RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

shRNA沉默β-catenin基因表达对人食管癌细胞生物学特性的影响

目的 构建稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞克隆,观察shRNA介导的β-catenin基因沉默对人食管癌细胞生物学特性的影响,为以β-catenin为靶的食管癌基因治疗提供理论和实验依据.方法 通过细菌转化、酶切、测序鉴定和基因重组等方法构建针对β-catenin的RNA干扰质粒pGen-3-CTNNB1和阴性对照质粒pGen-3-con.利用脂质体介导转染技术转染人食管癌细胞系Eca-109,经G418筛选得到稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞模型(pGen-3-CTNNB1细胞);逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫荧光和Western blot检测RNA干扰组(pGen-3-CTNNB1)、阴性对照组(pGen-3-con)及未转染组(Eca-109)3组细胞中β-catenin的表达;建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察抑制β-catenin表达在活体内对肿瘤细胞生长能力的影响,免疫组织化学检测移植瘤组织中β-catenin的表达水平;体外浸润实验、迁移实验检测各组细胞的侵袭转移能力.结果 成功构建了针对β-catenin基因的RNA干扰载体pGen-3-CTNNB1,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型;与阴性对照组[(1.18±0.13)g]和未转染组[(1.38±0.21)g]比较,RNA干扰组[(0.42±0.09)g]移植瘤重量明显减轻(P＜0.05);瘤组织中β-catenin的表达水平明显降低;抑制β-catenin基因表达后,食管癌细胞的浸润能力显著降低,阴性对照组浸润细胞数为(81±5)个/HPF、未转染组为(77±6)个/HPF、RNA干扰组为(41±4)个/HPF(P＜0.01);迁移能力也显著下降,阴性对照组迁移细胞数为(73±5)个/HPF、未转染组为(69±5)个/HPF、RNA干扰组为(38±4)个/HPF(P＜0.05).结论 在人食管癌细胞Eca-109中存在β-catenin表达异常和Wnt信号通路的异常激活,抑制β-catenin基因的表达可以在裸鼠体内显著抑制食管癌细胞的生长,并降低其侵袭转移的能力.     

siRNA特异性抑制卵巢癌细胞葡萄糖调节蛋白78表达及其意义的研究

目的研究利用小分子干扰技术（RNAi）,构建Grp78靶向RNA干扰质粒载体,观察其对人类卵巢癌细胞SKOV3Grp78基因表达的抑制作用。初步探讨RNA干扰技术抑制Grp78的表达作为卵巢癌基因治疗的可行性。方法从GeneBank中选取人类卵巢癌细胞Grp78基因序列,采用siRNA Target Designer-Version 1.51设计软件设计Grp78基因发卡寡核苷酸,序列符合siRNA表达载体psiSTRIKETMU6的要求并与psiSTRIKETM质粒载体连接,采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp78 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp78导入卵巢癌细胞系SKOV3中,分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR和Western blot检测Grp78 mRNA及蛋白水平的表达情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度紫杉醇处理后的细胞存活率。结果成功构建RNA干扰质粒载体,靶向Grp78 RNA干扰质粒载体命名为psiSTRIKETM/Grp78。将上述质粒转染到卵巢癌细胞后,观察到psiSTRIKETM/Grp78能够有效的抑制Grp78 mRNA及蛋白表达。转染psiSTRIKETM/Grp78基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制,出现凋亡征象,且对化疗药物的敏感性增加。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp78能明显抑制Grp78 mRNA及蛋白的表达,增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi技术抑制Grp78表达为卵巢癌的基因治疗开辟了新的思路。     

