肽序列,通过生物信息学查找相似天然蛋白,合成24肽,最后鉴定其结合活性.结果 ELISA显示阳性噬菌体均与患者血清有较强的结合力,序列为GPRPPSAPNMPL,合成24肽也呈现出较高的结合活性.结论 噬菌体展示可以获得动脉粥样硬化相关多肽序列,为该病的免疫研究奠定了基础.     

EB病毒LMP1 CTAR23蛋白特异性结合短肽的筛选

目的利用噬菌体12肽库筛选能与EB病毒（EBV）LMP1 CTAR23蛋白高效结合的短肽。方法利用亲和层析柱加酶切的方法纯化CTAR23蛋白．并用其筛选噬菌体12肽库。通过夹心ELISA法分析噬菌体克隆与CTAR23蛋白的亲和力。通过硝酸纤维膜斑点印迹法进行阳性克隆鉴定,并对阳性克隆进行测序及序列分析。结果对12肽库进行3轮筛选后,噬菌体克隆具有良好的富集效果。ELISA提示筛选出来的噬菌体克隆能与CTAR23蛋白高效结合。硝酸纤维膜斑点印迹法证实阳性率达到100％,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列HVSLHKHYPTAS。结论噬菌体短肽HVSLHKHYPTAS为研究LMP1致瘤机理、开发拮抗LMP1蛋白的小分子短肽类药物奠定坚实的基础。     

噬菌体随机肽库中乳腺癌肿瘤标志物的筛选

目的:利用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的肿瘤标志物。方法:以混合乳腺癌患者血清IgG作为筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选;3轮淘选后,应用常规ELISA鉴定噬菌体单克隆;阳性克隆经测序后,选择与乳腺癌血清结合活性最高的多个噬菌体的共有小肽序列来人工合成其相应的寡核苷酸序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,经诱导表达及纯化GST-小肽融合蛋白后,应用常规ELISA检测20例乳腺癌患者和20例正常人与GST-小肽的结合反应。结果:3轮筛选没有明显的富集现象,但获得38个可与乳腺癌患者血清反应,而不与正常人血清反应的阳性克隆。经扩大乳腺癌患者血清样本例数进一步检测后对8个结合活性始终较高的阳性克隆进行测序发现部分克隆序列相同;将其中结合活性最高的小肽序列P15与GST蛋白进行融合表达,并分别检测其与20例乳腺癌患者和正常人血清的结合反应,结果提示患者血清与GST-P15的反应明显高于正常人,差异有统计学意义(P0.01)。结论:筛选到的小肽P15可以特异结合乳腺癌患者血清中的抗体。该小肽为进一步寻找乳腺癌患者体内相应的肿瘤抗原奠定了一定的基础。     

应用噬菌体随机十二肽库筛选旋毛虫Ts87蛋白抗原表位

以抗旋毛虫Ts87蛋白单克隆抗体2A2作为靶标,对噬菌体展示随机十二肽库进行筛选.通过ELISA鉴定筛选克隆的结合特性,并对阳性克隆提取DNA进行测序分析.结果显示,经3轮生物淘洗后,目标噬菌体得到433倍富集.随机挑选20个克隆进行ELISA鉴定,其中有18个噬菌体克隆可以与单抗2A2特异性结合.测序分析发现,这18个克隆带有4种氨基酸序列,分别为:TPHPHIFYREAS、DWKAWTQMLDSY、WQIEYFrLHSLW和VSPHEYWSEL.经比对未发现这4种序列与Ts87蛋白序列有明显同源性.将这4株噬菌体克隆扩增后,经Western-blot鉴定均可被单抗2A2识别.结果表明本次筛选鉴定得到的4个噬菌体展示肽可能是旋毛虫 Ts87蛋白的模拟抗原表位.     

人67 LR噬菌体结合肽的筛选与功能分析

目的 为了获得能够与人67 ku层黏连蛋白受体(67 ku laminin receptor,67 LR)特异性结合的噬菌体呈现肽.方法 以重组人67LR蛋白为诱饵,分别对噬菌体12肽库和环7肽库进行亲和凝胶筛选,ELISA测定所筛选噬菌体克隆与靶蛋白的亲和力,经测序分析得到67 LR特异性结合噬菌体克隆,并通过293细胞侵袭转移实验测定阳性噬菌体呈现肽对67LR促细胞侵袭作用的抑制效果.结果 经4轮筛选共筛到2类新的67LR结合肽,分别具有DXCETCT(X可变)和YRPMXEY(X可变)一致序列.其中DX-CETCT噬菌体呈现肽可显著抑制67 LR所诱导的细胞侵袭,且这种抑制作用与YIGSR 5肽具有一定互补性.结论 成功筛选到2类新的67 LR结合肽,其中DXCETCT噬菌体呈现肽可针对性抑制67LR所诱导的细胞侵袭作用.     

