鼻咽癌细胞中增强型表达载体调控TK基因与端粒酶活性关系的研究

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因核心启动子和原核增强子CMV联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韦系统对TK基因的活性改变及与鼻咽癌细胞中端粒酶活性的关系。方法:将改良构建后的增强型载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp-CMV enhancer及单启动子载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp(作为对照组)分别转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞株及对照组细胞人乳腺癌MCF-7细胞(端粒酶阳性)及正常人血管内皮ECV细胞(端粒酶阴性),采用荧光显微镜下观察其TK基因绿色荧光蛋白表达,实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中TK基因mRNA定量表达差异,TRAP银染法检测肿瘤细胞转染前后端粒酶活性改变并分析TK基因表达与端粒酶活性之间的关系。结果:①增强型表达载体转染鼻咽癌5-8F细胞及乳腺癌MCF-7细胞均有很强的荧光表达及TK基因的mRNA表达,比单启动子pGL3-basic-EGFP-TK-hTRETp及ECV细胞绿色荧光要强。实时荧光定量PCR显示,增强型载体组A值亦较对照组明显增高。②转染增强型载体(加GCV)后TRAP银染法检测鼻咽癌5-8F细胞端粒酶活...     

肿节风对鼻咽癌裸鼠移植瘤凋亡和端粒酶活性的影响

目的:评价肿节风提取物诱导鼻咽癌裸鼠移植瘤细胞凋亡作用和抑制端粒酶活性的能力。方法:将移植人鼻咽癌CNE1、CNE2细胞的裸鼠随机分为肿节风组、环磷酰胺组和对照组,定期检测裸鼠的体重及肿瘤体积,给药一个疗程(30d)后解剖获取肿瘤组织,称量瘤体重量,计算抑瘤率。运用透射电镜观察瘤组织细胞超微结构的改变;免疫组织化学法检测瘤组织Bcl-2和Bax的表达;流式细胞仪进行细胞周期、细胞凋亡分析;TUNEL法检测细胞凋亡;TRAP-ELISA方法观察药物处理前后组织端粒酶活性的变化。结果:动物实验表明,肿节风对CNE1、CNE2移植瘤有明显的抑瘤作用,抑瘤率分别为40.8%和46.8%(与对照组比较P<0.01);且Bcl-2蛋白表达明显低于对照组(P<0.01),而Bax蛋白表达明显高于对照组(P<0.01);电镜下肿节风组瘤组织中可见较多典型的凋亡形态学改变;TUNEL法肿节风组凋亡指数明显高于对照组(P<0.01);流式细胞技术显示肿节风组G0/G1期细胞高于对照组(P<0.01),细胞阻滞在G0/G1期,凋亡率明显高于对照组(P<0.01);端粒酶活性检测中可见肿节风组比对照组端粒酶活性降低(P<0.01)。结论:肿节风在体内具有抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的作用,其抑瘤作用机制与诱导凋亡有关,抑制端粒酶活性可能起部分作用。     

RNA同时干扰四个不同基因对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的实验研究

目的 应用RNA干扰技术构建一个载体同时编码四个基因,即血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶的短发夹重组质粒,并与单基因质粒做对比,通过体内外实验,研究其对鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶并含荧光素标记的短发夹RNA质粒命名为P-1,并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin和端粒酶反转录酶的质粒,分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5,分别将其将转染人鼻咽癌CNE-2Z细胞株及荷瘤裸鼠瘤体内.以激光共聚焦显微镜观察质粒在CNE-2Z细胞及瘤体内的转染及表达情况.四甲基偶氮噻唑蓝法检测细胞增殖活性,实时PCR在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果,Trans well侵袭小室模型观察导入CNE-2Z细胞对其恶性生物学行为的改变,流式细胞仪观察各组凋亡率,体内裸鼠成瘤实验观察质粒对肿瘤的抑制效果.结果 多基因干扰质粒转染鼻咽癌细胞后,CNE-2Z细胞增殖受到明显抑制,体外侵袭能力显著下降(P值均＜0.05).实时PCR证实多基因组4个不同基因mRNA表达均降低,免疫印迹技术验证目的基因蛋白同时表达下调.流式细胞仪结果证明多基因凋亡率明显高于单基因组(P值均＜0.05).体内抑瘤实验表明,与阴性组和空白组相比,P-1组移植瘤生长明显受到抑制(P＜0.05),并且多基因质粒抑制肿瘤细胞增长的作用要强于单基因干扰质粒(户值均＜0.05).结论 同时干扰多个基因能有效抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡,为鼻咽癌基因治疗奠定了良好的实验基础.     

