肝细胞癌c—myc基因DNA甲基化模式的研究

探讨肝细胞癌ｃ－ｍｙｃ基因是否存在低甲基化状态及其临床意义。方法应用甲基敏感的限制性内切酶ＨｐａⅡ和ＭｓｐⅠ结合Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交手段，对６例正常肝组织和１８例肝细胞癌ｃ－ｍｙｃ基因３′端ＣＣＧＧ位点的甲基化状态进行检测。结果６例正常肝组织ｃ－ｍｙｃ基因３′端至少５个ＣＣＧＧ位点均被甲基化，而这种高甲基化模式在１１例肝细胞癌消失，表现为不同程度的低甲基化。在同一肿瘤组织各亚克隆细胞的甲基化状态也不一样。具有低甲基化状态的肝细胞癌多属进展期，其分化程度较差，大多伴有不同程度的肝内、外转移。结论肝细胞癌ｃ－ｍｙｃ基因的甲基呈不同程度的丢失，由此可能导致ｃ－ｍｙｃ基因异常高表达；ｃ－ｍｙｃ基因低甲基化状态可反映肝癌的恶性程度，有助于判断病人的预后。     

四岁男童原发性肝细胞癌伴有HBV DNA整合

<正> 不少血清流行病学研究表明,HBV感染与原发性肝细胞癌(HCC)有关。HCC发生率在HBV感染流行区明显高于其他地区,说明HBV在人肝癌的发生方面可能是起主要作用的病因。应用Southern转移杂交技术,证明病毒携带者的HCC,HBV可整合到癌细胞DNA,其频率很高。本文报道一例四岁男童HCC,伴有HBV-DNA整合,并有典型的HBV集积家庭所见的HBV抗原血症。在具有HBV-DNA整合的HCC中,本例乃最年幼患者,而且使我们对病毒在宿主细胞进行整合的时相及其在人肝癌发生的意义有更良好的了解。病例报告:男童,四岁十个月,先前健康,无输血史,主诉咳嗽和腹部变硬。在右肋缘中线下11c m可触及肝脏。入院时肝功能检     

肝细胞内HBV DNA、基因产物表达及其与肝细胞坏死灶的关系

应用原位分子杂交方法分析慢性乙肝患者肝细胞内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)。发现肝内HBV DNA复制部位往往与HBsAg或HBcAg表达部位相同;HBsAg与HBcAg同时在肝内表达时,数量多不均衡,提示编码HBsAg与HBcAg基因数量或复制活性不同;且观察到含HBV DNA的肝细胞数明显超过表达HBsAg、HBcAg的肝细胞数,提示胞浆HBV DNA一部分可能处于复制期,另一部分为非复制期:肝内HBV DNA复制与HBsAg、HBcAg表达对应的部位常紧紧毗邻肝细胞坏死灶,两者频率相似。     

原发性肝细胞癌中乙型肝炎病毒基因整合的突变分析

目的探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)整合序列中基本核心区突变与乙肝病毒相关肝癌发生的相关性。方法应用Alu-PCR和基于接头的LM-PCR方法扩增40对乙肝相关性肝癌组织和配对癌旁组织中整合的HBV序列,PCR产物纯化后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,测序结果使用Pub Med BLAST软件和Bio Edit软件进行分析。结果 65.0%的肝癌组织检测到整合HBV病毒序列(26/40),共检出37个不同的HBV整合序列。67.5%的癌旁组织中检测到整合HBV病毒(27/40),共检出68个不同的整合序列。平均每例肝癌组织中HBV整合序列检出数为1.42个,而癌旁组织为2.52个,癌组织低于癌旁组织。整合HBV序列发生A1762T/G1764A双突变在肝癌中的检出率高于癌旁组织,差异无统计学意义。结论 HBV感染相关肝癌组织及癌旁组织中都检测到整合HBV序列,再次表明整合是肝癌发生中的一个早期事件;而肝癌组织中整合HBV序列有更高的A1762T/G1764A突变检出率,从一个新的侧面表明这些突变在病毒的致癌过程中具有重要作用。     