体外转染KISS-1基因对食管鳞癌细胞EC-1侵袭及增殖能力的影响

目的 观察KISS-1基因对食管鳞癌细胞EC-1侵袭及增殖能力的影响,探讨KISS-1基因与食管鳞癌生物学行为的关系.方法 检测KISS-1在EC-1、Eca109、EC9706和TE-1四种食管癌细胞株中的表达;利用脂质体介导在体外将KISS-1基因转染人食管鳞癌细胞EC-1,利用Western blot和RT-PCR方法检测转染之后KISS-1表达的改变,并采用Boyden小室体外侵袭实验及MTT、软琼脂克隆形成实验,观察KISS-1对食管鳞癌细胞侵袭及增殖能力的影响.结果 4种食管癌细胞株的Western blot和RT-PCR检测结果显示:EC-1中KISS-1蛋白(0.715±0.109)及mRNA(0.670±0.176)表达均最低;转染之后Western blot和RT-PCR结果显示:KISSS-1蛋白和mRNA在转基因组的表达分别为1.143±0.218和0.877±0.162,均显著高于转空质粒组(0.745±0.130,0.685±0.128;t=3.850,2.481,P均<0.05)和对照组EC-1细胞(0.855±0.184,0.677±0.138;t=2.275,2.306,P均<0.05);Boyden小室检测细胞体外侵袭力实验发现转基因组在培养24、48和72 h后的穿膜细胞数分别为91.8±11.7,117.8±11.1和139.2±11.8,均显著低于转空质粒组(118.1±14.7,141.7±13.2,162.2±22.7;t=3.153,4.215,3.569,P值均<0.01)和对照组EC-1细胞(112.2±15.6,138.1±13.0,162.3±14.0;t=4.154,3.797,2.702,P值均<0.05).MTT检测结果显示,转基因组细胞在培养48 h和72 h后的增殖能力分别为0.517±0.127和0.394±0.137,与转空质粒组(0.636±0.186,0.513±0.150;t=2.054,2.709,P值均<0.05)和对照组(0.646±0.135,0.511±0.153;t=2.276,2.205,P值均<0.05)相比,细胞生长受到明显抑制;克隆形成实验结果显示,转基因组细胞的克隆形成数为157.2±36.4,明显低于转空质粒组(236.3±78.1;t=3.441,P<0.01)和对照组(242.5±48.6;t=2.250,P<0.05).结论 KISS-1基因在食管癌细胞株EC-1中可抑制细胞的体外侵袭能力及细胞的增殖能力.     

干扰HDAC1通过调控STAT3信号通路影响皮肤鳞癌细胞凋亡

目的:探讨干扰组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)对皮肤鳞癌细胞凋亡的影响。方法:皮肤鳞癌细胞A431分别转染HDAC1小干扰RNA(HDAC1 si RNA)和小干扰RNA阴性对照(si RNA NC),RT-PCR和Western blot检测转染后细胞中HDAC1的表达水平,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测信号转导及转录激活因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)和cleaved caspase-3的蛋白水平。同时用STAT3信号通路抑制剂作用于转染HDAC1 si RNA的A431细胞,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测STAT3、p-STAT3和cleaved caspase-3的蛋白水平。结果:HDAC1 si RNA能够抑制A431细胞中HDAC1的m RNA和蛋白表达。干扰HDAC1表达后细胞活力和细胞中p-STAT3水平下降,而细胞凋亡率和细胞中cleaved caspase-3水平升高。STAT3信号通路抑制剂作用后,转染HDAC1 si RNA的A431细胞活力及p-STAT3水平下降,细胞凋亡率及细胞中cleaved caspase-3水平升高。结论:干扰HDAC1表达可能通过调控STAT3信号通路抑制皮肤鳞癌细胞活力,促进皮肤鳞癌细胞凋亡。     

SiRNA沉默JAB1表达抑制肝癌细胞增殖

 目的 观察沉默Jab1基因表达对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响。方法 利用RNA干扰技术构建PAVU6-JAB1 siRNA干扰质粒,将其转染HepG-2细胞,采用Real-time PCR、Western blot等方法对Jab1表达进行检测,WST-8、流式细胞分析对细胞增殖的影响。结果 成功构建PAVU6- JAB1 siRNA干扰质粒,转染HepG-2细胞后Jab1蛋白表达量较对照组明显降低,P27kip1蛋白表达量明显升高 (P<0.01)。转染96 h后能显著抑制细胞增殖活性,由空载体转染组的99.6%?1.4%降至70.8%?1.6%。结论 构建靶向Jab1基因的干扰质粒能下调Jab1基因的表达,上调P27kip1蛋白水平,并抑制HepG-2细胞在体外的增殖活性。     