维甲酸抑制鼻咽癌端粒酶和hTR表达及诱导凋亡的研究

目的:探讨维甲酸(RA)诱导鼻咽癌端粒酶及hTR表达下降和凋亡改变。方法:10-5mol/L维甲酸处理HNE1细胞后,采用TRAP PCR ELISA、逆转录巢式PCR、凋亡指数及透射电镜检测端粒酶、hTR表达及凋亡改变。结果:加入维甲酸6 d后,HN E1细胞形态不规则,细胞悬浮,细胞数减少,端粒酶及hTR表达受抑制,间接定量显示端粒酶活性(0.68±0.14)U只及对照组(1.16±0.46)U的1/2,凋亡指数及细胞明显高于对照组(P<0.05)。结论:维甲酸能明显抑制鼻咽癌细胞中端粒酶及hTR表达,并诱导该类肿瘤细胞增殖受阻及发生凋亡改变。     

端粒酶抑制因子PinX1基因在鼻咽癌细胞中的表达及作用效应分析

目的 探讨PinX 1基因在鼻咽癌细胞中的表达及其作用效应分析.方法 构建包含全长人PinX 1基因序列的质粒载体pEGFP-C 3-PinX 1及Pinx 1的小干扰RNA,PinX1-FAMsiRNA.脂质体法转染人鼻咽癌5～8F细胞,采用RT-PCR检测PinX 1基因和端粒酶催化亚单位( hTERT) mRNA...     

环状RNA BCRC-3对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响研究

目的　观察鼻咽癌组织和细胞株中环状RNA（circular RNA,circRNA）BCRC-3的表达,探讨环状RNA BCRC-3对细胞周期依赖性激酶抑制蛋白B（cyclin dependent kinase inhibitors B,DKNIB）基因表达的调控及对鼻咽癌细胞增殖和迁移的影响。方法 荧光实时定量聚合酶链式反应（qPCR）分别检测circRNA BCRC-3在83例鼻咽癌组织及62例慢性鼻咽炎组织、鼻咽癌细胞株及人永生化鼻咽上皮细胞中的表达。以circRNA BCRC-3表达最低的细胞株为转染对象,分别转染阴性对照质粒（对照组） 或载有circRNA BCRC-3序列的质粒（实验组）。MTS法和细胞划痕实验分别检测上调circRNA BCRC-3对细胞增殖和迁移能力的影响。qPCR检测上调环状RNA BCRC-3对DKNIB基因mRNA表达的影响,Western blot检测DKNIB蛋白和PI3K/AKT信号通路蛋白的表达。结果 与慢性鼻咽炎组织相比,circRNA BCRC-3在鼻咽癌组织中表达显著降低（P <0.01）。与人永生化鼻咽上皮细胞相比,环状RNABCRC-3在鼻咽癌细胞株中表达显著降低（P <0.01）,在HONE-1细胞中的表达最少（P <0.01）。与对照组比较,实验组HONE-1细胞增殖能力从第2天开始明显下降（P <0.05）,HONE-1细胞迁移能力明显降低（P <0.01）,HONE-1细胞中DKNIB在mRNA和蛋白水平的表达明显上升（P <0.01）,PI3K/AKT信号通路蛋白PIP3、PDK1、p-AKT和AS160表达明显下降。结论 circRNA BCRC-3在鼻咽癌组织和细胞株中呈低表达,上调circRNA BCRC-3可抑制鼻咽癌HONE-1细胞的增殖和迁移能力,其机制可能是circRNA BCRC-3通过上调DKNIB基因表达,抑制PI3K/AKT信号通路转导。     

长链非编码RNA母系表达基因3在鼻咽癌细胞中的表达及临床意义

目的 探讨长链非编码RNA母系表达基因3(maternally expressed gene3,MEG3)在鼻咽癌细胞中的表达及临床意义.方法 采用qRT-PCR检测鼻咽癌细胞CNE-2、C666-1和TW03中MEG3的含量,用MEG3在鼻咽癌细胞株的敲除和过表达分析其表达,采用CCK-8与Transwell检测鼻咽...     