用噬菌体肽库筛选IBDV单克隆抗体的模拟表位

目的:筛选法氏囊病毒(IBDV)单克隆抗体所针对的模拟抗原表位。方法:以纯化的3株IBDV单克隆抗体为靶分子用噬菌体12肽库筛选相应抗原模拟表位;应用间接和竞争ELISA鉴定所筛选的阳性样品;最后对与抗体高亲和结合的噬菌体进行测序分析。结果:经过四轮淘洗,随机挑取30个克隆经间接ELISA鉴定,发现其中22个克隆结合活性较高。进一步应用竞争ELISA,获得14个噬菌体克隆,其抑制率高达50%以上。对这些噬菌体进行DNA测序,并分析比对了IBDV相应序列,确定了3个抗原模拟表位。结论:通过噬菌体随机肽库成功筛选出3个IBDV模拟表位,为进一步研究IBDV抗原性质奠定了基础。     

从噬菌体构象型7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽

目的 :从噬菌体构象型 7肽库中筛选BLyS的抑制性短肽。方法 :用重组人BLyS筛选噬菌体构象型 7肽库 ,用间接ELISA、竞争ELISA和细胞增殖活性试验鉴定噬菌体克隆。结果 :经过 3轮亲和筛选 ,噬菌体的回收率增加 ,阳性克隆得到富集。所获两个阳性噬菌体克隆能特异性地抑制BLyS刺激细胞增殖的活性。结论 :获得了噬菌体呈现的能够抑制BLyS的两个短肽。     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标记的人高迁移率族蛋白B1(HMGB1)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni2+-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍(第4轮与第1轮回收量分别为5.2×108、7.0×106 pfu),随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

人高迁移率族蛋白B1原核表达及其高亲和噬菌体融合肽的筛选

目的 构建谷胱甘肽巯基转移酶（GST）标记的人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达.应用噬菌体展示技术筛选HMGB1的高亲和肽.方法 用RT-PCR方法扩增HMGB1 cDNA,构建于原核表达载体pGEX4T-1并转化大肠杆菌,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GST-HMGB1蛋白表达;Ni^2＋-NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化重组HMGB1蛋白.以重组HMGB1蛋白为靶分子,进行4轮噬菌体展示环七肽库的筛选,从第4轮洗脱物中随机挑选20个单克隆噬菌体扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定450 nm处的吸光度值.对获得的阳性单克隆噬菌体分别进行扩增、纯化,并对DNA测序,以确定插入七肽的氨基酸序列.结果 RT-PCR扩增HMGB1 cDNA大小约648 bp,成功构建了pGEX4T-1-HMGB1重组质粒并纯化了HMGB1蛋白,其相对分子质量为65000.经过4轮筛选后,噬菌体富集了74倍（第4轮与第1轮回收量分别为5.2×10^8、7.0×10^6 pfu）,随机挑取的20个噬菌体克隆中9个可与HMGB1结合,测序发现其中的6个序列一致,均为DYFVSSV.结论 筛选到1个可与HMGB1高亲和结合的噬菌体展示七肽,其对HMGB1活性的拮抗效应有待进一步阐明.     

C1q结合十二肽的筛选与初步鉴定

目的　从噬菌体十二肽库中筛选结合C1q的短肽并进行初步鉴定。方法　以C1q为钓饵蛋白筛选噬菌体十二肽库 ,利用ELISA、U937细胞配体结合抑制试验、多聚IgG(AIgG)竞争抑制试验鉴定阳性克隆 ,再进行单链DNA测序和分析。结果　经 3轮筛选后 ,随机挑选 2 5个噬菌体克隆做ELISA鉴定 ,14个克隆显示与C1q有较强的结合。经过U937细胞配体结合抑制试验和AIgG竞争抑制试验鉴定后 ,将此 14个阳性克隆测序 ,从其展示肽DNA测序结果推导氨基酸序列 ,获得 9条氨基酸序列 :HWDPFSLSAYFP、WTPVRTNPFLLH、NGHLFSLSAYFP、RTQRNSPFFLCP、SPAFHPEHMGRG、SRAFHPFYRGRA、WYEGPFTLQTWP、LTQHNSPFFLLP和TSNPFFLWYPQP。结论　获得结合C1q的一些抑制性短肽 ,它们可能成为抑制补体经典途径激活的肽类先导化合物     