shRNA干扰PLCε1基因对人食管癌Eca109细胞增殖和细胞周期的影响

目的探讨沉默PLCε1基因对食管癌Eca109细胞增殖和细胞周期的影响及其可能的机制。方法 PLCε11、PLCε12和PLCε13质粒表达载体用于沉默PLCε1,通用阴性对照质粒表达载体HK作为对照。用阳离子脂质体进行转染,筛选出干扰效果最好的质粒表达载体(PLCε12)。实验分为Eca109组、HK组和PLCε12组。MTT检测细胞的存活率。FCM检测细胞周期,RT-PCR检测细胞P16、Cyclin D1基因mRNA表达。结果 HK、PLCε12质粒表达载体转染Eca109细胞后48和72 h,PLCε12组Eca109细胞的存活率分别为80.73%和75.88%,显著低于HK组(P0.001)。Eca109细胞转染后24 h,PLCε12组处于S期的细胞比例明显低于HK组(P0.01),细胞周期阻滞于G0/G1期。质粒表达载体转染Eca109细胞48 h后,PLCε12组Eca109细胞P16基因mRNA表达水平明显高于HK组(P0.01)。结论沉默PLCε1基因可能通过上调Eca109细胞P16基因的表达,阻止细胞周期从G1期向S期的过渡,抑制Eca109细胞的增殖活性。     

靶向VEGF的shRNA对皮肤鳞癌A431细胞的作用

 目的 构建靶向VEGF的shRNA（psilencer-VEGF1-shRNA,VEGF-s1;psilencer-VEGF2-shRNA,VEGF-s2）干预皮肤鳞癌细胞（A431）的一系列生物学行为,探讨VEGF-s1和VEGF-s2干预作用的意义。方法 构建psVEGF-shRNA真核表达质粒干预体外培养的A431细胞, 同时构建含随机靶序列的阴性对照表达质粒(psilencer-Target-off-shrank,T-off)。RT-QPCR,western blot 和ELISA检测细胞内VEGFmRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8法检测细胞活性;流式细胞仪检测癌细胞增殖周期细胞百分比与细胞凋亡;划痕试验和Transwell小室试验别检测癌细胞二维和三维空间的迁移能力;FN黏附试验检测癌细胞的黏附潜能。结果 A431细胞转染psVEGF-shrank后活性降低,细胞周期发生阻滞,与对照组相比细胞在G1期比率显著增加(P<0.05),在S期比率明显降低,细胞调亡增加(均P<0.05),细胞内VEGFmRNA和蛋白表达水平下降,细胞迁移和黏附潜能均受到抑制。结论 VEGF是人皮肤鳞癌细胞生长相关的重要基因,干扰VEGF基因能有效抑制人皮肤鳞癌细胞的生物学行为。     

shRNA沉默HBx下调HepG2.2.15细胞基质金属蛋白酶2的表达

目的探讨HBx小发夹RNA(shRNA)对HepG2.2.15细胞中基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达的影响。方法采用psiHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞,反转录PCR评估沉默效率;MTT法检测转染后HepG2.2.15细胞增殖情况;实时定量PCR(qRT-PCR)检测MMP-2 mRNA表达;Western blot法检测MMP-2蛋白表达的变化。结果反转录PCR检测HBx基因的沉默效率为53.6%;MTT检测结果显示转染24、48、72 h后HepG2.2.15细胞的增殖受抑制,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);psiHBV/X质粒转染HepG2.2.15细胞后,qRT-PCR和Western blot检测结果显示,HepG2.2.15细胞中MMP-2基因的mRNA水平和蛋白水平表达分别有不同程度的下调,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论 RNA干扰技术抑制HepG2.2.15细胞中HBx基因的表达,可抑制细胞增殖,下调HepG2.2.15细胞中MMP-2的表达。     