人类鼻咽癌端粒酶活性的研究及其临床意义

目的　探讨端粒酶在鼻咽癌中的表达及其临床意义。方法　采用TRAP 银染法对 42例鼻咽部低分化鳞状细胞癌、10例鼻咽部正常粘膜和 8例鼻咽纤维血管瘤进行端粒酶活性检测及血清VCA/IgA检测 ,并分析其与临床病理的关系。结果　鼻咽部正常粘膜和鼻咽癌端粒酶阳性率分别为 2 0 %和 88.1% ,8例鼻咽纤维血管瘤均未检测到端粒酶活性。鼻咽癌伴颈部淋巴结转移者端粒酶阳性率高于无颈部淋巴结转移者 (P =0 .0 35 ) ,临床晚期 (III、IV)端粒酶阳性率高于临床早期 (I、II) (P=0 .0 48) ,而端粒酶与鼻咽癌患者的年龄、性别及远处转移均无明显相关性 (P >0 .0 5 )。鼻咽癌患者血清EB病毒VCA/IgA阳性率明显高于鼻咽粘膜正常者 (P <0 .0 0 1)。结论　端粒酶活性表达在鼻咽癌发病机制中起着重要作用。端粒酶活性结合血清EB病毒抗体的检测有利于鼻咽癌的早期诊断。     

鼻咽癌中环氧化酶-2的表达及其与Survivin和Caspase-3的相关性研究

目的探讨环氧化酶-2(COX-2)在低分化鼻咽癌中的表达及其与Survivin和Caspase-3的关系。方法采用免疫组织化学方法对56例低分化鼻咽癌患者肿瘤组织及20例鼻咽黏膜组织的COX-2和Survivin及Caspase-3蛋白表达进行检测。结果鼻咽癌标本中COX-2的表达阳性率为76.8%,鼻咽黏膜表达阳性率为15.0%,两组之间差异有统计学意义(P<0.01)。鼻咽癌中COX-2和Survivin的表达具有相关性(P<0.05),COX-2和Caspase-3的表达无相关性(P>0.05)。结论COX-2在低分化鼻咽癌致病中起着重要作用,其凋亡抑制作用可能通过调控Survivin途径来实现。     

多基因共沉默对鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤影响的研究

目的 应用基因克隆技术构建一个载体同时编码四个不同基因的真核表达质粒,并与单基因质粒作对比,通过裸鼠成瘤实验研究其对体内鼻咽癌细胞CNE-2Z生长增殖的影响.方法 构建同时表达血管内皮生长因子(VEGF)、致癌基因蛋白(c-myc)、存活素(survivin)和端粒酶反转录酶(hTERT)并含荧光素标记的短发夹RNA质粒(命名为P-1),并构建单独表达VEGF、c-myc、survivin 和hTERT的质粒(分别命名为P-2、P-3、P-4和P-5),建立人鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞株裸鼠皮下接种模型,分别将其转染于荷瘤裸鼠瘤体内,以激光共聚焦显微镜观察质粒在瘤体内的转染及表达情况.反转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上检测对目的基因表达的抑制作用,免疫印迹法在蛋白水平上检测对目的基因的封闭效果.脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测各组移植瘤细胞凋亡率.结果 所有裸鼠均接种成功,l周左右可见皮下肿瘤形成,并随时间延长不断增大.各质粒组载体转入瘤体后,共聚焦显微镜下见癌组织中有绿色荧光表达,而空白对照组未见绿色表达荧光.肿瘤体积生长曲线表明,单基因组和多基因组肿瘤生长明显受到抑制,以多基因组肿瘤体积抑制最为明显.肿瘤抑制率在Pl～5组分别为82.4%、46.2%、48.5%、51.9%和46.8%.RT-PCR和免疫印迹法在体内实验证实单基因质粒组主要引起单个基因mRNA和蛋白的表达下降,而多基因质粒组可以同时下调四个不同基因mRNA和蛋白的表达,TUNEL实验表明多基因质粒能更有效地促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤的生长.结论 多基因共沉默对鼻咽癌基因治疗有着潜在的应用前景,同时阻断多个基因可能是恶性肿瘤基因治疗的一个希望所在.     

