树突状细胞在体外诱导FBL-3细胞分化为单核细胞的研究

目的 探讨树突状细胞(DC)对白血病细胞的诱导分化作用机制.方法 应用不同浓度的DC培养上清作用于小鼠红白血病细胞(FBL-3细胞),作用72 h后用瑞氏染色观察分化后细胞的大体形态,透射电镜观察分化后细胞的超微结构,流式细胞术观察分化后细胞表面分子CD14的表达情况.结果 瑞氏染色、透射电镜、流式细胞术结果均显示,DC培养上清能诱导白血病细胞分化为单核细胞,其作用强度与DC培养上清中IL-12浓度呈正相关.结论 DC培养上清可诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞,分化后的细胞在大体形态、超微结构、细胞表型分子标志方面符合单核细胞的特点.且DC培养上清诱导FBL-3细胞分化成为单核样细胞的能力与培养上清中IL-12的浓度呈正相关.     

小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞对特异性CTL的体内外诱导作用

目的 探讨白细胞介素-12(IL-12)诱导小鼠红白血病细胞产生的树突状细胞,对白血病特异性CTL细胞的诱导作用,及体内免疫后对抗肿瘤免疫应答的诱导效果.方法:采用4/小时~(51)Cr释放法,检测CTL杀伤活性;观察小鼠红白血病细胞来源的树突状细胞体内免疫冶疗后对肿瘤的抑制作用,采用了HE染色和电镜等技术,分析肿瘤组织的病理学变化.结果:IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC,在体外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL.采用IL-12诱导FBL-3细胞产生的DC免疫C57 BL/6小鼠.体内诱导出的CTL杀伤活性明显高于对照组.实验组小鼠能够有效的抵抗野生型FBL-3细胞的再攻击;肿瘤生长受到明显的抑制,组织学观察显示,肿瘤局部有较多炎性细胞浸润和细胞坏死;透射电镜可观察到典型的凋亡征象,结论:IL-12诱导小鼠FBL-3红白血病细胞产生的树突状细胞,在体内外可诱导出FBL-3细胞特异性的CTL,体内免疫后可增强抗肿瘤免疫应答,该结果为白血病的免疫治疗提供了新的途径.     

GM-CSF诱导红白血病细胞向树突状细胞分化的研究

树突状细胞(DC)是免疫系统中一类重要的抗原提呈细胞(APC),抗原提呈功能最强,其特点是能激发静息的T细胞产生免疫应答.在树突状细胞的发育过程中,粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),具有关键作用.近来文献报道,GM-CSF与IL-4或TNF联合应用,可使外周血中的CD14阳性单核细胞分化为树突状细胞.提示树突状细胞可来源于单核细胞.目前,关于诱导肿瘤细胞分化为树突状细胞的研究,尚未见文献报道.我们曾初步观察到GM-CSF处理后的FBL-3细胞,单核细胞的特异性标志CD14表达水平显著增加,NBT还原能力增强,提示GM-CSF可诱导小鼠FBL-3红白血病细胞分化为单核细胞.     

人急性早幼粒细胞性白血病细胞诱导分化生成树突状细胞的体外研究

树突状细胞(dendritic cells,DC)在激发机体抗白血病T细胞免疫应答中具有重要作用,有报道DC可以由单核细胞及粒细胞分化生成,本研究应用细胞因子在体外诱导了急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞向DC的分化.从M3型APL患者外周血分离白血病细胞,加入GM-CSF(100ng/ml)或GM-CSF(100ng/ml) rhIL-4(500U/ml)体外培养14天,并于培养结束前3天加人TN-α(100ng/ml).结果表明,GM-CSF可以促进白血病细胞体外增殖,并从幼稚状态逐渐分化成熟,表达高水平的CD45分子,其中部分为CD14~ 的单核细胞,部分为CDla~ 的DC(M3DC);培养后期加入TNF-α,可以促进DC生成,约占35%;以GM-CSF IL-4培养也诱导了幼稚细胞的成熟,2周后DC约占10%,但较少单核细胞生成,培养至3周时DC约占60%;而在培养后第11天加入TNF-α则可以加速DC生成,3天后生成的白血病型DC达90%.电镜观察到M3DC具有与单核细胞来源的DC相似的超微结构,但具有的突出特征是部分细胞存在少量胞浆颗粒;M3DC高表达HLA-DR、B7-2、CD40、CD54分子,体外可以强烈刺激同种T细胞增殖.此类由白血病细胞诱导生成的DC可被用于体内外诱导生成肿瘤特异性CTL,在APL的免疫治疗中具有一定的应用价值.     