用强直性脊柱炎患者血清筛选噬菌体随机肽库

目的:用纯化的强直性脊柱炎患者血清IgG从噬菌体随机12肽库中免疫筛选出能与强直性脊柱炎患者血清特异性结合的抗原模拟肽.方法:首先用正常人纯化血清免疫球蛋白IgG作为固相配基吸附非特异性噬菌体,然后以纯化强直性脊柱炎患者血清免疫球蛋白IgG包被,按吸附-洗脱-扩增的淘洗过程对上述处理过的噬菌体液进行3轮筛选,随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性,并对部分克隆进行测序.用ELISA方法初步观察阳性克隆的诊断价值.结果:3轮筛选的投入产出比逐轮升高,提示具有良好的富集效果.对从第3轮洗脱物中挑选出的20个克隆进行结合试验,发现17个克隆与强直性脊柱炎患者纯化血清IgG特异性结合.其中7个克隆测序表明,7个克隆源于同一克隆,其外源插入肽为LALPPLAPNHHH.该阳性克隆对50例强直性脊柱炎患者血清的检出率为92.0%,但该克隆对正常人血清亦有14.0%的阳性率.结论:用纯化的强直性脊柱炎患者血清IgG从噬菌体随机12肽库中筛选到具有一定生物学功能的抗原模拟肽.     

SLE患者血清中病原体相关噬菌体7肽的检测

目的用噬菌体7肽库筛选系统性红斑狼疮（SLE）患者血清特异性抗体,测序分析其实际意义。方法先用30例正常人混合血清与噬菌体7肽库反应,未与正常人白清结合的7肽再与30例SLE患者混合血清结合,获得SLE血清特异性结合的噬菌体克隆。用患者混合血清进行Dot—ELISA实验鉴定获得的噬菌体克隆,进一步用SLE患者及正常人血清各12例筛选阳性噬菌体的混合克隆,确定阳性噬菌体克隆与个体血清之间的结合情况,并对最终鉴定的噬菌体克隆进行测序与比对分析。结果混合的阳性噬菌体克隆与SLE患者个体血清反应阳性率明显高于其与正常人血清的反应率;序列分析显示阳性噬菌体克隆的抗原表位与杆菌、球菌、弧菌等微生物有同源性,与裂殖酵母属、链球菌属、立克次（氏）体属等有100％同源性,与人类抗原表位无关。结论SLE患者血清中存在与病原体抗原表位结合的抗体成分,提示SLE可能与病原体感染有关。     

利用噬菌体随机肽库筛选IL-5结合的相关多肽

目的：采用噬菌体随机肽库筛选人IL-5，以获得能高亲和力结合IL-5的相关多肽。方法：以重组人IL-5作为筛选分子，应用M13噬菌体PⅢ呈现随机7肽库进行筛选。经过三轮淘筛后，经夹心ELISA、竞争ELISA法进一步鉴定噬菌体克隆与IL-5的亲和力，对阳性克隆进行了扩增和DNA测序，据此推导结合随机多肽的氨基酸序列。结果：经鉴定得到9个阳性噬菌体克隆能与IL-5呈高亲和力结合。通过测序和序列比较分析，发现CX1-2AS为相对保守的结合表位。结论：研究表明通过噬菌体肽库能够筛选到IL-5结合的相关多肽，为进一步研究IL-5结合表位及抑制剂奠定了基础。     

CCR9亲和短肽的筛选及其结合活性的鉴定

目的获取与CC趋化因子受体9(CCR9)具有亲和力的特定短肽。方法以CCR9的第2个胞外环为靶蛋白,反复筛选Ph.D.-12噬菌体展示肽库获得阳性克隆,通过ELISA测定噬菌体阳性克隆短肽与CCR9的亲和力,共聚焦显微镜检测短肽与CCR9高表达细胞MOLT4结合能力。结果经过3轮淘选、富集,确定了8个噬菌体克隆有插入序列,其中克隆C-4与靶蛋白具有较高亲和力,表达的短肽P1(VHWDFRQWWQPS)可抑制相应C-4克隆与靶蛋白的结合,并可与CCR9高表达的MOLT4细胞结合。结论通过噬菌体肽库筛选出了能与细胞表面分子CCR9结合的短肽序列VHWDFRQWWQPS。