鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对36株鼠疫耶尔森菌和7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析,鉴定差异区段(DFR),并对260株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出22个DFR,基于DFR图谱,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有21个基因组岛,其中18个已存在于假结核杆菌中,余下3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统;建立了各基因组型别间的系统发育关系,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系,基本探明了鼠疫耶尔森菌在中国的演化规律。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析

目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出4005条鼠疫耶尔森菌基因,PCR扩增各基因,以纯化的PCR产物点样制备芯片,采用双色荧光杂交策略,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。结论 成功建立了基于全基因组DNA芯片的鼠疫耶尔森菌比较基因组学技术平台。     

鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株91001的全基因组序列,并通过比较基因组学研究,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定91001菌株的全基因组序列,利用比较基因组方法对91001与另外2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 91001菌株的基因组包括1条染色体和4个质粒(pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为9609bp,与参考菌株基本一致;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒,长度为70159bp,编码情况与参考菌株基本相同,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异;pMT1质粒长度为106642bp,保留了较多的原始质粒片段,毒力相关基因与参考菌株没有差异;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒,在国内外研究中未曾报道,这一质粒长度为21742bp,具有独立复制能力,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。91001菌株的染色体长度为4595065bp,有4037个编码序列(CDS),其中141个是假基因;染色体中存在着非常丰富的插入序列,由于存在IS序列介导的基因组重排,91001菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析,初步确定了91001菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉伯糖分解代谢阴性以及蜜二糖分解阳性的遗传基础。结论 根据质粒结构、染色体基因组重排、硝酸盐还原阴性的机制以及假基因的分布等信息,推测以91001菌株为代表的田鼠型菌株是原始鼠疫耶尔森菌进化过程中的另一个分支,与现有菌株存在着比较明显的差异;而91001菌株独特的致病性可能与基因组中的假基因或大片段缺失有关。     

鼠疫耶尔森菌比较和进化基因组学研究

鼠疫菌是鼠疫的病原体,曾经引起3次世界范围的鼠疫大流行。从基因组角度认识鼠疫菌在不同疫源地的演化对鼠疫的检验、鉴定和防治具有重要意义。本文论述了目前对鼠疫菌基因组进化的认识,并讨论了这些研究成果的实际意义。     

鼠疫耶尔森菌活疫苗株的比较基因组学研究

目的揭示不同来源的鼠疫活疫苗株在基因组组成上的差异。方法以芯片比较基因组杂交为主要研究手段,结合PCR验证,对19株鼠疫活疫苗株进行比较基因组分析。结果鼠疫活疫苗株基因组中缺失了大量基因,但也有某些大片段基因的拷贝增多。结论不同来源的疫苗株在基因组组成上存在差异,构成了不同疫苗株的表型与使用效果具有差异性的遗传基础。     

鼠疫耶尔森菌菌株91001的蛋白质组学初步研究

目的建立鼠疫耶尔森菌的蛋白质组学研究方法,获得鼠疫耶尔森菌的基本蛋白质组数据。方法以对人无致病能力的布氏田鼠疫源地菌株91001为研究对象,按照溶解性的不同分别收集菌体蛋白,以3种不同方法(Shotgun-LC-MS-MS,1D-LC-MS-MS和2D-MS)进行分析,将分析数据与基于91001菌株基因组全序列建立的蛋白质理论数据库进行比对,确定91001菌株本实验培养条件下所表达的蛋白组分。结果Shotgun-LC-MS-MS方法鉴定了971种蛋白,1D-LC-MS-MS鉴定了915种,而2D-MS方法则鉴定了233种蛋白质,三者合计为1193种蛋白质,占基因组预测CDS的28．7％(1193／4143)。结论不同的蛋白质组分析方法鉴定的蛋白质种类和数目都存在差异,为更全面地获得鼠疫耶尔森菌蛋白质组数据,有必要同时采取多种方法进行分析。     

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型--田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变,所有甘油利用阴性菌株的glpD基因发生了突变,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型——田鼠型;相应糖醇代谢相关基因发生突变是4个生物型变异的遗传基础。     

蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森菌与巨噬细胞的蛋白相互作用

目的：利用蛋白芯片筛选鼠疫耶尔森菌的毒力因子，进一步揭示鼠疫菌与宿主之间相互作用的机制。方法：鼠疫菌毒力相关蛋白芯片筛选与小鼠巨噬细胞系774A．1可能有相互作用的蛋白质，免疫荧光试验验证筛选出的蛋白相互作用。结果：共筛选到17个可能与巨噬细胞有相互作用的鼠疫菌蛋白，并通过免疫荧光试验初步验证了其中8个蛋白芯片筛选试验中信号最强的蛋白与巨噬细胞的相互作用。结论：蛋白芯片技术可用于筛选病原菌与宿主之间的相互作用，有助于深入研究病原与宿主之间相互作用的机制。本研究筛选出的鼠疫菌蛋白与巨噬细胞的相互作用尚需深入研究和验证，以便最终确定这些蛋白在鼠疫菌致病机制中所发挥的作用。     

