应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱和N端测序鉴定重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）的结构

目的：应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）和N端测序方法鉴定重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF)的结构。方法：1．用Edman降解法进行N端测序。2．应用MALDI－TOF－MS测定分子量并鉴定纯度。3．通过还原、烷基化确定rhGM-CSF分子中二硫键数目。4．通过蛋白内切酶Glu-C酶切的肽质量指纹谱确证氨基酸序列并确证其中两对二硫键的配对。结果：1．测定的rhGM-CSF N端15个氨基酸序列与从cDNA推导的序列一致。2．测定的rhGM-CSF分子量与理论计算值一致。3．证明rhGM-CSF没有自由巯基,含有两对二硫键,与理论值一致。4．证明rhGM-CSF的氨基酸序列是正确的,并确证其中的两对二硫键配对正确。结论：确证重组人粒／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF)的结构是正确的,没有修饰、变异和氨基酸的丢失。应用的方法灵敏、准确、可靠。     

奥曲肽一级结构的确证

目的：对奥曲肽(人工合成8肽)的一级结构进行确证。方法：采用：HPLC法测定了奥曲肽的氨基酸组成，采用：Edman降解法测定了除苏氨醇外的7个氨基酸的序列，采用ESI—MS／MS对奥曲肽的分子量以及C—末端的苏氨醇残基进行了确证。结果：采用HPLC法测得除色氨酸以外，样品的氨基酸组成与理论值基本一致。采用Edman降解法测得除苏氨醇外其余7个氨基酸序列与理论结构一致。采用ESI—MS／MS测得样品的相对分子质量为1018．7，与理论值1019．3基本符合。对二级质谱碎片的解析确证样品C—末端确为苏氨醇残基。结论：本文对奥曲肽的C—末端苏氨醇残基以及一级结构全序列进行了确证。     

液质联用鉴定重组人血管内皮抑制素

目的：用液质联用技术鉴定重组人血管内皮抑制素（rhEndostatin）。方法：利用ESI—Q—TOF—MS法测定rhEndostatin的精确相对分子质量，通过HPLC—ESI—Q—TOF—MS／MS法测定其胰蛋白酶酶切后肽段的部分氨基酸序列并结合数据库检索进行结构鉴定。结果：重组人血管内皮抑制素的实测相对分子质量为21114．5，与理论相对分子质量21113．8相比非常接近。HPLC—ESI—Q—TOF—MS／MS测定m／z802．0的肽段的部分氨基酸序列为Ala—Pro—Ser—Ala-Thr—Gly—Gin—Ala—Ser—Ser—Leu—Leu。将其m／z和氨基酸序列在MASCOT数据库检索，结果表明重组人血管内皮抑制素的结构正确。结论：液质联用是鉴定蛋白质的灵敏、快速、准确的新方法。     

依替巴肽一级结构的确证

目的:对合成的依替巴肽一级结构进行确证。方法:采用串联质谱序列分析法测定了氨基酸序列,采用 ESI-MS/MS 对依替巴肽的相对分子质量和肽链环化结构进行了确证,采用~1 HNMR 进一步确定了依替巴肽的结构。结果:串联质谱序列分析法,证实合成肽氨基酸序列和非天然氨基酸结构正确;ESI-MS/MS 测得样品准确的相对分子质量为831.48,与依替巴肽的参照品及理论值(831.96)完全一致;质谱分析确证合成依替巴肽分子内形成了一个正确的二硫键;~1 HNMR 进一步确定了依替巴肽分子的一级结构。结论:本文对依替巴肽的氨基酸序列以及一级结构全序列进行了确证。     

重组人甲状旁腺素1—34肽谱及一级结构的液相色谱／电喷雾离子化质谱法分析

目的：采用液相色谱／电喷雾质谱联用法(LC—ESI—MS／MS)对重组人甲状旁腺素1—34(rh—PTH—34)进行肽谱及一级结构分析。方法：用LC—ESI—MS法测定相对分子质量，并在线分析其胰蛋白酶和V8蛋白酶酶解质量肽谱；结合质谱源内碰撞诱导电离技术解析酶解肽段的氨基酸序列。结果：相对分子质量测定值与理论值一致；胰蛋白酶和V8蛋白酶酶解肽段氨基酸序列与理论值基本一致，序列覆盖率分别为97％和88％。结论：LC—ESI—MS／MS联用法为基因重组多肽类药物的一级结构分析和质量控制提供了新途径。     