细胞因子联合人参皂甙及三氧化二砷诱导HL-60细胞向树突状细胞分化的实验研究

目的研究HL-60细胞在体外经细胞因子联合人参皂甙及三氧化二砷(AS2O3)诱导向树突状细胞(DC)分化的情况。方法选用HL-60细胞与重组人粒单核细胞集落刺激因子(rh-GM-CSF)、白细胞介素4(IL-4)、γ干扰素(INF-γ)、TSPG及AS2O3共培养。根据细胞因子、TSPG及AS2O3不同组合分为12组。在培养后7天及14天以光学和电子显微镜观察细胞的形态学特征，用HLA-DR、CD1a、CD86等五种单克隆抗体标记流式细胞术检测细胞表型，用ELISA法测定HL-60-DC培养上清液中的IL-12及INF-γ的量，培养14天后的细胞再继续以1：10的比例与HL-60细胞共培养24h，观察HL-60-DC对白血病细胞的杀伤情况，用流式细胞仪检测凋亡率。结果HL-60细胞在组合细胞因子并分别加入TSPG及AS2O3后，均可诱生出不同比例的DC。光镜及电镜下均有典型的树突状细胞的形态学特征，细胞表达DC的表面分化抗原，诱生的DC培养上清中可测出不同量的IL-12及INF-γ。细胞凋亡率均明显高于对照组，联合中药各组的凋亡率均高于GM-CSF与IL-4组。结论①GM—CSF、IL-4与HL-60细胞共培养可诱导出HL-60-DC，在此基础上加入适当浓度的TSPG、AS2O3可使树突状细胞的特异性抗原表达加强。②在DC诱生过程中，GM—CSF联合IL-4组DC特异性抗原表达率高于IL-4联合INF组，证明GM—CSF在DC诱生过程中起重要作用。③单独应用TSPG，也可出现部分DC特异性抗原表达，但表达率明显低于联合用药组。④诱生后的HL-60-DC具有自分泌IL—12及INF-γ的功能。⑤诱生后的DC具有抗白血病细胞作用，与HL-60细胞共培养后可使白血病细胞凋亡明显增强。     

脐血来源树突状细胞体外诱导抗卵巢癌免疫特异性

[目的]研究脐血来源树突状细胞(DC)体外诱导特异性抗卵巢癌细胞的免疫效应.[方法]①从脐血中分离单个核细胞(MNCs)后,获得单核细胞(Mo).粒单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化,培养7天后应用流式细胞仪进行细胞表型分析.②诱导单核细胞分化的第3天加入人卵巢癌细胞株3AO的冻融抗原,共培养4天后获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从脐血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3天,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测CTL及上清对人卵巢癌细胞株3AO、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用.[结果]①脐血来源单核细胞(Mo)在GM-CSF和IL-4作用下,7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、HLA-DR、CD83.②DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生.不同浓度CTL及上清对卵巢癌细胞3AO有特异性杀伤、抑制作用(P＜0.05).[结论]脐血中单核细胞可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤卵巢癌细胞的免疫效应.     