人肝细胞癌中PTEN基因的DNA杂交及突变分析

目的　研究人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因缺失及第５、第８外显子突变。方法　应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因限制性片段长度多态性和纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。应用聚合酶链单链构象多态性（ＰＣＲＳＳＣＰ）检查ＰＴＥＮ基因的第５、第８外显子的突变。结果　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,所有３４例肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未见限制性片段长度多态性或纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。ＰＣＲＳＳＣＰ检测发现,２例肝细胞癌第５外显子ＰＣＲ产物均显示１条额外电泳迁移带,突变率为５．９％（２／３４）。另２例肝细胞癌第８外显子ＰＣＲ产物呈现额外电泳迁移带,突变率为５．９％（２／３４）,合计突变率为１１．８％（４／３４）。结论　所检３４例人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未见纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失,但存在突变。     

人肝细胞癌中PTEN基因的DNA杂交及突变分析

目的 研究人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因缺失及第５、第８外显子突变。方法 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测人肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因限制性片段长度多态性和纯合性缺失、半合性缺失、片段缺失。应用聚合酶链－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）检查ＰＴＥＮ基因的第５、第８外显子的突变。结果Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果显示,所有３４例肝细胞癌中ＰＴＥＮ基因未一片段长度多态性或纯合性缺失,半合性缺失、片段缺失。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ中     

原发性肝细胞癌中p16、p15、p53基因缺失、突变以及HBV DNA在肝细胞癌中整合的研究

目的构建人p16基因第二外显子cDNA克隆,制备其cDNA探针，建立p16基因第二外显子PCR-Southern Blot分析方法。研究原发性肝细胞癌(HCC)p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子纯合性缺失，p53基因第七外显子纯合性缺失、点突变以及HBV 前C区、S区、X区在HCC中整合情况。方法用RT-PCR获得p16基因第二外显子cDNA，将其插入质粒pGEM-T中，构建为重组质粒pGEM-pl6。经蓝白选择、限制性内切酶酶切图谱分析、DNA序列分析筛选获得重组质粒的阳性克隆，插入片段经限制性内切酶酶切、纯化后，用随机引物法标记地高辛，以此为探针，用Southern Blot方法分析p16第二外显子PCR产物。应用PCR、PCR-SSCP和PCR-RFLP等方法，对临床38例HCC手术后标本中的p16基因第一、二外显子、p15基因第二外显子、p53基因第七外显子纯合性缺失和点突变进行分析。应用PCR和3' 末端碱基特异性PCR分析肝细胞癌基因组HBV前C区野生型和突变型、PCR分析S区和X区整合的情况。同时检测了血清中HBV 前C区的阳性率。结果重组质粒的限制性内切酶酶切图谱分析表明其酶切位点与原设计相符，插入片段大小为307bp，与引物区间大小一致；地高辛标记探针可与p16 PCR产物杂交。发现在这38例HCC患者中，p16基因第二外显子的缺失率为34.2%，p16基因第一外显子和p15基因第二外显子未发现缺失；未发现p53基因第七外显子纯合性缺失，但4例存在p53基因249密码子点突变，且均为杂合型突变，突变率为10.53%。HBV前C区野生型阳性率为42.1%, 其中10例伴有突变型阳性(26.3%)。HBV X区阳性率为44.7%，HBV S区阳性率为50%。患者血清中，HBV 前C区野生型阳性率为15.8%, 突变型阳性率为18.4%。结论所获重组质粒为pGEM-pl6设计构建，并成功地获得p16第二外显子的cDNA探针和建立了p16 Southern Blot分析方法。所获结果提示在肝细胞癌中p16基因第二外显子的纯合性缺失是p16基因失活的一个重要方式，而纯合性缺失不是p15基因在肝细胞癌中的失活方式，但并不排除存在其它失活方式。p53基因第七外显子的杂合性突变提示有肿瘤遗传倾向。未发现纯合性点突变提示在肝细胞癌发生机制中p53基因第七外显子的点突变并不占据主导地位。HBV DNA 在原发性肝细胞癌基因组中可能存在整合,并在HCC发生过程中起一定作用。     

