不同基因位点的人端粒酶RNA反义寡核苷酸对食管癌EC9706细胞增殖及端粒酶活性的影响

目的:探讨封闭人端粒酶RNA不同基因位点的硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞增殖及端粒酶活性的影响.方法:采用阳离子脂质体介导的方法,将不同浓度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20μmol/L和30 μmol/L)的5条ASODN(ASODN-1、ASODN-2、ASODN-3、ASODN-4和ASODN-5)和无关序列寡核苷酸(N-ODN)分别导入食管癌EC9706细胞中,应用MTT法及端粒酶活性的定性及定量检测法,测定ASODN对食管癌EC9706细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用.结果:5条ASODN和1条N-ODN按照N-ODN、ASODN-4、ASODN-5、ASODN-2、ASODN-1和ASODN-3的顺序,对细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用逐渐增高(P＜0.05).结论:封闭hTR功能区的反义寡核苷酸可有效抑制食管癌细胞增殖及端粒酶活性.     

上调stathmin基因表达对食管鳞癌EC9706细胞的作用

目的 构建stathmin基因真核表达载体,研究上调stathmin基因表达对食管癌细胞EC9706的作用.方法 采用RT-PCR扩增stathmin cDNA,克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体.重组载体经脂质体转染EC9706细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株.显微镜观察转染细胞形态学变化,Western印迹法检测转染细胞stathmin蛋白的表达.选取稳定转染的细胞株,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖活性,平板克隆形成实验观察细胞克隆形成,流式细胞仪分析细胞周期,裸鼠移植瘤实验研究转染细胞的成瘤性.结果 RT-PCR扩增获得450 bp的cDNA编码序列;克隆至pcDNA3.1(+)载体,获得pcDNA3.1-stathmin重组表达载体.Western印迹法证实重组载体上调EC9706细胞stathmin蛋白表达,差异有统计学意义(P＜0.01).与对照组细胞比较,pcDNA3.1-stathmin转染细胞形态变大、多核、有丝分裂障碍;pcDNA3.1-stathmin转染细胞倍增时间延长(25～28 h)、增殖活性降低、细胞克隆形成率下降(34.5%±6.9%),细胞分裂阻滞于G2/M期(21.7%±3.4%),裸鼠体内致瘤性降低,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 重组质粒pcDNA3.1-stathmin上调stathmin基因表达能够抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖和致瘤性,stathmin可能成为食管鳞癌患者治疗的理想靶点.     

DMSO对EC9706细胞端粒酶活性及生长的影响

目的　研究二甲基亚砜 (DMSO)对EC970 6细胞端粒酶活性及生长的影响。方法　用 1.3 %DMSO处理食管癌EC970 6细胞 ,TRAP -ELISA法检测细胞端粒酶活性的改变 ,流式细胞仪分析细胞周期的改变。结果　DMSO处理后的EC970 6细胞 ,端粒酶活性明显下降 ,且细胞周期明显改变 ,G1期细胞比率显著增高 ,S期细胞数显著降低。结论　DMSO可抑制EC970 6细胞端粒酶活性 ,使EC970 6细胞生长停滞于G1期 ,并诱导细胞凋亡。提示DMSO可用于食管癌的治疗     

二甲基亚砜对HL—60细胞端粒酶活性和细胞周期的影响

探讨二甲基亚砚（ＤＭＳＯ）对ＨＬ－６０细胞端粒酶活性和细胞周期的影响。采用ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ方法检测二甲基亚砜处理前后的ＨＬ－６０细胞粒酶活性的改变,以流式细胞分析细胞周期的改变。二甲基亚砚作用于ＨＬ－６０细胞后,其端粒酶活性明显受到抑制,且细胞周期明显改变,Ｓ期细胞数显著减少。二甲在亚砜可抑制ＨＬ－６０细胞的端粒酶活性,防止细胞周期的进程。     