急性髓细胞性白血病细胞培养上清对树突细胞分化、成熟、凋亡及功能的影响

背景与目的:树突细胞(dendritic cell,DC)存机体抗瘤免疫中起重要作用.研究已表明肿瘤患者和荷瘤动物体内DC功能受损并伴有DC数量的降低.最近的研究提示这种DC功能的受损可能是肿瘤细胞分泌的可溶性因子介导的免疫抑制所致.本研究拟观察急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分泌的可溶性因子对单核细胞来源DC的分化、成熟、凋亡及其功能的影响.方法:原代AML细胞培养24 h后收集上清.在含有或不含有AML细胞培养上清的培养液中,利用IL-4和GM-CSF刺激单核细胞分化成不成熟DC(immature DC,iDC),IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE-2促进DC成熟.流式细胞仪检测DC表型和凋亡率的变化.计算前体细胞频率(precursorfrequency,PF),观察DC对异基因CD4 T细胞和CD8 T细胞的刺激功能.结果:AML细胞培养上清可显著抑制DC表面协同刺激分子CD80和CD86的表达,并可降低促成熟细胞因子对DC的促成熟作用.同时,与对照组相比,AML细胞培养上清可显著诱导DC的凋亡,凋亡率分别为(15.1±4.2)%和(29.4±9.5)%(P＜0.01).相对于正常成熟DC,AML细胞培养上清诱生的DC对异基因CD4 T细胞和CD8 T细胞的刺激功能显著降低(P＜0.01),其中CD4 T细胞的前体细胞频率分别为(5.2±1.6)%和(1.8±0.5)%,CD8 T细胞的前体细胞频率分别为(6.5±2.0)%和(2.1±0.6)%.结论:AML细胞分泌的可溶性因子可抑制DC的发育和功能.     

IL-6基因转染的白血病细胞不同条件下体内外分泌IL-6水平的研究

我们将IL-6基因转染至FBL-3红白血病细胞,建立了高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞克隆株,并观察了不同照射剂量下其体外生长情况,IL-6分泌水平及不同途径接种人体内后血清和注射局部细胞培养上清中IL-6含量。将IL-6基因转染的FBL-3-IL-6~ 细胞调成1×10~5/ml浓度,分放于瓶中,置钴~(60)下分别照射不同剂量后,置5％CO_2中培养,观察其生长情况和半数死亡时间和全部死亡时间,并每日收集上清冻存待测IL-6。另外将高分泌IL-6的FBL-3-IL-6~ 细胞以2×10~5浓度分别通过腹腔和左股部皮下注入小鼠体内,并于不同时间取小鼠血清测IL-6含量(同时没对照组)。结果表明,当体外照射剂量<500Rad时,不能有效地控制白血病细胞的增殖能力,且于半个月中能保持较高水平的IL-6分泌量。所以当制备灭活的瘤苗时,以选用800Rad的钴~(60)照     

抑瘤素M基因转染的白血病细胞免疫学特性的观察

抑瘤素M(OSM)是近年来新发现的主要由激活的T细胞、单核细胞产生的细胞因子.对多种实体肿瘤细胞的生长有抑制作用,并能诱导髓系白血病细胞的分化.本文以鼠红白血病细胞系FBL-3为对象,研究重组OSM与FBL-3细胞共育以及携带OSM基因的重组腺病毒(Ad-OSM)转染FBL-3细胞后,其免疫学特性的变化,以期为OSM及其基因治疗在抗肿瘤中应用提供实验依据.     