鼠疫耶尔森菌pgm位点及其侧翼序列遗传变异的比较分析

目的研究鼠疫耶尔森菌中国自然分离株pgm位点及其侧翼序列的变异,了解不同疫源地菌株间的毒力差异,为鼠疫防治提供帮助。方法比较分析现有4株菌的pgm位点及其侧翼序列的变异,采用PCR、等位基因特异性PCR扩增260株中国自然分离株和7株假结核耶尔森菌。结果除锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株外,其他菌株均缺失了YPl666的70～87bp之间的18bp碱基。1406bp处T的缺失仅存在于东方型菌株中。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点下游都没有IS100插入;锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株的色素沉着区有1个IS285插入,在其下游3kb区域还有1个IS100插入。冈底斯山型和昆仑山A、B型菌株的pgm位点上游侧翼区与其他菌株不同。36株菌的pgm位点缺失,缺失的菌株主要集中在鄂尔多斯高原型,松辽平原B型,昆仑山A、B型4种生态型菌株中。结论北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株是中国鼠疫耶尔森菌中比较古老的菌株。锡林郭勒高原型和青海田鼠型菌株是一个独特的分支,建议归为第4个生物型——田鼠型。北天山东段型及西段A、B型,锡林郭勒高原型,青海田鼠型菌株的pgm位点,由于在其下游没有IS100插入,所以稳定、不易缺失。pgm位点及其侧翼序列的变异与菌株的生物型、自然疫源地和生态型都具有一定的相关性。     

基于Luminex悬浮芯片的鼠疫耶尔森菌SNP分型方法研究

目的利用Luminex悬浮芯片技术,基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）建立我国鼠疫耶尔森菌东方型菌株（以下简称东方型鼠疫菌）的基因分型方法,为进一步研究东方型鼠疫菌多态性并分析其系统发育关系奠定基础。方法利用多重PCR,同时扩增东方型鼠疫菌中18个具有分型意义的SNP位点,扩增产物进行多重等位基因特异性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE）反应以及Luminex悬浮芯片技术分析,随后利用MasterPlex GT V2.3软件计算平均荧光强度（median fluorescence intensity,MFI）比值,判断各SNP位点的碱基状态;并对SNP分型方法的重现性进行评价。结果 Luminex多重SNP技术能够快速、高通量地检测出各SNP位点的MFI值,从而在8 h内一次性成功确定东方型鼠疫菌中18个SNP的碱基状态;36株东方型鼠疫菌基于18个SNP可以分为7个基因型。结论本文建立的Luminex多重SNP检测方法作为一种高通量检测SNP的技术平台,为后期的东方型鼠疫菌SNP分型及系统发育分析奠定了基础。     

鼠疫耶尔森菌的研究及其军事医学意义

随着军事医学的发展,防生物危害医学学科研究的范畴应当包括目前认识到的所有可以导致生物危害的领域,包括生物战、生物恐怖、外来有害生物入侵、生物资源流失、转基因生物安全和研发、突发疫情的应对研究等.鼠疫耶尔森菌是导致自然疫源性疾病鼠疫的病原菌,也是重要的生物战和生物恐怖剂之一,历史上曾3次导致世界鼠疫大流行,多次被用于战争,并多次在战争中导致军队感染.目前鼠疫主要分布在亚洲、非洲、美洲及俄罗斯地区,我国现有12种类型的鼠疫自然疫源地,分布在19个省(区),占国土面积的15％左右,疫情监测结果表明,疫区动物鼠疫自然疫源地异常活跃,面积不断扩大,逐渐向城市逼近,防治形势严峻.2001年美国“9·11”恐怖袭击后,鼠疫耶尔森菌的研究方兴未艾,其中很多研究进展对其他生物恐怖剂的研究具有借鉴意义.微生物法医学溯源数据库的建立及其检测新技术的研究进展为生物恐怖剂的溯源和应急处置提供了很好的经验.     

鼠疫耶尔森菌文献数据库的研建与开发

目的 建立便捷的鼠疫菌文献数据库系统,从而提高文献利用效率.方法 运用EndNote X5文献管理软件进行文献收集整理,通过Perl及PHP等计算机语言规范数据格式、构建实体关系模型、搭建系统和开发网页;选择中小型网站开发中常用的Apache+PHP+MySQL组合进行动态网站的开发.结果与结论 构建了鼠疫菌文献数据库(访问地址:http://101.201.51.148/ypkd/).该文献数据库可供用户快速检索、浏览并获取鼠疫菌相关文献和著作全文,并提供自动更新的鼠疫菌新闻资讯.该数据库具有前沿性和完整性,为鼠疫菌相关科研及鼠疫疫情的预防控制提供了知识保障,并为其他重要病原文献数据库的建立提供了参考模型.     

小鼠吸入性鼠疫病理学和毒力相关基因的体内转录

目的探讨吸入感染鼠疫的发生、发展过程及重要鼠疫菌致病相关基因的体内表达规律。方法采用滴鼻法建立小鼠吸入性鼠疫感染模型,并观察不同感染时间的组织病理学改变;采用免疫组化和逆转录一实时定量PCR方法检测感染小鼠组织中鼠疫菌5种毒力相关蛋白及其基因（cafl、lcrV、lcrG、pla、psaA）的表达和转录。结果鼠疫菌吸入后可诱导小鼠产生肺鼠疫型和非肺鼠疫型鼠疫。在小鼠体内感染状态下的鼠疫菌体表面能够检测到上述5种毒力相关蛋白的表达。其毒力基因的转录呈时相、组织差异性。结论在体内感染状态下,5种毒力相关蛋白均呈菌体表面可检测到的表达;各毒力相关基因在不同时间、不同组织中转录具有很大的差异性,这种差异性可能与其功能及宿主细胞的作用密切相关。