纳升电喷雾串联质谱在修饰多肽及未知多肽结构分析中的应用

目的：以2种多肽为例，说明纳升电喷雾串联质谱存修饰多肽及未知多肽结构一级结构确证和分析中的应用。方法：存纳升电喷雾串联质谱TOF MS模式下对2种多肽的分子量进行了确认，然后在MS／MS模式下获得双电倚肽段的碎片离子峰。结果：曲谱瑞林一级结构全序列是E’HWSYWLRPG’，其中N-端焦谷氨酸和C-端甘氨酰胺。未知多肽通过“序列拼接法”得到该样品的全序列T’VSP^＊VWLPPSVY，其中第4位脯氨酸加合了一个钠离子，且N-端苏氨酸磷酸化。结论：本研究表明纳升电喷雾串联质谱在分析修饰多肽及未知多肽方面具有明显优势。     

重组人干扰素αdb质量肽图分析及二硫键定位

目的：液质联用绘制重组人干扰素αlb的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法：LC-MS联用绘制重组人干扰素αlb的胰蛋白酶酶切质量肽图；对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键，对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果：重组人干扰素αlb的质谱测定相对分子质量为19382．50，与理论相对分子质量19382．18一致，其质量肽图中共发现16个匹配肽段，有3个理论酶切片段（单一氨基酸：Lys135、Lys165、Glu166）未发现，氨基酸覆盖率为98．2％。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图，发现主要存在2种二硫键连接方式：Cys29-Cys139、Cys86-Cys99，同时还存在少量其他二硫键连接方式，如：C1-C99。结论：质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段，并可定位蛋白中的二硫键。     

基于液质联用技术的溶菌酶一级结构分析研究

目的:使用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法(UPLC-Q TOF MS法)对国内外3家企业溶菌酶的一级结构进行分析研究。方法:采用BEH300 C₄(50 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱和BEH300 C₁₈(150 mm×2.1 mm, 1.7μm)色谱柱，以0.1%甲酸/水溶液为流动相A,0.1%甲酸/乙腈溶液为流动相B,梯度洗脱，流速0.2 mL·min^-1;采用Q TOF MS的电喷雾正离子模式，相对分子质量测定时采用MS模式进行扫描，氨基酸序列和二硫键连接方式测定时采用MS^E模式进行扫描。结果:3种来源溶菌酶相对分子质量与理论值一致；肽图结果显示各样品的氨基酸序列均与理论一致；二硫键连接方式均为Cys6-Cys127、Cys30-Cys115、Cys64-Cys80、Cys76-Cys94。结论:UPLC-Q TOF MS法可用于溶菌酶一级结构的分析。     

电喷雾质谱法（ESI-MS）分析两种寡肽的一级结构

目的：测定肽类药物曲普瑞林、促黄体素释放激素类似物的分子量及其一级结构。方法：应用电喷雾质谱法（ESI MS）及源内碰撞诱导解离技术对肽类药物曲普瑞林及促黄体素释放激素类似物进行测定，根据其典型碎片离子确证其氨基酸序列及分子量。结果：肽类化合物在正离子模式下可得到较好的质谱信息，2种寡肽均测得其准分子离子峰（M＋H）^＋及（M＋Na）^＋信号，分子量分别与理论值一致。利用电喷雾碰撞诱导解离方法，得到一系列典型的y及b系列碎片离子，从而确证了2种寡肽的一级结构。结论：本研究为测定寡肽的分子量和一级结构提供了一个简便、快速、准确的方法。     

MALDI-TOF-MS在奥曲肽结构分析中的应用

目的:应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对奥曲肽进行结构确证分析。方法:采用二巯基苏糖醇还原奥曲肽二硫键,碘代乙酰胺(IAM)封闭还原奥曲肽中的巯基,测定还原前后及烷基化奥曲肽相对分子质量,并应用源后衰变(PSD)对其进行序列分析。结果:奥曲肽、还原奥曲肽和烷基化奥曲肽相对分子质量测定值分别为1019.25,1021.24,1135.38,与 PSD 测定的序列相同,均和理论值一致。结论:本方法可以较快速分析奥曲肽结构,是此类多肽结构确证的有效方法。     