mda-7/IL-24和IL-24 delE5诱导急性髓系白血病细胞向单核细胞分化

目的:研究人黑素瘤分化相关基因-7(melanoma differentiation associated gene-7,mda-7;又称IL-24)及其剪接体IL-24 delE5与急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞分化的关系。方法:十四烷酰佛波醇-乙酯(12-O-tetrade-canoylphorbol-13-acetate,TPA)处理人急性髓系白血病细胞系U937、HL-60,real-time PCR及Western blotting检测细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达,FACS检测细胞表面CD11b、CD14和CD115的表达。siRNA干扰U937、HL-60细胞中mda-7/IL-24和IL-24 delE5的表达后,再以TPA诱导细胞分化,FACS检测CD11b、CD14和CD115的表达。用前期构建的mda-7/IL-24和IL-24 delE5载体转染U937、HL-60及AML-M5患者的原代白血病细胞,观察异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5能否诱导白血病细胞向单核细胞分化。结果:TPA在诱导U937、HL-60细胞向单核细胞分化过程中显著促进mda-7/IL-24及其剪接体IL-24 delE5的表达,用siRNA干扰mda-7/IL-24及IL-24 delE5的表达后,TPA诱导U937、HL-60细胞向单核细胞分化的作用也被阻断。异位过表达mda-7/IL-24和IL-24 delE5可诱导U937、HL-60以及原代AML细胞向单核细胞分化:U937、HL-60细胞表面CD11b和CD14表达均显著升高,CD115表达仅在U937细胞有显著升高;3例AML-M5患者的原代AML细胞中CD11b、CD14及CD115表达均有不同程度升高,细胞呈现单核细胞的形态特征。结论:TPA可通过上调mda-7/IL-24及其剪接体IL-24 delE5的表达诱导白血病细胞向单核细胞分化。     

致敏树突细胞治疗膀胱肿瘤血液细胞毒性T淋巴细胞的变化

目的观察致敏的树突细胞（DC）治疗膀胱肿瘤（BT）后血液细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的变化并探讨其机制。方法选取F344大鼠44只，称重后随机分为4组；均采用膀胱灌注N-甲基亚硝基脲（MNU）制成BT；第11周4组分别经皮下注射磷酸缓冲液（PBS）、未致敏DC、肿瘤抗原及致敏DC，每周1次，共4次；实验第15周，经显微镜和流式细胞仪（FCM）检测。结果致敏DC组膀胱重量比其他三组轻（P〈0．05）。致敏DC组BT病理分期低于PBS组和未致敏DC组（P〈0．05）；CD3^＋ T细胞在致敏DC组低于其余三组（P〈0．05）；CTL在致敏DC组高于其余三组（P〈0．001）。结论应用致敏DC经皮下注射治疗大鼠BT可降低肿瘤的病理分期，未致敏DC皮下注射对膀胱肿瘤治疗无效，肿瘤抗原皮下注射对膀胱肿瘤治疗效果欠佳。致敏DC可通过呈递抗原来激活CTL增生而发挥其免疫杀伤作用。     

Immunological characteristics of the leukemia cells transfected with oncostatin M gene by recombinant adenovieus

In the present study, FBL-3 murine erythroleukemia cells were transacted with human OSM(hOSM) gene by recombinant adenovirus, then the immunological properties of hOSM gene-transfected FBL-3 cells(FBL-3-OSM⁺) were investigated. 4 hours after transfection with hOSM gene, hOSM could be detected in the supernatant of FBL-3-OSM⁺ cells and hOSM secretion peaked at 24 h. The proliferation of FBL-3-OSM⁺ cells was inhibited markedly. The clonal formation of FBL-3-OSM⁺ cells was suppressed more obviously in comparison with wild-type FBL-3 cells when analysed in clonal argar culture. Flow cytometry analysis showed that FBL-3-OSM⁺ cells expressed higher levels of Fas protein, B7 and ICAM-1 molecuIes.FBL-3-OSM⁺ cells also expressed higher level of MHC class I molecules(H-2K^b) but remained unchanged in expression of MHC class II molecules (la). CD14, which is a specific marker of monocyte/macrophage and not expressed on the wild-type FBL-3 cells, was also detected on the surface of FBL-3-OSM⁺ cells. The results suggested that OSM gene transfer could increase the immunogenicity of FBL-3 cells and promote their differentiation into macrophage-like cells. The data outline a promising approach to OSM gene therapy of leukemia mediated by recombinant adenovirus. This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 39421009).     