增强型胸苷激酶基因表达载体的构建及其杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨改良构建人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit promoter,hTERT)启动子及巨细胞病毒原核(cytomegalovirus,CMV)增强子联合调控单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(thymidine kinase,TK)的增强型表达载体在鼻咽癌细胞体内外实验中的靶向杀伤效应及体内应用的安全性评价.方法 以pGL3-basic空载体为模板,分别酶切连接hTERT启动子、CMV增强子及TK基因构建靶向性增强型表达载体pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp-CMV(以hTERT单启动子调控TK基因表达载体作为对照组),转染端粒酶阳性的人鼻咽癌5-8F细胞及用做对照组的人乳腺癌MCF-7细胞和端粒酶阴性的正常人脐静脉内皮细胞ECV-304,分别采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达差异、实时荧光定量PCR检测转染后TK基因mRNA表达差异、TeloChaser法检测上述细胞中的端粒酶活性、四甲基偶氮唑蓝(MTt)联合Boyden小室实验分析增强型载体对鼻咽癌细胞增殖及侵袭抑制的作用.将鼻咽癌细胞接种于裸鼠腋部皮下,构建裸鼠鼻咽癌移植瘤模型,研究增强型载体对裸鼠移植瘤的体内生长抑制作用及对全身的毒副反应情况.结果 ①成功改良构建hTERT/CMV双调控TK基因的增强型表达载体.②转染增强型载体组及单启动子载体组的鼻咽癌5-8F细胞均有绿色荧光表达,但前者荧光数量及强度均较后者强,对照组端粒酶阳性的乳腺癌细胞也有很强的荧光表达,而ECV-304细胞几乎无绿色荧光表达.实时荧光定量PCR结果显示,增强型载体组的TK基因mRNA表达量是单启动子组的2-5倍.③ TeloChaser法结果显示,两种肿瘤细胞(5-8F细胞、MCF-7细胞)端粒酶活性均为阳性,正常对照ECV-304细胞端粒酶活性为阴性.④MTT联合Boyden小室侵袭实验结果显示,增强型表达载体对5-8F细胞体外增殖及侵袭力均有明显抑制作用.相对细胞存活率为37.0%,较对照组明显低(P<0.01).⑤体内实验结果显示,增强型靶向表达载体对裸鼠鼻咽癌移植瘤生长具有明显抑制作用,抑瘤率达56.3%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01),而裸鼠肝肾病理检查未发现明显损害.结论 以hTERT/CMV双调控机制介导TK基因的增强型表达载体能够高效、靶向杀伤鼻咽癌细胞及移植瘤,实验动物体内应用无明显毒副作用.     

槲皮素对人鼻咽癌HEN1细胞系增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

目的:目的:探讨黄酮类化合物槲皮素对人鼻咽癌HEN1细胞系的抑制增殖和诱导凋亡的作用,并对其机制做初步探讨。方法:应用MTT法检测不同浓度槲皮素对人鼻咽癌HEN1细胞的增殖抑制作用;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期分布;比色法测定凋亡相关蛋白caspase-3的表达。结果:槲皮素能明显抑制人鼻咽癌HEN1细胞增殖,存在剂量依赖(r=0.709;P<0.01)与时间依赖(r=0.703;P<0.01);HEN1细胞经不同浓度槲皮素(15、30、60、90、120μmol/L)作用48 h后细胞凋亡率分别为4.81%、9.02%、14.33%、19.65%、28.88%,明显高于对照组(1.70%)(P<0.01);随着槲皮素浓度升高,凋亡细胞和坏死细胞比例增加,将细胞特异性地阻滞在G2/M期,出现凋亡峰;槲皮素组的HEN1细胞凋亡相关因子caspase-3表达明显高于对照组(P<0.05)。结论:槲皮素能通过caspase-3途径抑制人鼻咽癌HEN1细胞增殖,诱导细胞凋亡,并具有细胞周期特异性。