FAM3C通过激活Akt促进口腔鳞癌细胞活力

目的:探讨FAM3C (family with sequence similarity 3, member C)蛋白在口腔鳞癌细胞中的表达和作用。方法:通过RT-qPCR及Western blot法检测人口腔鳞癌癌前病变细胞DOK和口腔鳞癌细胞WSU-HN6中FAM3C的mRNA及蛋白表达水平。在WSU-HN6细胞中分别使用siFAM3C和抗FAM3C抗体处理,在DOK细胞中使用腺病毒过表达FAM3C,分别在处理后24、48和72 h使用CCK-8和Western blot法检测FAM3C对细胞活力及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)激活的影响。结果:(1)与DOK细胞相比,WSU-HN6细胞中FAM3C的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P0.05);(2)siFAM3C在转染后48 h和72 h均可抑制WSU-HN6细胞的活力(P0.05),同时抑制Akt的激活(P0.05);(3)抗体封闭FAM3C蛋白48 h和72 h也能抑制WSU-HN6细胞的活力,并抑制Akt的激活(P0.05);(4)过表达FAM3C 48 h和72 h可促进DOK细胞的活力,并激活Akt(P0.05)。结论:FAM3C可能通过激活Akt促进口腔鳞癌细胞的活力。     

RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响

背景：最近的研究发现,一些因子在失神经骨骼肌萎缩的过程中发挥关键性作用,其中“feak-headbox”(Foxo)转录因子是调控骨骼肌萎缩最关键的分子。 目的：探讨RNA干扰技术体外抑制FOXO3a基因表达的效果。 方法：6孔细胞培养板中培养大鼠成肌细胞系L6,使用pEGFP-N1与siRNA重组质粒等比例在Lipofectamine2000介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将2 μg FOXO3a基因siRNA重组质粒转染L6,转染48 h与72 h。 结果与结论：①pEGFP-N1与siRNA重组质粒转染后48 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率。②实时定量PCR分析结果显示,转染后48 h和72 h,干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a mRNA的抑制率与未转染对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05),转染72 h与48 h相比,抑制效应更为明显,并以FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显。③Western印迹灰度分析结果显示,转染后48 h和72 h,干扰序列FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对FOXO3a蛋白表达的抑制率与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05),转染72 h与48 h相比,抑制效应更为明显,与mRNA水平的影响一致。结果可见RNA干扰技术在体外能够明显抑制叉头蛋白转录因子FOXO3a基因的表达,FOXO3a基因siRNA重组质粒转染其干扰序列对FOXO3a的mRNA和蛋白抑制效果尚不明确,这可为RNA干扰介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供一种新的思路。     

下调DPT基因通过调节CyclinD1抑制食道癌细胞的增殖

目的观察皮肤桥蛋白(Dermatopontin, DPT)对食道癌细胞增殖能力的影响。方法应用基因沉默技术在食道癌细胞Eca-109中下调DPT基因的表达,通过Western blot实验与免疫荧光实验评价24h、48h、72h基因沉默效率;应用克隆形成实验及MTT实验,检测下调DPT基因对食道癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期;通过Western blot实验检测CyclinD1蛋白的表达变化。结果抑制DPT基因可以下调人食道癌细胞的克隆形成与细胞增殖能力,沉默DPT基因引起食道癌细胞G 0/G1期阻滞, CyclinD1蛋白表达下调。结论 DPT参与食道癌的发病机制,是食道癌治疗的新靶点。     

小干扰RNA阻断信号转导子和转录激活子3信号对人食管鳞癌细胞株增殖的抑制作用

目的探讨信号转导子和转录激活子3（STAT3）小干扰RNA（siRNA）对食管鳞状细胞癌细胞株（EC9706和Eca109）中持续性激活STAT3信号的阻断情况及阻断STAT3信号对细胞增殖的影响。方法将化学合成的100nmol／L的STAT3 siRNA转染EC9706和Eca109细胞,逆转录聚合酶链反应检测转染前后STAT3mRNA的表达,WeStern blot检测转染前后STAT3及磷酸化STAT3（P—STAT3）蛋白的表达,凝胶电泳迁移率检测转染前后活化STAT3蛋白的核结合情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测转染前后细胞增殖能力的改变,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的改变。结果STAT3 siRNA以时间依赖方式特异性地抑制STAT3 mRNA及STAT3、P-STAT3蛋白的表达,并且STAT3蛋白的核结合活性下降,使细胞周期阻滞于G0／G1期,细胞增殖受到明显的抑制。与对照组相比EC9706细胞转染后72hG0／G1期的细胞增加了16．1％,同时S期细胞减少11．1％;Eca109细胞转染后72hG0／G1期的细胞增加了11．8％,同时S期细胞也较对照组明显减少。结论STAT3 siRNA能够特异地阻断食管鳞癌细胞中STAT3信号的持续性激活并抑制肿瘤细胞的增殖。     