PATHOLOGICAL STUDIES ON THE ANTI－INVASIVE CHARACTER BY RECOMBINANT HUMAN INTERLEUKIN－6 GENE－TRANSFECTED MOUSE LEUKEMIA CELLS

ＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡＬＳＴＵＤＩＥＳＯＮＴＨＥＡＮＴＩ－ＩＮＶＡＳＩＶＥＣＨＡＲＡＣＴＥＲＢＹＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴＨＵＭＡＮＩＮＴＥＲＬＥＵＫＩＮ－６ＧＥＮＥ－ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＥＤＭＯＵＳＥＬＥＵＫＥＭＩＡＣＥＬＬＳＧｅＬｉｎｆｕ葛林阜，Ｃａｏ...     

小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性

 目的　探讨小鼠红白血病细胞FBL-3的生物学特性。方法　观察小鼠红白血病FBL-3细胞光镜下的形态、生长曲线、体外克隆形成率及细胞免疫组织化学染色情况;流式细胞术分析细胞周期分布以及MHC分子的表达情况;常规细胞遗传学方法分析染色体核型,PCR检测性别基因Sry;MTT法分析化疗药物敏感性;经尾静脉接种后观察C57BL／6小鼠肝、脾、肺、肾的病理变化。结果　FBL-3细胞呈梭形或多角形贴壁生长;细胞群体倍增时间为24.12 h。14 d和21 d克隆形成率分别为（35.23±1.44）%和（60.27±5.56）%。糖原染色阳性、氯醋酸染色部分阳性,过氧化物酶、碱性磷酸酶、丁酸染色均阴性。细胞周期：G0／G1细胞占（50.9±2.5）%,S期细胞占（36.3±1.4）％、G2／M期细胞占（13.8±0.8）％。对化疗药物阿糖胞苷、长春地辛、顺铂、丝裂霉素、甲氨蝶呤的半数抑制浓度分别为（0.49±0.04）、（0.87±0.09）、（3.77±0.32）、（1.66±0.16）μmol／L和（2.77±0.24）nmol／L。FBL-3细胞染色体数目在34～41条之间,表达H-2b分子,Sry基因阳性。静脉接种小鼠100 %发病;接种的细胞数量与存活时间呈线性关系;白血病细胞可以浸润肝、肺、脾和肾。结论　FBL-3细胞具有白血病细胞的特性,体外易于培养,容易建立小鼠模型,可作为研究白血病的理想动物模型。     

淋巴瘤细胞EL-4培养上清液对CD4＋CD25＋调节性T细胞比例的调节作用

目的探讨肿瘤细胞是否能上调CD4＋CD25＋调节性T细胞（Treg细胞）的比例。方法将小鼠淋巴瘤细胞株EL4培养上清液与正常小鼠脾脏淋巴细胞混合培养72h,流式细胞仪检测其中CD4＋CD25＋Treg细胞含量,RT—PCR检测Foxp3mRNA的表达,实验重复3次。结果和EL-4培养上清液混合培养的正常小鼠脾脏淋巴细胞中CD4＋CD25＋Treg细胞的比例高于对照组（P〈0．05）,在CD3单抗刺激的同时加入EL-4培养上清液后,小鼠脾脏中CD4＋CD25＋Treg细胞仍呈同步增加（P〈0．05）;且Foxp3mRNA的表达增加。结论淋巴瘤细胞分泌的免疫调节因子能诱导CD4＋CD25＋Treg细胞的增生,提示肿瘤可以上调CD4＋CD25＋Treg细胞比例。     