RNA干扰对EC9706细胞mTOR表达及细胞生长与凋亡的影响

目的:探讨RNA干扰技术对人食管癌EC9706细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表达及细胞生长与凋亡的影响.方法:设计合成mTOR siRNA,采用低、中、高浓度(50、100与150 nmoL/L)的mTOR siRNA分别转染EC9706细胞24、48与72 h.同时设无义对照组(转染无义对照siRNA)、空白对照组(转染空脂质体)及正常对照组(不转染).采用免疫细胞化学与原位杂交法分别检测各组EC9706细胞中mTOR蛋白与mRNA的表达;应用MTT法检测细胞增殖,计算细胞生长抑制率;应用TUNEL法检测转染24 h时细胞凋亡,计算凋亡指数(AI).结果:转染24、48与72 h,6组细胞mTOR蛋白和mRNA的表达差异均有统计学意义(mTOR蛋白:F=24.14,45.78,59.19,P均＜0.001;mTOR mRNA:F=41.42,69.74,43.71,P均＜0.001),细胞生长抑制率差异亦有统计学意义(F=143.85,172.98,155.01,P均＜0.001);低、中、高浓度组转染不同时间点间比较,mTOR蛋白(F=42.23,29.46,50.22,P均＜0.001)、mTOR mRNA(F=6.48,8.50,4.80,P均＜0.05)及细胞生长抑制率(F=78.77,76.14,52.28,P均＜0.001)差异均有统计学意义.mTOR siRNA转染组EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达均低于各对照组,且mTOR蛋白及mRNA的表达随mTOR siRNA浓度的增加及转染时间的延长而减弱(P＜0.05).不同浓度mTOR siRNA转染组EC9706细胞生长抑制率均高于各对照组,且细胞生长抑制率随mTOR siRNA浓度的增加和转染时间的延长而升高(P＜0.05).转染24 h,6组细胞AI相比,差异有统计学意义(F=442.96,P＜0.001),mTOR siRNA转染组AI均高于各对照组,且高浓度转染组AI高(P＜0.05).结论:mTOR siRNA可有效抑制EC9706细胞mTOR蛋白与mRNA的表达,且能抑制EC9706细胞的增殖并促进其凋亡.     

人端粒酶RNA反义寡核苷酸诱导食管癌EC9706细胞凋亡观察

目的:观察人端粒酶RNA功能区的硫代修饰性反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用.方法:应用20 μmol/L ASODN 1次/d、连续7 d转染EC9706细胞,分别于转染前及转染后第1 d、3 d、5 d、7d采用端粒酶活性的定性及定量检测技术测定ASODN对EC9706细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,采用细胞DNA凋亡条带检测、TUNEL检测及吖啶橙荧光染色法观察细胞的凋亡情况.结果:与转染前比较,ASODN转染后各时点EC9706细胞端粒酶活性降低,凋亡细胞增多(P＜0.05或0.01).转染后第3 d开始出现DNA凋亡条带,第7 d出现从靠近加样孔处向远端延伸的相差180～200 bp的十几条DNA凋亡条带.结论:ASODN可通过抑制EC9706细胞端粒酶活性诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制食管癌细胞的增殖.     

雷帕霉素抑制mTOR信号通路对EC9706细胞生长及凋亡的影响

目的:检测食管鳞状细胞癌组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性及雷帕霉素(rapa)对食管鳞状细胞癌细胞系EC9706细胞生长及凋亡的影响.方法:采用免疫组织化学SP法检测50例食管鳞状细胞癌组织及15例正常食管组织中mTOR蛋白的表达.分别用不同浓度(20、50和100 nmol/L)的rapa处理食管鳞状细胞癌EC9706细胞系,以未处理组作为阴性对照,采用流式细胞术测定细胞周期和凋亡率.结果:食管鳞状细胞癌组织中mTOR蛋白的阳性表达率为64.0%(32/50),高于正常组织的13.3%(2/15)(χ2=11.873,P=0.001).与对照组比较,rapa可使细胞停滞于G0/G1期(F=102.609,P=0.001),且明显促进细胞凋亡(F=916.882,P=0.001).结论:mTOR信号通路在食管鳞状细胞癌中被显著激活,rapa能抑制食管鳞状细胞癌细胞生长并诱导细胞凋亡.     

二甲基亚砜对HL-60细胞端粒酶活性和细胞周期的影响

探讨二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）对ＨＬ－６０细胞端粒酶活性和细胞周期的影响。采用ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ方法检测二甲基亚砜处理前后的ＨＬ－６０细胞端粒酶活性的改变,以流式细胞仪分析细胞周期的改变。二甲基亚砜作用于ＨＬ－６０细胞后,其端粒酶活性明显受到抑制,且细胞周期明显改变,Ｓ期细胞数显著减少。二甲基亚砜可抑制ＨＬ－６０细胞的端粒酶活性,阻止细胞周期的进程。     

全反式维甲酸对食管癌EC9706细胞NDRGl mRNA和蛋白表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对食管癌细胞分化相关基因NDRG1表达的影响.方法:将10μmol/LATRA作用于人食管癌EC9706细胞,应用免疫组织化学SP法和RT-PCR方法分别检测对照组及ATRA作用1 d、2d、3 d及5 d组NDRG1蛋白和mRNA的表达.结果:ATRA作用1 d、2 d、3 d及5 d组NDRG1 mRNA相对含量分别为1.47±0.18、1.69±0.24、1.72±0.19和1.58±0.25,均高于对照组的1.08±0.10(P＜0.05或0.01).ATRA作用1 d、2 d、3 d及5 d组NDRG1蛋白表达积分分别为254±37、277±34、265±30和239±24,均高于对照组的164±29(P＜0.01).结论:ATRA可上调EC9706细胞分化相关基因NDRG1的表达,从而促进其分化.     