富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1基因特异性RNA干扰表达载体的构建、鉴定和稳定株筛选

背景：有研究表明富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 1,LRIG1)基因在神经胶质瘤细胞中呈低表达,LRIG1基因过表达后对神经胶质瘤细胞的 LRIG1 mRNA和蛋白表达均明显增强和抑制其生物学行为,但却很少有研究从阻断LRIG1基因的表达的角度进行论证。 目的：构建针对LRIG1基因的特异性RNA干扰质粒,稳定转染人脑胶质瘤GL15细胞系,观察其对目的基因LRIG1表达的影响。 方法：根据GenBank提供的LRIG1基因序列设计2条RNA干扰序列,命名为LRIG1-shRNA1和LRIG1-shRNA2,并设计1条非特异性序列作为阴性对照,命名为pGenesil2-negative shRNA。合成各自的寡核苷酸链,退火后与pGenesil2质粒载体连接,转化扩增后测定序列。用不同浓度的G418作用于GL15细胞确定G418对GL15细胞的筛选浓度。将3种重组表达载体转染GL15细胞,G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。Western blot检测LRIG1蛋白的表达。 结果与结论：构建的重组pGenesil2-LRIG1- shRNA质粒经限制性酶切及DNA测序分析证明其序列插入正确。转染pGenesil2- LRIG1-shRNA1(LRIG11)细胞和pGenesil2- LRIG1-shRNA2(LRIG12)细胞LRIG1蛋白表达水平较阴性对照组pGenesil2-negative shRNA分别下降47.9%(P < 0.01)和32.8% (P > 0.05)。结果证实,实验成功构建了针对LRIG1基因的特异性shRNA表达载体pGenesil2-LRIG1-shRNA1,其转染GL15细胞后可抑制LRIG1的表达。     

姜黄素通过下调IκBα磷酸化抑制食管鳞癌细胞的体外增殖

目的探讨姜黄素是否能够通过下调IκBα的磷酸化而抑制食管鳞癌细胞的增殖并对其细胞周期产生影响。方法 MTT法检测姜黄素作用下食管鳞癌细胞的增殖;Western blot法检测EC9706和Eca109细胞在姜黄素作用下pIκBα和细胞周期蛋白cyclin D1的表达情况。两种细胞中加入姜黄素培养72 h,或联合5-FU培养72 h,流式细胞仪检测细胞周期。结果 EC9706和Eca109细胞的存活率均随着姜黄素浓度的增加逐渐下降;姜黄素作用下EC9706和Eca109细胞中pIκBα和cyclin D1蛋白的表达水平随着时间的延长逐渐下降,且G0/G1期的细胞开始增加,S期的细胞逐渐减少;当姜黄素联合使用5-FU时,G0/G1期的细胞明显增加,S期的细胞明显减少。结论 姜黄素通过下调IκBα及cyclin D1的表达而抑制食管鳞癌细胞的增殖,或许有望成为食管癌治疗中的一个辅助用药。     

白藜芦醇调节VEGF/Wnt/β-catenin通路对食管癌细胞的抑制作用

目的探讨白藜芦醇(Resveratrol,RES)调节VEGF/Wnt/β-catenin通路对食管癌细胞的抑制作用。方法用0、25、50、100μmol/L白藜芦醇处理食管癌KYSE150细胞株、TE-1细胞株和Eca-109细胞株培养72 h后,CCK-8法检测食管癌细胞的存活率;流式细胞仪法检测细胞凋亡和细胞周期;ELISA法检测细胞上清液中VEGF表达;Western blot法检测食管癌细胞wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平。结果白藜芦醇可以显著降低KYSE150细胞、TE-1细胞和Eca-109细胞的存活率,且随白藜芦醇的剂量升高而逐渐降低;可以显著促进KYSE150细胞、TE-1细胞和Eca-109细胞凋亡,且随白藜芦醇的剂量升高而逐渐升高;差异有统计学意义(P0.05)。白藜芦醇可以显著下调食管癌KYSE150细胞株、TE-1细胞株和Eca-109细胞株VEGF、wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达水平,且随白藜芦醇的剂量升高而逐渐降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论白藜芦醇下调VEGF/Wnt/β-catenin通路的表达来有效抑制食管癌细胞增殖作用。     