树突状细胞靶向捕获乳腺癌细胞后诱发的细胞免疫应答

目的 观察树突状细胞(DC)联合曲妥单抗负载人类表皮生长因子受体2(Her-2+)凋亡乳腺癌细胞抗原后,诱发免疫效应细胞产生的特异性抗乳腺癌免疫应答.方法 用GM-CSF、IL-4和TNFα受体从人外周血单个核细胞中诱导DC,将DC与包被曲妥单抗的凋亡SKBr3细胞共培养,7 d后获得成熟DC,用成熟DC联合CD3单抗和IL-2等细胞因子诱导杀伤细胞(DC-CIK).在倒置相差显微镜和透射电子显微镜下观察DC形态和超微结构变化,用流式细胞术检测DC表达CD14、CD1a、CD64、CD80、CD83、CD86、人类白细胞抗原ABC(HLA-ABC)和HLA-DR的情况.用酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测释放抗原特异性γ受体(IFNγ)的T细胞数.以二甲基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测DC-CIK的细胞毒活性.结果 在曲妥单抗包被的SKBr3凋亡细胞中加入DC(DC2组),5 min即可看到DC特异性结合在SKBr3细胞周围;48 h后,透射电镜下可见DC的胞浆中有多个被膜包裹着的凋亡靶细胞器,靶细胞器呈降解状态,而未加曲妥单抗组(DC0组)DC中这种降解细胞器相对较少.DC0、DC1和DC2组60.0%以上的DC均表达IgG的高亲和力受体(FcγRI或CD64),联合曲妥单抗组DC表达CD14较低,高表达HLA-DR和HLA-ABC,CD1a、CD80、CD83和CD86表达明显高于未成熟DC组(P＜0.05),ELISPOT检测证实,联合曲妥单抗组中的抗原特异性T细胞斑点数明显高于DC0组(P＜0.05).负载SKBr3细胞抗原的DC-CIK细胞对SKBr3的杀伤活性是CIK细胞的1.7倍.结论 DC联合曲妥单抗捕获SKBr3细胞抗原后,可明显提高DC-CIK细胞对SKBr3的细胞毒活性,有利于进一步探讨人源化抗体、DC疫苗和免疫效应细胞等免疫治疗手段的联合应用.     

结肠癌细胞中Ese-3对树突状细胞分化成熟的影响

目的:利用体外共培养实验,观察结肠癌细胞SW480中上皮特异性转录因子Ese-3表达水平的改变对树突状细胞（dendritic cell,DC）分化成熟的影响。方法:利用慢病毒系统获得过表达Ese-3的结肠癌细胞SW480（SW480 Ese-3）及其对照细胞株（SW480 NC）。利用磁珠分选方式,从人外周血单个核细胞（PBMC）中获得CD14+细胞,经rhGM-CSF、rhIL-4刺激获得不成熟的DC（iDC）。通过Transwell小室将SW480 Ese-3和SW480 NC细胞分别与iDC进行间接共培养。流式细胞术检测共培养后的DC细胞中HLA-DR、CD14、CD83、CD86 的表达。ELISA检测细胞培养上清中IL-12p70的水平。结果:SW480 Ese-3/DC共培养组DC细胞表面标志物HLA-DR、CD83、CD86水平,较SW480 NC/DC共培养组升高,CD14水平降低;SW480 Ese-3/DC共培养组上清中IL-12p70水平较对照组升高。结论:在体外共培养实验中,SW480细胞过表达Ese-3可促进DC细胞分化成熟。     

冻融肿瘤细胞和肿瘤细胞培养上清对淋巴细胞活化能力的影响

 目的　比较冻融肿瘤细胞和肿瘤细胞培养上清对淋巴细胞活化能力影响的差异。方法　常规冻融法制备恶性黑色素瘤B16细胞全肿瘤细胞抗原,收集培养不同时间的肿瘤细胞培养上清;利用Transwell法检测冻融肿瘤细胞以及肿瘤细胞培养上清对淋巴细胞的趋化能力;用CCK-8法检测各组趋化淋巴细胞的肿瘤杀伤活性。结果　冻融肿瘤细胞及培养2 h以上的肿瘤上清液对淋巴细胞均有趋化作用;培养4 h以上的肿瘤上清液的趋化能力明显强于冻融瘤细胞。各组趋化的淋巴细胞均具有肿瘤杀伤活性;培养4 h以上的肿瘤上清液组淋巴细胞的杀伤能力明显强于冻融肿瘤细胞组。在一定范围内,培养上清对淋巴细胞的趋化和活化能力随时间延长而增强。结论　培养一定时间的肿瘤上清液对淋巴细胞的趋化和活化能力均强于冻融肿瘤细胞,用培养上清液代替冻融肿瘤细胞抗原作为抗原活化淋巴细胞可获得更好的免疫效果。