乙型肝炎病毒X基因在肝细胞肝癌及慢性乙型肝炎肝细胞染色体上整合情况的对照研究

目的:应用染色体制备和生物素原位杂交技术,研究乙型肝炎病毒X(HBx)基因在肝细胞肝癌(HCC)细胞染色体上的整合,并与慢性乙型肝炎(CHB)进行对比分析,了解HBx基因在肝细胞染色体上的整合与HCC发生的相关性.同时探讨在HCC与CHB患者中乙肝血清标志物差异及HBx整合与乙肝血清标志物之间的相关性.方法:HCC患者19例,CHB患者14例,分别获取手术或肝穿刺标本并制备成染色体载玻片,以生物素标记的HBx基因探针进行原位杂交,同时统计分析其乙肝血清标志物资料.结果:①19例HCC中有13例患者的肝细胞分裂期染色体上可观察到杂交信号,占68.24%,明显高于CHB组,差别有统计学意义(χ2=5.12,P＜0.05),肝癌患者肝细胞染色体上HBx整合位点数为3.80±1.36,而CHB患者肝细胞染色体上整合位点数为1.30±0.36,二者差别具有极显著性(t=3.5,P＜0.01).②乙型肝炎e抗原(HBeAg)在CHB患者中阳性率为80.0%,明显高于HCC组(10.53%),差别有统计学意义(χ2=6.33,P＜0.01).③HCC及CHB患者HBx整合与否与患者乙肝血清标志物未见明显相关性.结论:①HBx基因在HCC细胞染色体上的整合明显高于CHB;②CHB患者乙肝病毒复制较HCC患者活跃;③HBx基因整合与否与HCC及CHB乙肝血清标志物未见明显关系.     

原发性肝细胞癌病人PBMCs中HBV X、P基因的整合

目的 探讨外周血单个核细胞（PBMCs）中乙型肝炎病毒（HBV）X、P基因整合与原发性肝细胞癌（HCC）的关系。方法 分离HBsAg阳性的40例原发性肝癌病人PBMCs,提取基因组DNA;分别设计HBVX基因、P基因PCR引物．检测HCC病人PBMCs基因组中HBV的X基因和P基因的整合情况。结果 HCC病人X基因在PBMCs中的整合率为77．5％（31/40）．P基因整合率为15．0％（6／40）,二者差异有显著性（x^2=31．43,P〈0．001）。结论 PBMCs中存在HBVX、P基因的整合．X基因片段的整合及表达是HCC发生的主要因素。     

肝细胞癌的基因免疫治疗

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是导致癌性死亡的第三大原因,每年有100万新病例.目前更多的治疗手段是外科、移植、放疗或化疗及基因等综合治疗,其中基因免疫治疗被认为是最有前途的研究方向之一.现仅就肝细胞癌最近的治疗热点基因免疫治疗作一综述.     

PBMCs中HBV逆转录酶P基因的mRNA表达X基因的整合与肝细胞癌变的关系

目的在外周血单个核细胞(PBMCs)中研究乙型肝炎病毒(HBV)DNA多聚酶/逆转录酶P基因的mRNA表达、X基因的整合与肝细胞癌变的关系。方法设计HBV P基因引物P1、P2,及X基因引物X1、X2。分离HBsAg阳性40例原发性肝癌病人及36例慢性乙肝病人PBMCs,分别提取其基因组总DNA和总RNA,RNA逆转录合成cDNA;PCR检测HBV的X基因整合;RT-PCR方法检测HBV的DNA多聚酶/逆转录酶P基因在PBMCs中的mRNA表达。结果PBMCs中X基因片段的整合率在HCC组为79.5%(31/40),与CH组的整合率50%(18/36)无统计学差异(P>0.05)。P基因的mRNA表达率HCC组为10%(4/40),与CH组表达率33.3%(12/36)有统计学差异(P<0.05)。结论在HCC阶段HBV病毒复制相对静止,大量X基因整合最终导致HCC的发生。     

基于DNA损伤应答的肝细胞癌预后基因筛选和预后模型构建

目的 筛选差异表达的DDR相关基因(differential expressed-DNA damage response associated genes, DEDDR)构建肝细胞癌(HCC)预后模型。方法 使用limma R软件包从TCGA-LIHC数据集中筛选HCC样本和正常样本之间的差异表达基因(DEGs),将其与276个DDR基因取交集获得差异表达DEDDR。通过单因素Cox分析和Lasso回归分析以确定DEDDR预后模型,ROC曲线评估模型的准确性。单因素、多因素Cox回归分析DEDDR预后模型风险评分是否为HCC的预后独立危险因素,并采用国际癌症基因组联盟(ICGC)中LIHC数据作为外部数据进行验证。最后对low-DEDDR组和high-DEDDR组进行GSEA和免疫浸润分析。结果 1 361个DEGs与276个DDR基因取交集获得25个DEDDR,Lasso回归分析得到4个DEDDR(TTK、NSMCE2、NUDT1、NEIL3)用于构建预后模型。low-DEDDR组比high-DEDDR组患者具有更高的生存率。ROC曲线显示该模型预测HCC患者1年、2年和3年生存率的...     