抑制食管癌STC-1基因表达对食管癌细胞凋亡、IL-1β和TNF-α表达及JAK2/STAT3信号的影响研究

目的:观察抑制食管癌斯钙素-1(STC-1)基因表达对食管癌细胞凋亡、IL-1β和TNF-α表达及JAK2/STAT3信号的影响。方法:RT-PCR及Western blot检测STC-1在人食管鳞状细胞癌KYSE170、Eca109、TE1和TE10细胞相对于正常人食管鳞状上皮细胞Het-1A的表达;将合成的STC-1的siRNA序列及无干扰作用的si NRA序列转染Eca109细胞,分别标记为STC-1-siRNA组和NC组,并设定空白对照组,收集转染48 h的细胞,RT-PCR及Western blot检测转染后的细胞中STC-1的表达; CCK8及流式细胞仪分别检测Eca109细胞活力及凋亡率; RT-PCR检测IL-1β和TNF-α表达; Western blot检测Ki67、p53、磷酸化的蛋白酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化的信号转导与转录因子3(p-STAT3)的蛋白表达。结果:与Het-1A细胞比较,STC-1在KYSE170、Eca109、TE1和TE10细胞中的mRNA及蛋白表达均显著升高(P0. 05);与对照组比较,STC-1-siRNA组STC-1的表达显著降低,细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,IL-1β、TNF-α、Ki67、p-JAK2和p-STAT3的表达均显著降低,p53的表达显著升高(P0. 05)。结论:STC-1在食管癌细胞中高表达,抑制其表达后癌细胞活力显著降低,凋亡率升高,此作用可能与抑制JAK2/STAT3信号通路及炎症因子如IL-1β和TNF-α表达有关。     

肝激酶B1通过下调细胞周期素D1抑制大肠癌细胞的体外增殖

目的:研究肝激酶B1(LKB1)基因对大肠癌细胞增殖的影响。方法:用脂质体转染法将LKB1基因表达质粒(pReceiver-LKB1)瞬时转染SW1116及SW480细胞,半定量RT-PCR及Western blot方法检测LKB1 mRNA和蛋白水平的表达;CCK8法检测SW1116及转染重组质粒的细胞体外增殖变化;半定量RT-PCR和Western blot方法检测胞内LKB1对细胞周期蛋白cyclin D1的影响。结果:转染LKB1基因后,质粒转染组LKB1表达较空质粒组及空白对照组明显升高;质粒转染组在转染后48、72、96 h时,细胞活性较空质粒组及空白对照组明显降低(P<0.01);与对照组相比,质粒转染组的细胞内cyclin D1 mRNA和蛋白的表达明显降低。结论:LKB1可抑制大肠癌细胞的体外增殖能力,并且这一抑制效应可能通过下调cyclin D1产生。     

Oct4-shRNA慢病毒载体沉默结直肠癌Oct4基因并诱导细胞凋亡的初步研究

目的:探讨Oct4-shRNA慢病毒载体对人结直肠癌SW480细胞Oct4的抑制效率及对细胞凋亡的影响.方法:构建针对Oct4的4对Oct4-shRNA干扰慢病毒载体质粒,用Oct4与GFP融合的过表达质粒分别与4个干扰质粒共转染293T细胞,采用Western blot检测GFP的表达,筛选出干扰效果最好的Oct4-shRNA慢病毒载体,用293T细胞包装后转染SW480细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测Oct4的表达情况,流式细胞仪测定细胞凋亡.结果:与转染阴性对照病毒的对照组相比,转染Oct4-shRNA慢病毒载体的SW480细胞Oct4的mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.01);细胞凋亡明显增加(P＜0.01).结论:Oct4-shRNA慢病毒载体可有效抑制SW480细胞Oct4表达,并显著增加细胞凋亡.     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.