全反式维甲酸对EC9706细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用

目的:观察全反式维甲酸(ATRA)对食管癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡的作用.方法:应用不同浓度(1×10-6、1×10-5、5×10-5 mol/L)ATRA体外处理人食管癌细胞EC9706(ATRA1、ATRA2、ATRA3组),并设不加ATRA的对照组,倒置显微镜下观察细胞的生长状态,HE染色后光镜下观察细胞结构的改变,应用MTT法测定细胞生长抑制率,免疫组织化学技术检测凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达情况.结果:经ATRA处理后,ATRA3组与对照组比较,细胞生长速度减慢,群体倍增时间延长(P均＜0.05);光镜下可见细胞形态趋向良性分化,细胞质内成熟细胞器增多,生长抑制率增加(P＜0.05).与对照组比较,3个ATRA组细胞Bax蛋白表达增加、Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01),且以ATRA2、ATRA3组为明显(P<0.05).结论:ATRA能有效抑制EC9706细胞增殖,其机制与Bax及Bcl-2蛋白表达调控有关.     

肝素酶特异性RNAi对人食管癌EC9706细胞肝素酶基因表达的影响

目的:探讨RNAi技术对人食管癌EC9706细胞肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达的影响.方法:针对Hpa不同基因位点设计合成寡核苷酸,然后转录为小分子干扰RNA(siRNA),分别用浓度为10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L的siRNA经LipofectamineTM 2000脂质体介导转染EC9706细胞72 h,同时设无关序列组及不转染组.采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中Hpa基因的表达.结果:siRNA可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达,以15 μmol/L的siRNA作用效应最强,但不同浓度siRNA两两相比,差异均无统计学意义(P＞0.05),不同浓度siRNA对Hpa基因表达的抑制效应均显著强于无关序列组及不转染组(P＜0.05).结论:RNAi技术可有效抑制人食管癌EC9706细胞Hpa基因的表达.     

小分子干扰RNA对EC9706细胞中血管内皮生长因子C表达的影响

目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的抑制作用.方法:根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照.采用免疫细胞化学SP法、半定量RT-PCR和原位杂交技术分别检测上述各组细胞中VEGF-C蛋白和mRNA的表达.结果:正常细胞对照组和无关序列转染组均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒和mRNA阳性条带,而在siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和较弱的mRNA阳性条带,与正常细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C的表达,可望成为一种抗淋巴管生成的新方法.     

二甲基亚砜对CAOV3细胞端粒酶活性的可逆性抑制作用

目的探讨卵巢癌细胞CAOV3经二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）作用后及停止用药后端粒酶活性变化与细胞周期进展之间的关系。方法台盼蓝拒染法计数活细胞，流式细胞术观察细胞周期分布，端粒重复序列扩增法（TRAP）、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法检测端粒酶活性。结果生长曲线显示DMSO对CAOV3细胞具有生长抑制作用，且具有浓度和时间依赖性。经1．4％DMSO作用96h后，CAOV3细胞主要受阻于G0／G1期，其端粒酶活性完全被抑制。去除药物后，细胞逐渐由G0／G1期向S期过渡，其端粒酶活性亦逐渐恢复，并于去除药物24h时，S期细胞百分率与端粒酶活性均明显高于用药前水平。结论DMSO对CAOV3细胞具有可逆性阻滞细胞周期进展，并下调其端粒酶活性的作用。CAOV3细胞端粒酶活性表达可能存在细胞周期依赖性调节。     

Cyclin E RNA干扰载体的构建及其对EC9706细胞Cyclin E表达的影响

目的:构建CyclinE基因干扰载体,转染食管癌EC9706细胞,观察其对CyclinE基因表达的影响。方法:设计、合成靶向CyclinE基因siRNA,退火成双链后与pRNAT-CMV3.1/Neo载体连接。转染EC9706细胞后,倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果,RT-PCR、Western-blot分别检测CyclinE基因mRNA和蛋白表达水平。结果:构建的2个CyclinE基因siRNA载体插入序列与所设计序列均一致;转染EC9706细胞后,干扰1组、干扰2组与无关siRNA对照组均产生绿色荧光,空白对照组无荧光产生。干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组CyclinEmRNA相对表达量比较,差异有统计学意义(F=15.381,P=0.002),且干扰1组、干扰2组与空白对照组和无关siRNA对照组比较,CyclinEmRNA相对表达量均降低(P均<0.05)。结论:构建的靶向CyclinE基因RNA干扰载体能有效抑制转染细胞CyclinE基因的表达。     