人肝细胞癌总基因组DNA与c-myc、c-N-ras基因甲基化的改变

分别用两种方法研究了人原发性肝细胞癌总基因组及特定癌基因片段的DNA甲基化情况，并进行对比研究。以3H－SAM掺入法研究总基因组DNA甲基化水平，以限制性内切酶酶切、South－ern吸印法对c－myc、c－N－ras两种癌基因状况进行分析。结果：发现人肝细胞癌区和癌旁区组织内c－myc、c－N－ras癌基因分别有不同程度的低甲基化，且有癌区总基因DNA甲基化水平明显下降。本文结果提示：两种方法检测均发现在人原发性肝癌中存在DNA低甲基化现象，联用两种方法效果优于单一检测者。     

肝细胞内HBV DNA原位杂交的研究

应用生物素标记HBV DNA(乙肝病毒脱氧核糖核酸)作探针,对129例肝病患者肝组织作原位杂交研究。HBV DNA在慢性活动性肝炎中检出率最高(80.7％),显著高于肝硬化、慢性小叶性肝炎、急性肝炎及原发性肝癌组。具有乙肝复制指标阳性患者的肝细胞内HBV DNA检出率(82.0％)明显高于非复制组(63.0％),P<0.05。本研究观察到;HBB DNA阳性肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切,多位于肝细胞坏死灶中间或(和)周边,其中以局灶型分布的HBVDNA阳性肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切。提示HBV复制与肝细胞坏死有关。     

血浆DNA甲基化和肝细胞癌

DNA启动子异常甲基化在原发性肝细胞癌(HCC)中是早期、普遍事件。启动子异常甲基化作为一种表观遗传学改变,与HCC的发生、发展及预后密切相关。HCC患者血浆和癌组织中基因甲基化水平具有良好的一致性,血浆是研究甲基化的可靠资源。检测HCC患者血浆DNA启动子异常甲基化对HCC的早期诊断、病情和疗效观察、预后评估具有一定的应用价值。     

人体肝硬变肝细胞DNA含量的研究

利用自动化图象分析仪对４８例正常肝、重度慢性活动性肝炎、小结节性肝硬变、大结节及混合结节肝硬变、癌旁肝硬变的肝细胞ＤＮＡ含量进行测定分析，结果：①重度慢性活动性肝炎４Ｎ细胞及双核细胞比率下降；大结节及混合结节肝硬变２Ｎ比率增高；Ｓ期及双核细胞下降，显示细胞分化受抑制，可能与肝癌发生相关，②癌旁肝硬变２Ｎ／４Ｎ比率无明显改变，但≥５Ｎ细胞增高，双核细胞下降，ＤＮＡ直方图增宽，表明肝细胞分化受抑制且有向异倍体发展趋势，具有癌前病变性质，③小结节性肝硬变２Ｎ细胞比率显著下降，Ｓ期及双核细胞比率增高，为分化性代偿修复病变而与肝癌发生无关，肝细胞ＤＮＡ含量的定量分析对于了解肝硬变肝细胞的再生修复状态及患者预后评估将有重要的意义。     

DNA修复基因XRCC1 codon 399多态性与肝细胞癌易感性的meta分析

目的探讨DNA修复基因X线修复交叉互补因子1(XRCC1)codon 399多态性与肝细胞癌(HCC)易感性的关系。方法检索文献并按要求提取相关信息,纳入以XRCC1 codon 399多态性与HCC易感性为内容的病例—对照研究,对研究结果进行meta分析。通过异质性检验选择固定效应模型或随机效应模型计算合并的优势比(OR)及其95%可信区间(95%CI),并进行发表偏倚评估和敏感性分析。结果本研究共纳入国内外合格文献7篇(HCC患者1 342例,对照2 207例)。合并分析结果显示:XRCC1 codon 399 Gln/Gln基因型可使HCC的发病风险增加(OR=1.41,95%CI 1.07～1.84),而Lys/Gln基因型与HCC的发病风险无明显关联。进一步的亚组分析结果显示:在HCC高发区人群中,Lys/Gln和Gln/Gln基因型均与HCC发病存在关联性(OR=1.46,95%CI 1.07～2.00;OR=1.45,95%CI 1.09～1.93)。结论 XRCC1基因codon 399多态性与HCC的易感性相关。