液质联用分析重组人白细胞介素-11的肽图

目的用液质联用技术分析鉴定重组人白细胞介素-11(rhIL-11)的肽图。方法用胰蛋白酶酶解rhIL-11，采用HPLC测定肽图，用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF/MS)技术分析肽段的精确相对分子质量，通过串联质谱(MS/MS)测定肽段的氨基酸序列。结果根据肽段的色谱保留时间、相对分子质量及对其碰撞诱导解离质谱的解析结果，归属出肽图中各肽段所在的色谱峰，已检出肽段的总覆盖率为97%。结论液质联用研究肽图是验证和分析蛋白质结构的高效准确的方法。     

液质联用技术（LC-MS）在rh-PTH（1-34）肽图确定中的应用

目的：建立可用于质量控制的rh—PrrH（1—34）的标准胰酶肽图分析方法，并确定其理论肽图。方法：用胰酶动态酶切rh—PTH（1—34）探索最佳肽图分析条件，利用氨基酸特征吸收波长色谱分析结合LC—MS相对分子质量分析确证理论肽图。结果：多批rh—PTH（1—34）原液经胰酶解、RP—HPLC分析后，可产生4个主要肽段，其图谱与人工合成的hPTH（1—34）对照品一致；确定其理论肽图为：T1-HLNSMER、T2-LQDVHNF、T3-VEWLR、T4-SVSElQLMHNLGK。结论：建立的胰肽图分析方法可用于rh—PTH（1—34）产品的质量控制，用氨基酸特征吸收波长分析辅助LC—MS相对分子质量分析可有效用于rh—PTH（1—34）的标准肽图确定。     

HPLC-ESI-ITMS在药品质量控制中确证胰岛素和胰岛素B链C端氨基酸序列的应用研究

在药品质量控制中应用HPLC-ESI-IT (Ion Trap) MS分别确证胰岛素和胰岛素B链的C端氨基酸序列。取胰岛素标准品溶液或者胰岛素B链溶液适量，加入羧肽酶P及羧肽酶Y溶液适量降解胰岛素或者胰岛素B链C端，在预定的时间点取出酶降解反应液适量，加入等体积1%甲酸停止反应，混旋均匀后制成供试液，供HPLC-ESI-IT MS分析测定。采用Zorbax Prosphere C₁₈柱(2.1 mm×150 mm，300A，5 μm)分离，以流动相进行梯度洗脱［A相：水-乙腈-三氟乙酸(98∶2∶0.02)，B相：乙腈-水-三氟乙酸(98∶2∶0.02)］。柱后修饰“TFAfix”溶液为丙酸-异丙醇(2∶8)的混合溶液。ESI-ITMS测定供试液中梯度多肽系列(彼此相差1个C端氨基酸残基)的分子质量，计算出分子质量最相近的相邻两肽段的系列分子质量差值，即可得到待测样品C端系列氨基酸残基质量的实验值。胰岛素的B链C端的第1个氨基酸残基丙氨酸残基可以被准确地确证；同样还原修饰的胰岛素B链C端的第1个氨基酸残基丙氨酸残基也能被准确地确证。本研究在nmol样品水平准确地确证胰岛素和胰岛素B链各一个C端氨基酸，符合重组DNA制品中试产品的质量控制要求。本实验方法不必将胰岛素经还原修饰将A链从B链裂解，直接确证胰岛素的C端氨基酸残基，避免还原修饰和纯化的烦琐操作，方法简便。     

LC-MS/MS法对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定

运用液质联用、两种串联质谱对融合蛋白FP3的氨基酸全序列测定, 确证其一级结构。将样品还原烷基化后, 通过胰蛋白酶酶解蛋白, PNGase F去除多肽混合物中糖肽的糖基化, 将去糖后的总肽用于液质联用系统, 通过液相分离后, 运用Q-TOF和线性离子阱两种串联质谱测定各个肽段的b, y碎片离子, 分析测定融合蛋白FP3的氨基酸全序列。通过LC-ESI-Q-TOF完成了融合蛋白FP3的76%氨基酸序列测定, 通过LC-ESI-Trap完成余下24%氨基酸序列测定。液质联用、串联质谱法测定蛋白质氨基酸序列快速、灵敏、准确, 是对重组蛋白结构分析和确证的重要手段。     

重组人干扰素α1b质量肽图分析及二硫键定位

目的:液质联用绘制重组人干扰素α1b 的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法:LC-MS 联用绘制重组人干扰素α1b 的胰蛋白酶酶切质量肽图;对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键,对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果:重组人干扰素α1b 的质谱测定相对分子质量为19382.50,与理论相对分子质量19382.18一致,其质量肽图中共发现16个匹配肽段,有3个理论酶切片段(单一氨基酸:Lys 135、Lys 165、Glu 166)未发现,氨基酸覆盖率为98.2%。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图,发现主要存在2种二硫键连接方式:Cys 29-Cys 139、Cys 86-Cys 99,同时还存在少量其他二硫键连接方式,如:C1-C99。结论:质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段,并可定位蛋白中的二硫键。     