组织蛋白酶B特异性siRNA对食管癌EC9706细胞组织蛋白酶B基因表达的影响

目的:探讨小分子干扰RNA(siRNA)对食管癌EC9706细胞组织蛋白酶B(CB)基因表达的影响.方法:设计并用体外转录方法合成针对CB基因的siRNA,转染EC9706细胞(设10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L 3个转染浓度),分别培养24 h、48 h、72 h(实验组),采用免疫细胞化学及原位杂交方法检测转染细胞中CB蛋白和mRNA表达的变化,并设正常对照、空白对照、无关对照.结果:不同浓度siRNA转染24 h、48 h、72 h EC9706细胞CB蛋白表达量均较正常、空白及无关对照降低(P＜0.05),以转染72 h的抑制效应最为明显,但3者相比差异无统计学意义(P＞0.05).3个时间段内随浓度增加siRNA抑制效应增强,3者相比差异有统计学意义(P＜0.05),正常对照、空白对照、无关对照均未表现出对CB蛋白表达的抑制效应.转染siRNA后部分细胞形态发生改变.结论:特异性siRNA能有效抑制EC9706细胞中CB蛋白和mRNA表达.     

ANGPTL3反义寡核苷酸对EC9706细胞侵袭黏附能力的影响

目的:观察ANGPTL3反义寡核苷酸(ASODN)对食管癌细胞EC9706侵袭黏附能力的影响.方法:根据GenBank收录的ANGPTL3 mRNA序列,设计ASODN,并制成脂质体-ASODN混合液转染EC9706细胞,观察转染后EC9706细胞黏附率、细胞侵袭穿膜细胞数及侵袭抑制率.结果:ANGPTL3 ASODN...     

粉防己碱对EC9706细胞增殖、细胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表达的影响

目的:观察粉防己碱作用于EC9706细胞后细胞增殖、细胞周期及sPLA2-Ⅱa蛋白表达的变化。方法:15μmol/L的粉防己碱作用于EC9706细胞1、3和5d后,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期的变化,免疫细胞化学SP法检测sPLA2-Ⅱa蛋白表达水平的变化。以未经粉防己碱处理的细胞作为对照组。结果:粉防己碱作用1、3和5d后,EC9706细胞的增殖抑制率逐渐增高(F=48.740,P<0.001),G0/G1期细胞比例逐渐增高(F=21.140,P<0.001),而S、G2/M期细胞比例逐渐减低(F=13.740,9.370,P<0.05),但sPLA2-Ⅱa蛋白的表达水平无明显变化(F=1.416,P=0.265)。结论:粉防己碱能够抑制EC9706细胞的增殖,但对sPLA2-Ⅱa蛋白的表达无影响。     

靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡的影响

目的:探讨靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响。方法:分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞12、24和48h后,采用MTT法检测细胞增殖抑制率;用10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞0、24、48和72h后,采用流式细胞术法检测凋亡率;分别用0、1、5和10μmol/L靛玉红甲肟处理EC9706细胞48h后,采用RT-PCR法检测细胞Sox-2mRNA的表达。结果:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞增殖具有明显的抑制作用,且表现为剂量依赖性和时间依赖性(F剂量=135.237,F时间=96.488,F交互=189.544,P均<0.001)。靛玉红甲肟作用EC9706细胞后,细胞凋亡率呈时间依赖性上升(F=195.350,P<0.001),Sox-2mRNA的表达呈剂量依赖性下调(F=87.552,P<0.001)。结论:靛玉红甲肟对食管癌EC9706细胞具有明显的增殖抑制和诱导凋亡作用,其作用机制可能与下调Sox-2mRNA表达有关。     

佛波酯对食管癌EC9706细胞NDRG_1表达及细胞增殖影响的研究

目的:探讨12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)作用于食管癌细胞EC9706后,对NDRG1mRNA表达、细胞增殖、细胞周期的影响。方法:采用50nmol/L的TPA作用于EC9706细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期的变化,原位杂交法检测NDRG1mRNA水平。结果:TPA能上调NDRG1mRNA水平,抑制EC9706细胞增殖,细胞周期发生G1→S期阻滞。结论:TPA可能通过上调NDRG1mRNA的表达而抑制EC9706增殖,促进其分化。