UPLC-MS/MS鉴定重组人乳头瘤病毒L1蛋白C端的氨基酸序列

目的 应用串联质谱技术鉴定重组人乳头瘤病毒L1蛋白C端的氨基酸序列。方法 将C端富含精氨酸和赖氨酸的重组人乳头瘤病毒L1蛋白酶解成合适长度的肽段混合物，运用液质联用技术进行鉴定。结果 分别对6、11、16、18亚型的重组人乳头瘤病毒L1蛋白的C端氨基酸序列进行了分析确证，均与理论序列一致。结论 所用分析方法简单可行，为HPV疫苗的结构表征和质量控制提供了参考和依据。     

白细胞介素－2的一级结构分析

为了鉴定白细胞介素－2的一级结构序列，通过对IL－2样品进行胰酶酶切，将IL－2蛋白分裂成多个小分子肽段，再进行高效液相色谱分离，收集各肽段片段。然后通过MALDI－TOF－MS一级解析鉴定各肽段的分子量，并对各肽段进行二次解析，鉴定各肽段的氨基酸序列。通过以上方法鉴定了IL－2样品的一级结构，并对二硫键进行了定位，证明了该方法的可行性。对该方法的进行的初步应用研究，为 IL－2蛋白的检测方法建立提供了依据。     

纳升电喷雾串联质谱鉴定吗啡依赖2个重要相关蛋白的N端乙酰化修饰

目的：用纳升电喷雾串联质谱（nanoESI—MS／MS）鉴定吗啡依赖相关蛋白。方法：采用吗啡递增给药法建立吗啡依赖模型，用纳洛酮催促后出现典型的戒断症状，以盐水组为对照，对长期接受吗啡处理和纳洛酮催促戒断这2种状态的大鼠纹状体进行了比较蛋白质组研究，确定了33个差异点。其中差异点150和209用电喷雾串联质谱进行了氨基酸序列分析。结果：电喷雾串联质谱分析表明差异点150和209为2个重要的吗啡依赖蛋白质：G蛋白β1亚基和电压依赖型阴离子通道蛋白1（VDAC-1），并且这2个蛋白质都发生了N端乙酰化修饰。结论：纳升电喷雾串联质谱分析是研究蛋白质N端乙酰化的好方法。N端乙酰化对蛋白质生物学功能有重要作用。这2个蛋白质N端乙酰化的生物学功能及其与吗啡依赖的关系值得深入研究。     

合成胸腺体液因子（TIHF-γ2）的纯度及结构鉴定

目的：对合成胸腺体液因子（thymus humoral factor，简称THF-γ2）进行纯度及结构鉴定。方法：用HPLC、毛细管区带电泳、质谱、氨基酸组成分析、序列测定和紫外扫描的方法鉴定THF-γ2的纯度和结构。结果：HPLC分析表明其纯度达到95．9％；毛细管区带电泳鉴定纯度为95．1％；质谱测定产物相对分子质量为917．7，与理论值918相符；氨基酸组成分析表明其氨基酸摩尔比与理论值一致；氨基酸序列测定结果为NH2／Leu—Glu—Asp-Gly—Pro—Lys-Phe—Leu，与设计序列相同；紫外扫描除在252nm有Phe的微弱吸收，整体为一光滑曲线。结论：经检测合成THF-γ2纯度高于95％，鉴定了其结构与理论的一致性。     

电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF2)鉴定重组人FKBP12

目的用最新的生物质谱技术-电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(ESI-Q-TOF2)鉴定重组蛋白质rhFKBP12.方法通过ESI-MS测定rhFKBP12分子量及ESI-MS/MS测定其胰蛋白酶酶切后肽段的序列和数据库查寻进行结构鉴定.结果 rhFKBP12的测定分子量为11 820.38,与理论值相比测定误差为0.007%.ESI-MS/MS测定出的两个肽段的部分序列分别为QVETMS和EEGVAQMSV,用这两段序列查寻数据库的结果表明rhFKBP12的结构正确.结论 ESI-MS/MS是鉴定蛋白质的灵敏、快速和准确的新方法.